梁梓， 杜超豪， 楊瑤君， 農(nóng)向， 廖鴻， 顏珊

(樂山師范學院生命科學學院，四川樂山614004)

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長足大竹象雄性附腺提取物抑菌作用研究

梁梓， 杜超豪， 楊瑤君*， 農(nóng)向， 廖鴻， 顏珊

(樂山師范學院生命科學學院，四川樂山614004)

以3種細菌(大腸桿菌Escherichiacoli、金黃色葡萄球菌Bacillussubtilis、枯草芽孢桿菌Staphyloccocusaureus)為供試菌，測定了長足大竹象Cyrtotrachelusbuqueti雄性附腺提取物的抑菌活性。結(jié)果表明：長足大竹象雄性附腺提取物對革蘭氏陽性菌如枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌均有一定的抑菌活性。不同濃度的粗提物對枯草芽孢桿菌及金黃色葡萄球菌抑菌影響差異均具有高度統(tǒng)計學意義(P<0.01)，抑菌活性隨著粗提物濃度的增加而增強。粗提物對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的最小抑菌濃度分別為0.2 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1。不同處理溫度對長足大竹象雄性附腺粗提物的抑菌作用有一定影響。

長足大竹象；雄性附腺；抑菌作用

長足大竹象Cyrtotrachelusbuqueti又名竹橫錐大象，屬昆蟲綱Insecta鞘翅目Coleoptera象甲科Curculionoidea，國內(nèi)主要分布于重慶、廣東、廣西等地。長足大竹象是竹林主要害蟲，國家林業(yè)局將它列為我國林業(yè)危險性有害生物之一(王維德等，2002)。

由于昆蟲的生殖道直接與體內(nèi)環(huán)境相連，是潛在的微生物通道，有時可能會消極地影響繁殖成功率。據(jù)文獻報道，為了防止有害細菌或真菌的入侵，許多昆蟲的生殖系統(tǒng)能產(chǎn)生抗菌肽，包括雄性附腺。將黑腹果蠅Drosophilamelanogaster未交配的雌蟲與剛交配的雌蟲生殖道作對比，發(fā)現(xiàn)后者增加了3種抗菌蛋白，其中一種蛋白(28 kDa)是雄性附腺的產(chǎn)物(Lung & Wolfner，1999)；這些蛋白在交配過程中比精子先轉(zhuǎn)入到雌蟲體內(nèi)，使得交配后的雌蟲生殖道和卵都能抵抗細菌的侵染；在精子進入后，在雌蟲生殖道內(nèi)的這些蛋白可以保護精子免受細菌的侵害(Lung & Wolfner，2001)。目前有關(guān)昆蟲雄性附腺抑菌的研究已經(jīng)有了一些報道，研究對象主要集中在作為生物學模式物種的黑腹果蠅(Wolfner，2002；Ram & Wolfner，2007)。本研究首次對長足大竹象雄性附腺抑菌作用進行研究，為下一步長足大竹象雄性附腺生理功能研究提供有價值的資料。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

2014年8月初，在樂山師范學院實驗竹林罩網(wǎng)，采集捕捉竹筍上剛出土的長足大竹象成蟲，根據(jù)蟲的外形特征判斷雌雄。隨機采集體型中等大小的雌、雄蟲各50頭，在溫度25 ℃、相對濕度75%、光周期16L∶8D環(huán)境下以盆栽竹筍喂食在室內(nèi)飼養(yǎng)，每2 d更換1次竹筍，讓其自由交配；用紅外攝像系統(tǒng)實時監(jiān)測其交配情況，交配一旦結(jié)束，隨即采雄蟲附腺或?qū)⑿巯x轉(zhuǎn)移至新飼養(yǎng)室繼續(xù)飼養(yǎng)。實驗分別采集剛出土，出土24 h，交配后0 h、2 h、12 h、24 h、48 h的雄蟲附腺進行內(nèi)容物蛋白含量測定。

1.2 主要儀器

高壓蒸汽滅菌鍋(YX-18LM)、冷凍干燥箱(HDR-100HP)、恒溫水浴鍋、電子天平(BSS224S)、游標卡尺、841型遠紅外電子專用干燥箱、移液槍、冷凍高速離心機(TGL-20MB/TGL-20M)、紫外可見分光光度計(K1901)。

大腸桿菌Escherichiacoli、枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis、金黃色葡萄球菌Staphyloccocusaureus以及其他分析純等均由樂山師范學院生命科學學院實驗室提供。

1.3 試驗方法

1.3.1 雄性附腺內(nèi)容物樣品制備 按照實驗設(shè)計要求，選取各采樣節(jié)點雄蟲7頭，在4 ℃昆蟲生理鹽水(NaCl 6.8 g，CaCl20.2 g，KCl 0.2 g，MgCl2·6H2O 0.2 g，NaHCO30.15 g，葡萄糖7.7 g，ddH2O 1000 mL)中解剖雄蟲，取出完整的雄性附腺，放入500 μL磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH6.86)中冰浴勻漿。10 000 r/min離心10 min，取上清液，沉淀用少量緩沖液清洗，離心后，收集上清液，合并相同上清液為一管，定容至1 mL，-20 ℃保存?zhèn)溆?，用于抑菌活性測定。

1.3.2 雄性附腺內(nèi)容物蛋白含量測定 利用Bradford法(Bradford，1976)，建立牛血清白蛋白標準曲線，分別用移液槍加入不同時期適量樣品各自定容到1 mL，加入5 mL考馬斯亮藍G-250蛋白質(zhì)試劑，充分混合，放置2 min后以空白為對照，測定其595 nm處吸光值，并通過標準曲線查得各待測樣品中蛋白質(zhì)的含量。最終確定雄蟲附腺內(nèi)容物蛋白含量較高的時期。

1.3.3 雄性附腺蛋白干粉的制備 選擇蛋白含量較高時期的雄蟲，將其雄性附腺內(nèi)容物樣品進行冷凍干燥，制成蛋白干粉，-70 ℃貯存。

1.3.4 培養(yǎng)基及無菌平板的制備 固體培養(yǎng)基及無菌平板的制作參照沈萍等(1999)的方法。

1.3.5 菌種的活化及菌懸液制備 取3支已滅菌的試管，每支試管倒入一定量(不超過試管的1/5)的培養(yǎng)基，制成斜面(斜面不超過試管的1/2)，取供試菌種1環(huán)劃線培養(yǎng)，金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌37 ℃培養(yǎng)24 h，空白對照用無菌蒸餾水配制，采用血細胞計數(shù)板法計數(shù)，使菌懸液濃度為5×106～5×107個/mL，備用。

1.3.6 含菌平板的制備 將上述各培養(yǎng)基滅菌后倒于培養(yǎng)皿內(nèi)，每個培養(yǎng)皿約20 mL。待培養(yǎng)基凝固后，用滅菌移液槍準確吸取上述各種菌懸液0.2 mL注入培養(yǎng)皿內(nèi)，再用滅菌的涂布棒迅速將菌液涂抹均勻，制成指示含菌平板。

1.3.7 抑菌性的測定 將雄性附腺蛋白含量最高時樣品制備的蛋白干粉溶解于預(yù)冷的無菌生理鹽水，分別配成3.2 mg·mL-1、0.8 mg·mL-1樣品溶液， 將滅菌的6 mm圓形濾紙片分別置于這2種濃度的雄性附腺內(nèi)容物溶液中浸泡1 h，用已滅菌的鑷子取浸泡過的濾紙片，放置于含菌平板中，每個濃度3個重復(fù)板，空白對照為無菌蒸餾水。金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌37 ℃培養(yǎng)24 h，取出，觀察是否有抑菌圈，若有，則用游標卡尺測量抑菌圈直徑(包括濾紙片直徑)。

1.3.8 最小抑菌濃度(MIC)的測定 用倍比稀釋，將雄性附腺蛋白含量最高時的內(nèi)容物溶液稀釋成1.6 mg·mL-1、0.8 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1、0.2 mg·mL-1、0.1 mg·mL-15個濃度。每支試管中加入0.2 mL對數(shù)期生長菌懸液，并用PBS作陰性對照，將不同濃度的內(nèi)容物稀釋液加入到菌懸液試管中，吸取0.3 mL混合液涂布培養(yǎng)基平板上，置于37 ℃下培養(yǎng)24 h，觀察平板內(nèi)有無細菌生長，以無菌生長的最低粗提取濃度作為最小抑菌濃度(溫旺榮等，1994)。每個濃度重復(fù)3次。

1.3.9 溫度對長足大竹象雄性附腺抑菌的影響 分別取200 μL附腺蛋白含量最高時的內(nèi)容物溶液放入不同的滅菌試管中，將試管分別置于3 ℃、16 ℃、18 ℃、22 ℃、24 ℃、28 ℃、30 ℃下處理30 min，根據(jù)1.3.7測定結(jié)果選擇適當?shù)男坌愿较賰?nèi)容物抑菌濃度，重復(fù)1.3.7的步驟比較不同溫度對長足大竹象雄性附腺提取物抑菌活性的影響。每個處理重復(fù)3次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)的整理和分析均使用Excel 2000及SPSS軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 長足大竹象雄性附腺不同發(fā)育時期蛋白含量

不同發(fā)育時期長足大竹象雄性附腺蛋白含量如表1所示，剛出土的長足大竹象雄性附腺中蛋白含量為每只568.75 μg±13.12 μg，在出土12 h內(nèi)蛋白增長十分迅速，增加了10.85%，蛋白含量達到每只630.43 μg±12.45 μg。而后蛋白含量的增長趨于緩和，至出土24 h，達到每只640.57 μg±36.79 μg，蛋白含量最高。交配后2 h內(nèi)蛋白含量迅速下降，較追尾時下降9.29%；交配后的2～12 h蛋白含量下降趨于穩(wěn)定。交配12 h后蛋白含量又急劇增加，達到每只608.36 μg±14.56 μg。到交配后的48 h基本上恢復(fù)到出土24 h水平。通過兩兩差異顯著性檢驗，除出土12 h、出土24 h和預(yù)交配0 h 3個時間段外，其他各個時期蛋白含量的變化差異具有高度統(tǒng)計學意義(P<0.01)。出土24 h長足大竹象雄性附腺蛋白含量基本上達到最高，最終選擇出土24 h長足大竹象雄性附腺蛋白樣品進行抑菌活性測定。

圖1 不同發(fā)育時期長足大竹象雄性附腺提取物蛋白含量

Fig. 1 The protein concentration of male accessory-gland extracts fromCyrtotrachelusbuquetiin different development stages

2.2 抑菌活性的測定

長足大竹象雄性附腺內(nèi)容物粗提物的抑菌試驗結(jié)果如表1，其內(nèi)容物的粗提物對屬于革蘭氏陰性菌的大腸桿菌沒有抑菌作用，但對革蘭氏陽性菌如枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌均有一定的抑菌作用。與空白對照相比，不同濃度的粗提物對枯草芽孢桿菌及金黃色葡萄球菌抑菌活性影響差異均具有高度統(tǒng)計學意義(P<0.01)，抑菌活性隨著粗提物濃度的增加而增強。當長足大竹象雄性附腺粗提物濃度為0.8 mg·mL-1時，枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌生長平板上的抑菌圈直徑分別為11.16 mm、10.62 mm。低于頭孢霉素在0.8 mg·mL-1濃度時對枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌生長平板上的抑菌圈直徑(15.78 mm、17.22 mm)(向玉勇等，2013)。

表1 長足大竹象雄性附腺粗提物的抑菌圈直徑(單位:mm)

2.3 最小抑菌濃度的測定

長足大竹象雄性附腺粗提物最小抑菌濃度的結(jié)果如表2所示，可以看出粗提物對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌均有一定的抑菌作用，最小抑菌濃度分別為0.2 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1。

2.4 溫度對長足大竹象雄性附腺抑菌影響

不同溫度對長足大竹象雄性附腺粗提物的抑菌作用有一定影響，依據(jù)樂山地區(qū)全年平均最低溫度和最高溫度，設(shè)置3 ℃和30 ℃為邊界溫度，從表3可以看出邊界溫度下的抑菌圈非常小，抑菌活性較低。隨著對長足大竹象雄性附腺粗提物處理溫度的升高，其抑菌作用明顯呈先上升后下降的趨勢。通過兩兩差異顯著性檢驗，28 ℃下粗提物對金黃色葡萄球菌及枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑與其他溫度下的差異具有高度統(tǒng)計學意義(P<0.01)。顯著性分析顯示：不同溫度下長足大竹象雄性附腺粗提物對金黃色葡萄球菌及枯草芽孢桿菌抑制效果均在α=0.05水平上有顯著影響(t0.05

3 結(jié)論與討論

從20世紀50年代開始，有關(guān)雙翅目、鱗翅目、直翅目、鞘翅目等多個目昆蟲雄性附腺的研究已經(jīng)有了一些報道(Chapman & Davies，2004；高潔等，2008)。但迄今為止對于雄性附腺抗菌性的研究，在鞘翅目昆蟲中尚未見報道。在本研究中，我們用濾紙片法首次證明長足大竹象雄性附腺中存在抗菌蛋白，并且對革蘭氏陽性菌如枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌均有一定的抑菌活性。對大腸桿菌的抑制效果不明顯，可能是因為大腸桿菌普遍存在，也為長足大竹象體內(nèi)的天然共生菌，因此未檢測到抑菌效果。這與其他學者對棕尾別麻蠅Boettcheriscaperegrina雄性附腺抑菌的研究結(jié)果相同，并且其抑菌活性明顯高于棕尾別麻蠅雄性附腺對該枯草芽孢桿菌的抑菌活性(高熹等，2007)。在濃度為0.8 mg·mL-1時本實驗長足大竹象雄性附腺粗提物對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑(10.62 mm)低于家蠅Muscadomestica血淋巴粗提物對該菌的抑菌圈直徑(12.22 mm)(向玉勇等，2013)。這可能是因為昆蟲抗菌肽一般是在血淋巴及消化道中產(chǎn)生的一類抗菌肽，專職于免疫功能的淋巴液中含有更多、更強的抑菌物質(zhì)(孫恩濤，秦志輝，2006)。

表2 長足大竹象雄性附腺粗提物對供試菌種的最小抑菌濃度

表3 溫度對長足大竹象雄性附腺粗提物抑菌活性的影響

本研究用濾紙片法測定的長足大竹象雄性附腺提取物最小抑菌濃度均已超出常規(guī)的敏感判定，一方面可能與抗菌肽是一類小分子，在組織內(nèi)含量低，另一方面可能與使用的是長足大竹象雄性附腺粗提物，而不是分離純化出的純抗菌蛋白有關(guān)。究竟是何種抗菌肽, 是一種或是幾種抗菌蛋白綜合起作用需要進一步研究。

本研究通過不同溫度處理，發(fā)現(xiàn)溫度是影響長足大竹象雄性附腺粗提物抑菌活性的因素，在28 ℃下的粗提物抑菌效果最好。根據(jù)本文的結(jié)果，在長足大竹象出土高峰期，可以通過觀測竹林區(qū)溫度并結(jié)合其他氣候指標，對長足大竹象進行及時防治。本研究結(jié)果可為制定經(jīng)濟合理的防治方案提供一定的參考依據(jù)。

本研究用的是長足大竹象雄性附腺粗提物，為深入探討其活性物質(zhì)的抑菌機理，及進一步揭示雄性附腺在生殖生理中的特殊功能，需要對粗提物進行分離純化，從而為開展更為深入的研究以及從生殖的角度找到一條切實可行的防治對策建立基礎(chǔ)。

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Study on Antibacterial Activity of Male Accessory-gland Extracts fromCyrtotrachelusbuqueti

LIANG Zi, DU Chaohao, YANG Yaojun*, NONG Xiang, LIAO Hong, YAN Shan

(College of Life Science, Leshan Normal University, Leshan, Sichuan Province 614004, China)

The antibacterial activities of male accessory-gland extracts fromCyrtotrachelusbuquetiwere determined using three species of bacteria (Escherichiacoli,Bacillussubtilis, andStaphyloccocusaureus). The results showed that male accessory-gland extracts fromC.buquetihad a certain antibacterial activity on the Gram-positive bacteria such asB.subtilisandS.aureus, and the antibacterial activities were significantly differed among different concentrations of male accessory-gland extracts. The antibacterial activity would increase with increasing concentrations of the extracts. The minimum inhibitory concentration of male accessory-gland extracts againstB.subtilisandS.aureuswere 0.2 mg·mL-1and 0.4 mg·mL-1, respectively. Temperature also had a certain influence on the antibacterial effects of male accessory-gland extracts fromC.buqueti.

Cyrtotrachelusbuqueti; male accessory glands; antibacterial activity

10.11984/j.issn.1000-7083.20150234

2015-05-01 接受日期：2015-10-29 基金項目：四川省教育廳項目(13ZB0112)

梁梓(1980—)， 女, 高級實驗師, 研究方向: 生物化學, E-mail:120564533@qq.com

*通信作者Corresponding author， 博士, 教授, 研究方向: 林竹生態(tài), E-mail:290316289@qq.com

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1000-7083(2016)01-0066-04