王昌萌，張 鳳，張 雯，李鏇穎，張 華，李 偉, 高 敏

(天津工業(yè)大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院，天津市先進(jìn)纖維與儲(chǔ)能技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300387)

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戊二醛交聯(lián)對(duì)鹽酸青藤堿微膠囊性能的影響及體外細(xì)胞毒性研究*

王昌萌，張 鳳，張 雯，李鏇穎，張 華，李 偉, 高 敏

(天津工業(yè)大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院，天津市先進(jìn)纖維與儲(chǔ)能技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300387)

采用W/O/W復(fù)乳界面聚合法以戊二醛作為交聯(lián)劑，制備鹽酸青藤堿聚乙烯醇(SM-PVA)微膠囊。掃描電鏡和傅里葉紅外光譜分析戊二醛用量對(duì)SM-PVA微膠囊結(jié)構(gòu)的影響，動(dòng)態(tài)膜透析法研究微膠囊體外藥物釋放行為，MTT法評(píng)價(jià)微膠囊體外細(xì)胞毒性。結(jié)果表明SM-PVA微膠囊表面光滑、分散性良好；隨著戊二醛用量增加，微膠囊囊壁增厚，結(jié)構(gòu)緊實(shí)；體外藥物釋放結(jié)果顯示戊二醛用量及釋放介質(zhì)pH值對(duì)藥物釋放均有影響；且體外細(xì)胞毒性結(jié)果表明微膠囊對(duì)L929細(xì)胞無(wú)細(xì)胞毒性。SM-PVA微膠囊具有緩釋性能和良好的生物相容性，可進(jìn)一步研制成為新型中藥給藥制劑。

鹽酸青藤堿；聚乙烯醇；戊二醛；藥物緩釋；細(xì)胞毒性

0 引 言

鹽酸青藤堿(Sinomenine hydrochloride，SM)是從防已科植物青風(fēng)藤中提取的青藤堿的鹽酸鹽[1-2]。青藤堿具有免疫抑制、清除活性自由基、改善血管循環(huán)等作用，并且對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、心律失常等疾病療效顯著[3-5]。但其生物半衰期較短，臨床治療一般需長(zhǎng)期大劑量給藥，頻繁給藥容易引起血藥濃度的大幅度波動(dòng)、胃腸道不適和過(guò)敏反應(yīng)等副作用[6-7]，因此有必要進(jìn)行藥劑學(xué)研究以彌補(bǔ)上述缺陷。

新型給藥系統(tǒng)(Drug delivery system, DDS)應(yīng)用已成為中藥藥劑學(xué)研究的熱點(diǎn)，隨之出現(xiàn)了很多類型的藥物傳遞體系[8-11]，其中，微膠囊化技術(shù)制備的藥物微膠囊為中藥傳統(tǒng)制劑的改進(jìn)提供新方法。針對(duì)水溶性藥物，最常用的承載方式是雙乳液法，即W/O/W乳液法，可有效提高水溶性藥物載藥量低的問(wèn)題。藥物載體材料的性能對(duì)藥物微膠囊至關(guān)重要，其中聚乙烯醇(Polyvinyl alcohol，PVA)被廣泛應(yīng)用。PVA因其具有對(duì)人體無(wú)毒、無(wú)刺激性、生物可降解性等優(yōu)勢(shì),可用于制備止血纖維、人工皮膚、藥膜、代血漿及藥物微球等[12-15]。

本實(shí)驗(yàn)以SM為模型藥物，PVA為微膠囊壁材，采用W/O/W雙乳液法制備SM-PVA緩釋微膠囊，實(shí)現(xiàn)了水溶性藥物成分SM的微膠囊化，考察戊二醛用量對(duì)SM-PVA微膠囊結(jié)構(gòu)和體外藥物釋放性能的影響。而戊二醛具有一定的生物毒性，作為交聯(lián)劑過(guò)量添加可能會(huì)引起藥物微膠囊制劑的安全性，為此，本研究進(jìn)一步考察微膠囊的細(xì)胞相容性，為研制SM的新型中藥制劑奠定基礎(chǔ)，此類研究未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

1 實(shí) 驗(yàn)

1．1 主要試劑

鹽酸青藤堿(純度>99%)，西安飛達(dá)生物技術(shù)有限公司；聚乙烯醇(PVA，平均聚合度為1750±50)和失水山梨糖醇脂肪酸(Span-80)，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；其余試劑均為分析純；MTT、RPMI 1640 培養(yǎng)基和胎牛血清，Gibco公司；胰蛋白酶、青霉素和鏈霉素，Solarbio公司；小鼠成纖維細(xì)胞(L929)，天津醫(yī)科大學(xué)。

1．2 SM-PVA微膠囊的制備及表征

1．2.1 SM-PVA微膠囊的制備

精密稱取一定量SM和PVA，分別制成溶液備用。采用W/O/W雙液乳法，SM溶液中加入一定量戊二醛和鹽酸溶液制成內(nèi)水相；將內(nèi)水相滴加入溶有span-80的環(huán)己烷油相，乳化30 mins，形成穩(wěn)定的W/O初乳液。在高速攪拌下將初乳液分散到配制好的PVA水溶液中，形成W/O/W復(fù)乳體系，反應(yīng)1 h，抽濾，洗滌樣品，真空干燥即得SM-PVA微膠囊。空白PVA微膠囊制備過(guò)程中，在內(nèi)水相中不添加SM，其余方法相同。

1．2.2 SM-PVA微膠囊的表征

SM-PVA微膠囊的紅外光譜(FT-IR)采用KBr壓片法，德國(guó)Bruker公司TENSOR37型傅里葉變換紅外光譜儀進(jìn)行測(cè)定，分辨率為4 cm-1，測(cè)試范圍為400～ 4 000 cm-1。取少量分散均勻的SM-PVA微膠囊置于貼有導(dǎo)電膠的樣品臺(tái)上，噴金，采用日本島津公司SS-50型場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(SEM)觀察微膠囊表面形貌。

1．3 SM-PVA微膠囊體外藥物釋放性能研究

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程

精密稱取SM標(biāo)準(zhǔn)藥物適量，分別用pH值6.8、7.4的PBS和0.1 mol/L鹽酸稀釋，得到10，20，40，60，80和100 mol/L的一系列SM溶液，采用日本Shimadzu公司UV-260型紫外分光光度計(jì)，在波長(zhǎng)265 nm處測(cè)試溶液吸光度，以吸光度A對(duì)濃度C進(jìn)行線性回歸，分別得到SM在pH值6.8、7.4的PBS和0.1 mol/L鹽酸溶液中的回歸方程。

2.3.2 SM-PVA微膠囊的載藥量及包封率

精密稱取0.1 g鹽酸青藤堿藥物微膠囊，用瑪瑙研缽研磨30 min后加入5 mL N-甲基吡咯烷酮溶解，再用PBS稀釋定容至50 mL，超聲30 min，離心后取上清液，在265 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算鹽酸青藤堿的含量。再根據(jù)以下公式計(jì)算載藥量(DL)和包封率(EE)。

載藥量=(微膠囊中鹽酸青藤堿的含量/微膠囊的總重量)×100%

包封率=(微膠囊中鹽酸青藤堿的含量/投藥量)×100%

1.3.3 SM-PVA微膠囊體外藥物釋放性能研究

采用動(dòng)態(tài)膜透析法考察SM-PVA微膠囊的體外藥物釋放性能。精密稱取真空干燥后的SM-PVA微膠囊0.1 g，加入經(jīng)超純水浸泡煮沸處理過(guò)的透析袋中，緊密封口后使其懸浮于200 mL 一定pH 值的PBS中，在(37±0.5) ℃恒溫水浴中以100 r/min的速度磁力攪拌，在不同時(shí)間間隔取外液5 mL，同時(shí)補(bǔ)充pH值的等量同溫度的PBS。采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定所取溶液的吸光度，計(jì)算釋放介質(zhì)中SM的量，并按下式計(jì)算累積釋藥百分率，分別研究戊二醛濃度及釋放介質(zhì)pH值對(duì)SM-PVA微膠囊釋藥性能的影響。

累計(jì)釋放率=(透析外液鹽酸青藤堿累計(jì)量/微膠囊中鹽酸青藤堿總量)×100%

1．4 SM-PVA微膠囊的體外細(xì)胞毒性研究

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

小鼠成纖維細(xì)胞(L929)接種在含10% (體積分?jǐn)?shù))胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，在37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞呈單層貼壁生長(zhǎng)。

實(shí)驗(yàn)分組：空白對(duì)照組(無(wú)血清、無(wú)細(xì)胞)、陰性對(duì)照組(加細(xì)胞，不加微膠囊)、PVA微膠囊組、不同質(zhì)量濃度SM-PVA微膠囊組。實(shí)驗(yàn)組微膠囊制備過(guò)程中，戊二醛濃度均為45%，考察戊二醛添加量對(duì)細(xì)胞相容性的影響。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)前，將干燥恒重的PVA微膠囊和SM-PVA微膠囊紫外滅菌3 h，以無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)液配制成不同質(zhì)量濃度的懸液。

1.4.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞毒性

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的L929細(xì)胞，用2.5 g/L胰蛋白酶的PBS溶液消化細(xì)胞后，重新分散，配成細(xì)胞密度為1×104cell/mL單個(gè)細(xì)胞懸液，接種于96孔板，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h 后，倒置顯微鏡鏡下觀察確認(rèn)細(xì)胞貼壁良好。實(shí)驗(yàn)組加系列稀釋的高、中、低劑量SM-PVA懸液，使終濃度依次為5.0，1.0和0.2 mg/mL，各組分別記為SM-PVA-5.0、SM-PVA-1.0和SM-PVA-0.2。各組分別培養(yǎng)24，48和72 h，結(jié)束培養(yǎng)前4 h，每孔加 5 mg/mL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后小心吸去上清，每孔加150 μL DMSO，在微量振蕩器上振蕩混勻10 min，使甲瓚溶解。酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)490 nm的每孔光密度值(OD值)，平行測(cè)試3次取平均值，計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖率。

細(xì)胞相對(duì)增殖率(RGR，%)= (樣品組吸光度/對(duì)照組吸光度)×100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與討論

2.1 SM-PVA微膠囊的紅外光譜分析

圖1 SM, PVA和SM-PVA微膠囊的紅外光譜

Fig 1 FT-IR spectra of SM, PVA and SM-PVA microcapsules

2.2 SM-PVA微膠囊表面形貌

圖2(a)為SM-PVA微膠囊的SEM照片，微膠囊呈球形，表面光滑且致密，無(wú)粘連現(xiàn)象。戊二醛作為交聯(lián)劑，隨著其含量增加，微膠囊的壁厚及致密度增大。圖2(b)和(c)為研磨后微膠囊的放大照片，當(dāng)戊二醛用量較低時(shí)，圖2(b)中可以觀察到破損的微膠囊呈明顯地空心結(jié)構(gòu)，膠囊囊壁厚度約為1 μm；而戊二醛用量較高時(shí)，由于囊壁交聯(lián)程度較高，囊壁更為致密，圖2(c)中未見(jiàn)有破損的膠囊出現(xiàn)。

圖2 SM-PVA微膠囊的SEM照片

Fig 2 SEM photograph of SM-PVA microcapsules

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程建立及SM-PVA微膠囊載藥量和包封率

SM在0.1 mol/L鹽酸溶液中的回歸方程為A=0.01452C+0.0376，相關(guān)系數(shù)為0.99631；在pH值為6.8的PBS中的回歸方程為A=0.01482C-0.0204，相關(guān)系數(shù)為0.99939；在pH值為7.4的PBS中的回歸方程為A=0.01472C-0.0123，相關(guān)系數(shù)為0.99942，結(jié)果表明SM溶液質(zhì)量濃度在10～100 μg/mL范圍內(nèi)與A呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，滿足實(shí)驗(yàn)要求。實(shí)驗(yàn)所制備的SM-PVA微膠囊的載藥量為6.5%，包封率為87%。

2.4 SM-PVA微膠囊體外藥物釋放性能研究

2.4.1 戊二醛濃度對(duì)SM-PVA微膠囊釋藥性能的影響

PVA需要在硫酸、鹽酸、乙酸、甲醇等催化劑存在條件下才能與甲醛或戊二醛發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)[16]。本實(shí)驗(yàn)中采用鹽酸作為催化劑，催化PVA與戊二醛發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)構(gòu)成微膠囊的囊壁。隨著戊二醛用量加大，聯(lián)網(wǎng)密度增大，增大PVA鏈段移動(dòng)的束縛，制得的微膠囊囊壁增厚，且致密度增加。如圖3所示，當(dāng)戊二醛濃度為45%時(shí)，SM-PVA微膠囊的藥物釋放速率明顯減慢，40 h 藥物累積釋放率僅為46%；而戊二醛濃度為25%時(shí)藥物累積釋放率為57%。

Fig 3 The releasing curves of SM-PVA microcapsules with various contents of glutaraldehyde

這與SEM觀察到SM-PVA微膠囊形態(tài)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符，從而驗(yàn)證了戊二醛的用量對(duì)微膠囊結(jié)構(gòu)具有一定的影響。

2.4.2 pH值對(duì)SM-PVA微膠囊釋藥性能的影響

圖4為不同pH(1.5、6.8、7.4)值的釋放介質(zhì)中SM-PVA微膠囊的釋藥性能。由圖可以看出其藥物釋放有一定的pH依賴性，在pH值為1.5和6.8時(shí)SM-PVA的藥物釋放速率較快，原因是PVA分子鏈中含有大量的羥基，在pH值=2～7 時(shí)，PVA分子鏈中的—OH能部分質(zhì)子化而帶正電荷，使分子鏈間相互排斥，易于伸展，表現(xiàn)出較高的溶脹性，藥物更容易滲透出來(lái)。當(dāng)pH值大于7時(shí)，溶劑中存在的—OH使得PVA分子鏈中的羥基去質(zhì)子化，使得分子鏈的伸展受限，所以藥物釋放速率明顯低于酸性條件下。文獻(xiàn)[8,17]結(jié)果也證實(shí)了這一規(guī)律，在不同pH值條件下，微膠囊壁材中的基團(tuán)間靜電相互作用的強(qiáng)弱不同，導(dǎo)致藥物釋放速率不同。

圖4 不同pH值的SM-PVA微膠囊釋藥曲線

Fig 4 The releasing curves of SM-PVA microcapsules with various pH value

2.5 MTT檢測(cè)體外細(xì)胞毒性

1983年，Mosmann[18]建立的四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法，由于其操作簡(jiǎn)單、快速且無(wú)放射性污染等特點(diǎn)，已成為細(xì)胞生物學(xué)及相關(guān)研究領(lǐng)域一種分析細(xì)胞活性、生長(zhǎng)增殖的常用方法。細(xì)胞毒性試驗(yàn)是目前用于毒性評(píng)價(jià)、生物材料檢測(cè)和環(huán)境材料接觸檢測(cè)的主要方法。

圖5給出了不同濃度的SM-PVA微膠囊和無(wú)載藥的純PVA微膠囊對(duì)L929細(xì)胞相對(duì)增殖率的影響。在細(xì)胞培養(yǎng)24 h時(shí)，不同濃度的SM-PVA和PVA微膠囊對(duì)L929細(xì)胞的細(xì)胞相對(duì)增殖率的影響無(wú)明顯的差別；在細(xì)胞培養(yǎng)48和72 h時(shí)，隨著SM-PVA微膠囊濃度的增大，L929細(xì)胞的細(xì)胞相對(duì)增殖率呈明顯的下降趨勢(shì)；純PVA微膠囊對(duì)L929細(xì)胞相對(duì)增殖率影響不大。由圖5可知，在同一時(shí)間點(diǎn)(如72 h)，細(xì)胞相對(duì)增殖率隨著SM-PVA微膠囊濃度的增大而減少；在同一濃度(如SM-PVA微膠囊濃度為5.0 mg/mL)條件時(shí)，細(xì)胞相對(duì)增殖率隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。

圖5 不同微膠囊對(duì)L929細(xì)胞的細(xì)胞毒性

Fig 5 In vitro cytotoxicity of various microcapsules to L929 cell

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析可知，在24 h，各組間比較，P>0.05，無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明在24 h 以內(nèi)，當(dāng)SM-PVA微膠囊的濃度≤ 5.0 mg/mL 時(shí)，對(duì)細(xì)胞增殖的影響不大；在細(xì)胞培養(yǎng)48和72 h，SM-PVA微膠囊的濃度為5.0 mg/mL 組與其它各組比較，P<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明在細(xì)胞培養(yǎng)48 h以上時(shí)，當(dāng)SM-PVA微膠囊的濃度大于5.0 mg/mL時(shí)，對(duì)細(xì)胞增殖有較大影響。

3 結(jié) 論

綜上所述，W/O/W雙乳液法制備的SM-PVA微膠囊表面光滑、致密、無(wú)粘連現(xiàn)象，微膠囊整體形貌較好，呈明顯的核殼結(jié)構(gòu)。隨著戊二醛用量增加，SM-PVA微膠囊壁厚及致密度增加；體外藥物釋放實(shí)驗(yàn)表明其緩釋性能明顯增強(qiáng)，進(jìn)一步證實(shí)戊二醛濃度對(duì)SM-PVA微膠囊結(jié)構(gòu)的影響。此外，釋放介質(zhì)pH值對(duì)SM-PVA微膠囊的釋藥性能也存在一定的影響，在模擬胃液(pH值為1.5)的磷酸鹽緩沖液中的藥物釋放較快。體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)方法制備的SM-PVA微膠囊無(wú)細(xì)胞毒性，具有良好的生物相容性，為研制口服藥物制劑奠定基礎(chǔ)。

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Study on the effect of crosslinking of glutaraldehyde on properties of polyvinyl alcohol microcapsules with sinomenine hydrochloride and in vitro cytotoxicity

WANG Changmeng, ZHANG Feng, ZHANG Wen, LI Xuanying,ZHANG Hua, LI Wei, GAO Min

(Tianjin Municipal Key Laboratory of Advanced Fiber and Energy Storage,

School of Materials Science and Engineering, Tianjin Polytechnic University, Tianjin 300387, China)

Polyvinyl alcohol (PVA) microcapsules carrying Sinomenine hydrochloride (SM) were prepared by W/O/W double emulsion interfacial polymerization technique with glutaraldehyde as a cross linker. The effects of content of cross linker on structure of SM-PVA microcapsules were studied by SEM and FT-IR．In vitro release and cytotoxicity were studied by dynamic membrane dialysis and MTT method respectively. The results showed that SM-PVA microcapsules were approximate to spheres, smooth with almost homogeneous structure. The thickness of capsule wall was increased with increasing the content of glutaraldehyde. The in vitro release results demonstrated glutaraldehyde dosage and pH value had a significant effect on drug release. The cell experiments showed that SM-PVA microcapsules have no cytotoxicity to L929 cell. The research indicates that SM-PVA microcapsules have good controlled release characteristics and biological activity, which can be used as a potential delivery system.

sinomenine hydrochloride; polyvinyl alcohol; glutaraldehyde; drug sustained release；cytotoxicity

1001-9731(2016)11-11115-05

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(51203113)；天津市高等學(xué)?？萍及l(fā)展基金計(jì)劃資助項(xiàng)目(20140305)；國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃資助項(xiàng)目(201410058012)

2015-09-25

2015-12-25 通訊作者：張 雯，E-mail: zhangwen2050@hotmail.com

王昌萌 (1993-)，男，成都人，在讀本科，師承張?chǎng)┲v師，從事生物醫(yī)用材料研究。

R283.6

A

10.3969/j.issn.1001-9731.2016.06.023