趙英政， 郭萍， 石超凡， 易憲文， 徐光翠

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453003)

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高脂飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素對(duì)小鼠糖脂代謝及炎癥的影響

趙英政， 郭萍， 石超凡， 易憲文， 徐光翠*

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453003)

觀察高脂飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素(STZ)對(duì)小鼠糖脂代謝及胰島功能損傷的影響。將體質(zhì)量為18～20 g的SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠40只，隨機(jī)分為對(duì)照組和模型組，每組20只。對(duì)照組小鼠飼喂對(duì)照飼料，模型組小鼠飼喂高脂飼料。1周后，禁食16 h，測(cè)量小鼠體質(zhì)量與空腹血糖；尾靜脈采血，分離血清；每周1次，連續(xù)4周。4周后，對(duì)照組小鼠腹腔注射檸檬酸緩沖液，模型組小鼠腹腔注射STZ，劑量為40 mg·kg-1，每天1次，連續(xù)3 d。繼續(xù)飼養(yǎng)2周后，測(cè)量隨機(jī)血糖，以小鼠血糖≥16.7 mmol·L-1者即判定為2型糖尿病。對(duì)照組及2型糖尿病小鼠經(jīng)腹腔注射葡萄糖以進(jìn)行糖耐量試驗(yàn)。與對(duì)照組同一時(shí)間的體質(zhì)量和血糖進(jìn)行比較，模型組小鼠體質(zhì)量、血糖均升高，除第1周血糖外，差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。采用重復(fù)測(cè)量方差分析，發(fā)現(xiàn)喂養(yǎng)時(shí)間對(duì)體質(zhì)量(F=200.831)和血糖(F=7.025)均有影響，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；不同喂養(yǎng)時(shí)間對(duì)低密度脂蛋白(F=30.793)、甘油三酯(F=34.027)和高密度脂蛋白(F=30.793)均有影響，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。不同飼料喂養(yǎng)與不同喂養(yǎng)時(shí)間對(duì)體質(zhì)量和甘油三酯存在交互作用(P<0.05)。比較糖耐量曲線發(fā)現(xiàn)，成模小鼠較對(duì)照組小鼠糖耐量降低。采用ELISA試劑盒檢測(cè)小鼠血清中TNF-α含量，成模小鼠的TNF-α含量高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。高脂飲食可導(dǎo)致C57BL/6J小鼠糖脂代謝紊亂，給予STZ后引起了小鼠糖耐量降低及炎癥損傷，高脂飲食聯(lián)合STZ可提高小鼠2型糖尿病模型的成模率。

高脂飲食；2型糖尿??；糖耐量曲線

隨著我國(guó)社會(huì)經(jīng)濟(jì)水平的提高，人們的生活方式及飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生了極大的變化。高糖、高膽固醇飲食已成為動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病、糖尿病等慢性疾病的潛在致病因素(Flynnetal.，2006; Lobstein，2006)。據(jù)報(bào)道我國(guó)2型糖尿病發(fā)病率逐年增加，目前糖尿病患病率高達(dá)9.7%，前期糖尿病患病率約15.5%，患病人群以2型糖尿病為主，比例達(dá)90%以上(燕娟等，2009)。高脂飲食可誘發(fā)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，而炎癥與2 型糖尿病發(fā)生密切相關(guān)。

迄今為止，已建立了多種高膽固醇或高脂誘導(dǎo)的胰島素抵抗的動(dòng)物模型，但物種選擇、高脂配方、喂養(yǎng)時(shí)間等因素仍需進(jìn)一步探索。C57BL/6J小鼠被認(rèn)為是“標(biāo)準(zhǔn)”的近交系動(dòng)物，為許多突變基因提供遺傳背景，同時(shí)對(duì)高脂誘導(dǎo)的肥胖敏感(van der Heijdenetal.，2015)。本研究通過(guò)給予C57BL/6J小鼠高脂飲食，監(jiān)測(cè)高脂飲食過(guò)程中小鼠體質(zhì)量、糖脂代謝指標(biāo)和炎癥狀態(tài)，旨在明確高脂飲食及注射鏈脲佐菌素(Streptozotocin, STZ)對(duì)C57BL/6J小鼠糖脂代謝及系統(tǒng)炎癥的影響，為2型糖尿病的預(yù)防、疾病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的影響因素及機(jī)制的探究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑和器材 STZ(Sigma)；甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、總膽固醇(TCHO)等生化檢測(cè)試劑盒(北京，北化康泰)；TNF-α、IL-1β ELISA試劑盒(武漢，博士德)；60%的高脂純化飼料及10%的對(duì)照純化飼料(江蘇，特洛菲)；電子血糖儀(美國(guó)，強(qiáng)生)；低溫離心機(jī)(德國(guó)，eppendorf)；酶標(biāo)儀(美國(guó)，Thermo)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠40只，體質(zhì)量18～20 g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(京)2012-0001，使用許可證號(hào):SYXK(豫)2014-0005]，于IVC動(dòng)物房飼養(yǎng)，明暗周期12 h/12 h；相對(duì)濕度60%～70%。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及處理 適應(yīng)7 d后，將40只C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和模型組，每組20只。對(duì)照組小鼠飼喂10%的對(duì)照純化飼料，模型組小鼠飼喂60%的高脂純化飼料。自由攝食、飲水，每天定時(shí)更換飼料，觀察小鼠狀態(tài)。1周后，禁食16 h，測(cè)量小鼠體質(zhì)量；經(jīng)尾靜脈采血后，分離血清并置于-20 ℃冰箱保存，每周1次，連續(xù)4周。4周后，對(duì)照組腹腔注射檸檬酸緩沖液，模型組腹腔注射STZ，劑量為40 mg·kg-1，每天1次，連續(xù)3 d。繼續(xù)飼養(yǎng)2周后，測(cè)量隨機(jī)血糖，以血糖值≥16.7 mmol·L-1者為2型糖尿病小鼠。對(duì)照組及模型組成模小鼠分別通過(guò)腹腔注射葡萄糖以進(jìn)行糖耐量試驗(yàn)，葡萄糖濃度為10%，注射容積為0.2 mL·10 g-1，分別測(cè)定和記錄30 min、60 min、90 min、120 min、240 min時(shí)的血糖值。最后，經(jīng)股動(dòng)脈采血后，處死小鼠，分離血清。

1.2.2 指標(biāo)測(cè)定 采用電子血糖儀測(cè)血糖。嚴(yán)格按照試劑盒的說(shuō)明書檢測(cè)血清中甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白等含量；嚴(yán)格按照ELISA試劑盒方法檢測(cè)血清中的TNF-α、IL-1β。

2 結(jié)果

2.1 高脂飼料喂養(yǎng)對(duì)C57BL/6J小鼠體質(zhì)量及血糖值的影響

與同一時(shí)間對(duì)照組比較，除第1周空腹血糖及第6周體質(zhì)量外，模型組體質(zhì)量、空腹血糖均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。對(duì)前4周數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量方差分析，發(fā)現(xiàn)喂養(yǎng)時(shí)間對(duì)體質(zhì)量(F=200.831)和空腹血糖(F=7.025)的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，即高脂飼料及喂養(yǎng)時(shí)間導(dǎo)致了小鼠體質(zhì)量、空腹血糖的增加。不同喂養(yǎng)時(shí)間與不同飼料對(duì)體質(zhì)量的影響存在交互作用(F=7.951,P<0.05)。未發(fā)現(xiàn)不同飼料喂養(yǎng)與不同喂養(yǎng)時(shí)間對(duì)空腹血糖存在交互作用(F=1.449)。在第6周STZ注射后模型組體質(zhì)量降低，但與注射前的體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.386)，空腹血糖升高(t=8.177，P<0.05)(表1)。

2.2 高脂飼料喂養(yǎng)對(duì)C57BL/6J小鼠血脂的影響

與同一時(shí)間對(duì)照組比較，除第1周低密度脂蛋白外，模型組血脂各項(xiàng)指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。小鼠連續(xù)攝入高脂飼料4周，對(duì)前4周數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量方差分析，發(fā)現(xiàn)喂養(yǎng)時(shí)間對(duì)低密度脂蛋白(F=30.793)、甘油三酯(F=34.027)和高密度脂蛋白(F=30.793)的影響均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，

時(shí)間體質(zhì)量/g對(duì)照組模型組空腹血糖/(mmol·L-1)對(duì)照組模型組第1周20.39±1.1323.53±1.72*4.17±0.964.55±1.18第2周20.03±0.8924.34±2.18*3.90±0.526.76±3.75*第3周21.84±1.6925.49±2.44*4.16±1.245.67±2.15*第4周24.18±1.8929.80±3.08*5.06±0.967.81±2.06*第5周25.95±1.9030.46±3.51*4.75±1.0612.86±3.65*第6周28.23±3.5128.62±2.845.46±0.7214.90±4.10*

注:*與同一時(shí)間對(duì)照組比較，P<0.05; 喂養(yǎng)時(shí)間對(duì)體質(zhì)量(F=200.831，P<0.05)和空腹血糖(F=7.025，P<0.05)的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義, 不同喂養(yǎng)時(shí)間與不同飼料對(duì)體質(zhì)量的影響存在交互作用(F=7.951,P<0.05); 在第6周STZ注射后模型組空腹血糖值升高(t=8.177，P<0.05)。

Notes:*compared with the control group at the same time,P<0.05; Feeding time had an effect on body weights (F=200.831,P<0.05) and fasting blood glucose (F=7.025,P<0.05); There was an interaction between different feeding time and different diets on body weights (F=7.951,P<0.05); Fasting blood glucose increased after STZ injection at 6th week (t=8.177,P<0.05).

即高脂飼料及喂養(yǎng)時(shí)間導(dǎo)致了小鼠低密度脂蛋白、甘油三酯和和高密度脂蛋白的增加。不同飼料喂養(yǎng)與不同喂養(yǎng)時(shí)間對(duì)甘油三酯的影響存在交互作用(F=7.828，P<0.05)。未發(fā)現(xiàn)不同飼料喂養(yǎng)與不同喂養(yǎng)時(shí)間對(duì)低密度脂蛋白和高密度脂蛋白存在交互作用。未發(fā)現(xiàn)注射STZ前后血脂各項(xiàng)指標(biāo)的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

2.3 葡萄糖耐量試驗(yàn)

注射STZ 2周后，對(duì)20只C57BL/6J小鼠進(jìn)行隨機(jī)血糖的測(cè)定，以血糖值≥16.7 mmol·L-1者為2型糖尿病小鼠。有15只成模，成模率為75%。且隨著體質(zhì)量的增加，糖尿病小鼠成模率提高(表3)。注射STZ 2周后，對(duì)照組與模型組小鼠分別經(jīng)腹腔注射葡萄糖的240 min的糖耐量曲線比較見(jiàn)圖1。

2.4 2組動(dòng)物血清中炎性因子水平的比較

在注射STZ 2周后模型組小鼠血清中TNF-α含量大于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而IL-1β差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。

表2 高脂飼料喂養(yǎng)對(duì)C57BL/6J小鼠血脂的影響

表3 模型組C57BL/6J小鼠不同體質(zhì)量對(duì)2型糖尿病模型成模率的影響

圖1 2組小鼠糖耐量曲線比較

3 討論

以對(duì)胰島素敏感性和反應(yīng)性降低為特征的胰島素抵抗是2型糖尿病發(fā)病的重要環(huán)節(jié)和基本特征。許多研究表明，高熱量飼料喂養(yǎng)和STZ注射是形成2型糖尿病模型的2個(gè)重要條件(杜娟等，2001；周敏，柴可夫，2001)。單純喂養(yǎng)高熱量飼料，僅能增加動(dòng)物體質(zhì)量及脂肪組織質(zhì)量，但糖耐量正常；而一次大劑量注射STZ，則易導(dǎo)致動(dòng)物死亡。本研究在對(duì)大鼠等動(dòng)物造模的經(jīng)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用高脂飼料飼喂C57BL/6J小鼠誘導(dǎo)胰島素抵抗，然后分次小劑量注射STZ，造成胰島輕度損傷，胰島β細(xì)胞對(duì)糖反應(yīng)性下降，從而出現(xiàn)空腹血糖升高及脂質(zhì)代謝紊亂等一系列糖尿病的表現(xiàn)。

圖2 2組小鼠血清中炎性因子水平的比較

Fig. 2 Comparison of serum inflammatory factors levels in two mice groups

*與對(duì)照組比較,P<0.05。

*compared with the control group,P<0.05.

研究結(jié)果顯示攝入高脂飼料的小鼠體質(zhì)量、空腹血糖均明顯大于對(duì)照組(P<0.05)，這是由于攝入的過(guò)多熱能而引起體質(zhì)量升高、脂肪堆積，以及高脂飲食可誘發(fā)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，從而產(chǎn)生胰島素抵抗，靶組織對(duì)胰島素的敏感性和(或)反應(yīng)性降低(Dandonaetal.，2005;鄭素玲等，2010)。對(duì)于體質(zhì)量和空腹血糖，不同喂養(yǎng)時(shí)間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明高脂飼料及喂養(yǎng)時(shí)間導(dǎo)致了小鼠體質(zhì)量、空腹血糖的增加。不同喂養(yǎng)時(shí)間與不同飼料對(duì)體質(zhì)量的影響存在交互作用。飲食與環(huán)境等因子通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫狀態(tài)，引起促炎細(xì)胞因子水平升高，使機(jī)體處于慢性炎癥狀態(tài)，本研究結(jié)果也顯示模型組小鼠炎性因子TNF-α升高。

糖耐量試驗(yàn)結(jié)果顯示，小鼠空腹一次性腹腔注射葡萄糖，小鼠的血糖在短時(shí)間內(nèi)迅速升高，于30～60 min達(dá)到最高濃度，對(duì)照組180 min后降至空腹水平；而模型組小鼠由于胰島素抵抗及胰島功能受損，外周血糖不能及時(shí)降至正常水平，但在240 min后血糖水平仍然可以恢復(fù)至空腹水平，表明小鼠胰島細(xì)胞未完全受損，為2型糖尿病模型而非1型糖尿病模型。在第6周STZ注射后模型組體質(zhì)量未見(jiàn)增加，而血糖升高，也表明了STZ注射后引發(fā)了小鼠糖尿病的癥狀和表現(xiàn)。并且隨著小鼠體質(zhì)量的增加，2型糖尿病的成模率提高。

本研究通過(guò)高脂飲食誘導(dǎo)易發(fā)肥胖的C57BL/6J小鼠系統(tǒng)炎癥及胰島素抵抗，再分次注射小劑量STZ，成功復(fù)制了小鼠2型糖尿病模型，其過(guò)程模擬了人類2型糖尿病的發(fā)病過(guò)程(楊架林等，2003；趙維剛，朱惠娟，2010)。

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Effect of High-fat Diet and Streptozotocin on the Glucose Lipid Metabolism and the Inflammatory in Mice

ZHAO Yingzheng, GUO Ping, SHI Chaofan, YI Xianwen, XU Guangcui*

(Department of Public Health, Xinxiang Medical University, Xinxiang, Henan Province 453003, China)

To investigate the effect of high-fat diet combined with streptozotocin (STZ) on the injury glycolipid metabolism and inflammatory in mice. A total of 40 male C57BL/6J mice (18-20 g) were randomly divided into control group and model group (20 per group). The control group was fed as normal, and the model group was fed with high-fat diet. After one week, mice were fasted for 16 h, and the weight and fasting blood glucose were measured, the blood sample was collected from the tail vein for four weeks, once a week. The control group was injected with citric acid buffer and the model group was daily injected with STZ (40 mg·kg-1) for three days. After feeding with high fat diet for two weeks, random blood glucose was measured. The mice were defined as type 2 diabetes mellitus model if the blood glucose was more than 16.7 mmol·L-1. The model mice of both groups were treated with glucose by intraperitoneal injection for glucose tolerance test. Comparing with the control group, significant difference was observed in the weight and blood glucose of the model group after one week (P<0.05). The effect of feeding time had significant effects on blood glucose (F=7.025) and weight (F=200.831) (P<0.05) as determined by repeated measures variance analysis. The feeding time also had significant effects on low density lipoprotein (F=30.793), triglyceride (F=34.027) and the high density lipoprotein (F=30.793) (P<0.05). The feeding time and high-fat diet had interaction on the body weight and triglycerides (P<0.05). The glucose tolerance of mice in model group decreased using the glucose tolerance curve. The serum TNF-α increased in model group (P< 0.05). High-fat diet combined with STZ can lead to the disorder of glucose and lipid metabolism, reduce the glucose tolerance and inflammation in C57BL/6J mice. High-fat diet combined with STZ can improve the incidence of type 2 diabetes in mice.

high-fat diet; type 2 diabetes; glucose tolerance curve

10.11984/j.issn.1000-7083.20150206

2015-06-10 接受日期：2015-10-29 基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81370916)； 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院培育基金項(xiàng)目(2014QN111)

趙英政(1979—), 男, 講師, 從事環(huán)境毒理學(xué)研究, E-mail:yingzhengzhao@126.com

*通信作者Corresponding author, 副教授, E-mail:xugc166@163.com

R994.6

A

1000-7083(2016)01-0109-04