宋永周 童九輝 李 明 馬 維 關(guān) 健 蘇瑞紅

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院骨科，河北 石家莊 050000)

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實 驗 研 究

姜黃素對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞氧化應(yīng)激和基質(zhì)金屬蛋白酶13、白細胞介素-6分泌的影響※

宋永周 童九輝 李 明 馬 維△關(guān) 健1蘇瑞紅1

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院骨科，河北 石家莊 050000)

目的 觀察姜黃素對骨關(guān)節(jié)炎(OA)患者軟骨細胞氧化應(yīng)激和基質(zhì)金屬蛋白酶-13(MMP-13)、白細胞介素-6(IL-6)分泌的影響。方法 無菌分離并體外培養(yǎng)OA患者的膝關(guān)節(jié)軟骨細胞和正常關(guān)節(jié)軟骨細胞；采用姜黃素干預(yù)培養(yǎng)細胞24 h，檢測各組細胞培養(yǎng)液上清中的MMP-13、IL-6水平，檢測丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性；用Real-Time PCR和Western blot法檢測細胞核因子E2相關(guān)因子(2Nrf 2) mRNA及其蛋白表達水平。采用熒光共聚焦顯微鏡觀察Nrf 2的核轉(zhuǎn)位情況，分析姜黃素對炎癥損傷細胞的干預(yù)作用。結(jié)果 對關(guān)節(jié)炎軟骨細胞，經(jīng)姜黃素干預(yù)后，SOD、MDA、MMP-13、IL-6均有顯著性變化。與正常軟骨細胞組比較，關(guān)節(jié)炎軟骨細胞組Nrf 2 mRNA及其蛋白表達水平下調(diào)，細胞核內(nèi)Nrf 2活性增強。經(jīng)姜黃素干預(yù)后關(guān)節(jié)炎軟骨細胞Nrf 2 mRNA及其蛋白表達水平上調(diào)，細胞核內(nèi)Nrf 2活性明顯增強。結(jié)論 姜黃素能部分糾正關(guān)節(jié)炎軟骨細胞的氧化應(yīng)激，減輕炎癥反應(yīng)，對軟骨細胞具有保護作用。

骨關(guān)節(jié)炎；中藥療法;姜黃素；基質(zhì)金屬蛋白酶-13；白細胞介素6

骨關(guān)節(jié)炎是一種慢性關(guān)節(jié)病，以骨質(zhì)增生、關(guān)節(jié)軟骨破壞變性為特征[1]。研究表明，骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生及發(fā)展與氧化應(yīng)激關(guān)系密切[2]。氧化應(yīng)激主要是活性氧自由基(reative oxygen species, ROS)產(chǎn)生過多，超出機體清除能力，從而導(dǎo)致組織損傷[3]。核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf 2)是調(diào)控細胞氧化應(yīng)激的核心轉(zhuǎn)錄因子[4]， Nrf 2通過與胞漿蛋白Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(Keap1)及抗氧化反應(yīng)原件(ARE)相互作用，啟動下游解毒酶和抗氧化酶的表達，從而發(fā)揮保護作用。姜黃素是一種來源于姜黃的植物多酚，可以抑制細胞炎癥反應(yīng)和氧化損傷[5-6]。同時Nrf 2也是姜黃素作用的重要靶標，激活Nrf 2是姜黃素藥理作用的重要分子機制[7-8]。然而，Nrf 2在姜黃素對軟骨細胞炎癥損傷的保護作用中是否有Nrf 2及其下游信號通路參與，目前尚未見報道。在本研究中，我們利用姜黃素干預(yù)體外培養(yǎng)細胞，測定Nrf 2 mRNA及其蛋白表達水平，探討姜黃素對軟骨細胞炎癥損傷的保護作用，為姜黃素治療骨關(guān)節(jié)炎提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料 選擇2014-05—2014-06在河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院骨科接受膝關(guān)節(jié)置換的10例骨關(guān)節(jié)炎患者，平均年齡(64.7±2.6)歲，術(shù)中取關(guān)節(jié)軟骨。10例患者臨床特征及放射學(xué)改變均符合1995年美國風(fēng)濕病學(xué)會(ACR)修訂的骨關(guān)節(jié)炎診斷標準[9]。另選擇4例因外傷導(dǎo)致截肢的患者膝關(guān)節(jié)軟骨，平均年齡(39.5±2.0)歲。所有患者排除嚴重心血管疾病、結(jié)締組織病、內(nèi)分泌疾病、肝腎疾病及腫瘤疾病。

1.2 主要試劑 姜黃素、二甲基亞砜(DMSO)購自sigma公司；DMEM/F12購自HyClone公司；胰蛋白酶-EDTA、Ⅱ型膠原蛋白酶為GIBCO公司產(chǎn)品； 胎牛血清(FBS)購自浙江杭州四季青生物工程材料有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮合酶(NOS)、一氧化氮(NO)測定試劑盒為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品；實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-Time PCR)試劑盒產(chǎn)自日本Takara公司；二喹啉甲酸(BCA)試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；Nrf 2單克隆抗體購自美國Abcam公司；酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)試劑盒基質(zhì)金屬蛋白酶-13(MMP-13)、白細胞介素-6(IL-6)購自Ray Biotech公司；異硫氰酸熒光素(FITC)標記的山羊抗兔IgG抗體購自美國Jackson Immuno Research公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 軟骨細胞的培養(yǎng) 無菌條件下取大致正常的關(guān)節(jié)軟骨，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)漂洗，剪切成1 mm3的碎塊，加入含有DMEM/F12全培養(yǎng)基的0.2%的Ⅱ型膠原酶，消化16 h左右，用200目濾網(wǎng)過濾收集軟骨細胞，洗滌細胞，離心后棄上清液，反復(fù)3次，細胞與全培養(yǎng)基分散均勻裝入細胞培養(yǎng)瓶，置于37 ℃，5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每3 d換液，待細胞貼壁生長，分泌基質(zhì)互相連接成單層時行1∶2比例傳代培養(yǎng)[10]。本實驗均采用2～3代軟骨細胞。采用隨機數(shù)字表法，分別將炎癥軟骨細胞(A系)和正常軟骨細胞(B系)各分為2組(n=24)，AⅠ組：單純培養(yǎng)基組；AⅡ組：加入姜黃素組；BⅠ組：單純培養(yǎng)基組；BⅡ組：加入姜黃素組。

1.3.2 姜黃素刺激軟骨細胞 將所培養(yǎng)的軟骨細胞以1×107/L、100 μL接種于96孔板中。24 h后待細胞貼壁，吸去培養(yǎng)液，加入姜黃素溶液(80 μmol/L )100 μL/孔，每組6復(fù)孔，以不含姜黃素的培養(yǎng)基為對照。繼續(xù)培養(yǎng)24 h取上清液待測。

1.3.3 上清液SOD、MDA、MMP-13和IL-6測定 檢測上述上清液，嚴格按照試劑盒說明書操作步驟，分別檢測上清液中SOD活性、MDA含量、MMP-13和IL-6水平。同條件重復(fù)3次實驗。

1.3.4 測定Nrf 2 mRNA及其蛋白表達水平 設(shè)計目的基因的上游引物為上游5'-TTCCTCTGCTGCCATTAGTCAGTC-3'，下游引物為5'-GCTCTTCCATTTCCGAGTCACTG-3'，擴增產(chǎn)物大小為215 bp。收集培養(yǎng)細胞，抽提總RNA，測定RNA 純度，并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈后進行PCR，用AB 7500型熒光定量PCR儀，β-actin 作為內(nèi)參基因，擴增程序：94 ℃變性3 min, 94 ℃30 s,57 ℃30 s,72 ℃30 s, 循環(huán)35次,最后一輪72 ℃延伸10 min，采用2-CT法計算其表達量相對值。

采用Western blot法檢測Nrf 2的蛋白表達水平。處理過的軟骨細胞用PBS清洗3次，加入預(yù)冷的裂解緩沖液，超聲處理至組織完全碎裂，14 000 r/min，在4 ℃的冰凍環(huán)境下離心收集上清液，BCA法測蛋白濃度。蛋白變性后上樣，經(jīng)蛋白分離及轉(zhuǎn)膜，分別采用封閉一抗和熒光二抗等過程，掃描記錄各條帶的積分光密度值(IOD)。以β-actin作為內(nèi)參照。

1.3.5 測定細胞核內(nèi)Nrf 2活性 姜黃素處理后的各組待測細胞吸取培養(yǎng)基，PBS清洗3次，4%甲醛室溫固定，PBS洗滌3次，3%過氧化氫(H2O2)浸泡以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS洗滌3次，5%牛血清白蛋白(BSA)室溫封閉，0.5%聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)處理5 min，PBS洗滌3次，加入兔抗Nrf 2一抗室溫孵育1 h，PBS洗滌3次，F(xiàn)ITC標記的山羊抗兔熒光標記的二抗室溫孵育2 h，PBS洗滌3次，用4，6-二脒基-2-苯基吲哚染料標記軟骨細胞核，PBS避光條件下清洗，熒光共聚焦顯微鏡下觀察，以熒光強度反映軟骨細胞核內(nèi)Nrf 2活性。

1.3.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。多組均數(shù)比較采用ANOVA，組間比較采用LSD檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 4組上清液中MMP-13、IL-6、SOD活性及MDA含量比較 見表1。

組 別MMP-13(pg/L)IL-6(pg/L)SOD(U/L)MDA(μmol/L)AⅠ組8411.14±1008.621010.36±118.2343.02±0.7115.27±0.75AⅡ組3425.98±2573.78△720.87±118.34△57.25±1.03△10.68±0.52△BⅠ組1008.58±377.97*△494.83±110.45*△61.14±0.94△9.37±0.41△BⅡ組950.66±188.34456.13±113.8663.12±1.107.73±0.53

與AⅠ組比較，*P<0.05；與AⅡ組比較，△P<0.05

由表1可見，BⅠ組、BⅡ組同為正常軟骨，經(jīng)姜黃素干預(yù)后，2組各個檢測項目之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。AⅠ組、AⅡ組同為關(guān)節(jié)炎軟骨，經(jīng)姜黃素干預(yù)后，2組4個檢測項目比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。AⅠ組與BⅠ組4個檢測項目比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；AⅡ組SOD活性、MDA含量與BⅠ組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但MMP-13、IL-6水平與BⅠ組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 4組Nrf 2 mRNA、Nrf 2蛋白表達水平及細胞核內(nèi)Nrf 2活性比較 見表2。

組 別Nrf2mRNANrf2蛋白表達水平核內(nèi)Nrf2活性AⅠ組0.37±0.13△0.11±0.12△98±11△AⅡ組1.14±0.17*△0.88±0.14*△167±15*△BⅠ組1.32±0.161.05±0.1567±13BⅡ組1.37±0.171.08±0.1375±12

與AⅠ組比較，*P<0.05；與BⅠ組比較，△P<0.05

由表2可見，與正常軟骨細胞組BⅠ組比較，炎癥軟骨細胞組AⅠ、AⅡ組的Nrf 2 mRNA及其蛋白表達水平下調(diào)(P<0.05)；與AⅠ組相比，經(jīng)姜黃素干預(yù)的AⅡ組Nrf 2 mRNA及其蛋白表達水平上調(diào)(P<0.05)。姜黃素對正常組干預(yù)后，BⅡ組與BⅠ組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。 AⅠ、AⅡ組與BⅠ組比較細胞核內(nèi)Nrf 2活性增強(P<0.05)；與AⅠ組相比， AⅡ組細胞核內(nèi)Nrf 2活性增強(P<0.05)。

3 討 論

近年來研究表明，氧化應(yīng)激學(xué)說在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。由于氧化應(yīng)激而產(chǎn)生過量的氧自由基，可以損傷軟骨基質(zhì)，抑制蛋白多糖的合成，引起軟骨細胞凋亡，從而使軟骨細胞大量減少，引發(fā)骨關(guān)節(jié)炎。從姜黃屬植物姜黃、莪術(shù)、菖蒲等根莖中提取的橙黃色酸性酚類物質(zhì)為姜黃素，有多種生物活性，包括止痛、散風(fēng)、活血等。研究表明，姜黃素具有抗動脈粥樣硬化、降血脂、抗氧化及抗腫瘤等作用，毒性低，具有良好的臨床應(yīng)用潛力。最近的研究表明，姜黃素可以抑制多種炎癥因子的分泌，同時具有抗氧化及抗炎作用，保護軟骨細胞，延緩軟骨退變[10-12]。

SOD是體內(nèi)自由基清除劑，其活力的高低反映機體清除氧自由基的能力，MDA是細胞生物膜上的不飽和脂質(zhì)被氧化后形成的代謝產(chǎn)物，所以培養(yǎng)液中MDA的水平可以間接反映軟骨細胞氧化應(yīng)激損傷的程度[13-15]。本實驗結(jié)果顯示，與正常軟骨細胞比較，骨關(guān)節(jié)炎的軟骨細胞MDA含量增多，SOD活性降低，說明骨關(guān)節(jié)炎與氧化應(yīng)激關(guān)系密切。骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞經(jīng)過姜黃素干預(yù)后SOD的活性明顯增加，MDA釋放量降低，提示姜黃素通過消除自由基，抑制過氧化反應(yīng)，可以糾正機體自由基異常代謝，抑制氧自由基引起的細胞和組織的炎癥損傷，使軟骨細胞退變延緩，對骨關(guān)節(jié)炎起治療作用。

軟骨細胞外基質(zhì)以蛋白聚糖和Ⅱ型膠原蛋白為主，是細胞賴以生成的重要內(nèi)環(huán)境，對維持軟骨細胞的生長分化及正常功能有重要作用?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是引起軟骨組織細胞外基質(zhì)降解的主要酶系，其可以降解蛋白聚糖和膠原，消化基質(zhì)成分，抑制細胞外基質(zhì)的修復(fù)，與骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨退行性變有直接而密切的聯(lián)系。MMP-13又稱為膠原酶3，可直接降解軟骨基質(zhì)中Ⅱ型膠原，是最有效的Ⅱ型膠原纖維降解酶[16]。IL-6 能趨化大量炎性細胞進入關(guān)節(jié)滑液，增強炎癥反應(yīng)，刺激擴大IL-1的炎性作用，抑制蛋白多糖的合成，加重軟骨退化，是參與骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病進程的重要細胞因子之一[17]。在本研究中，骨關(guān)節(jié)炎組軟骨細胞上清中IL-6 和MMP-13水平均顯著增高，提示IL-6和MMP-13均有可能參與骨關(guān)節(jié)炎的炎癥損傷和軟骨退變。經(jīng)姜黃素干預(yù)后，均明顯下降，提示姜黃素具有強大的抗炎、抗降解作用。

轉(zhuǎn)錄因子Nrf 2是調(diào)控細胞抗氧化響應(yīng)基因和諸多由ARE驅(qū)動的基因表達的核心分子，也是姜黃素發(fā)揮生物效應(yīng)的重要作用靶標[4，7]。生理狀態(tài)下，Nrf 2位于細胞質(zhì)中與Keapl處于結(jié)合態(tài)，當(dāng)細胞遭受氧化應(yīng)激損傷時，Nrf 2與Keapl解離，進而轉(zhuǎn)移入核，與ARE結(jié)合，啟動下游抗氧化酶的表達[18]。通過檢測Nrf 2 mRNA及其蛋白表達，以及其下游抗氧化酶的變化，可提示姜黃素對軟骨細胞的保護作用是否有Nrf 2-ARE信號通路的參與。在本研究中， AⅡ組Nrf 2 mRNA、蛋白及SOD的表達均較AⅠ組增高，說明姜黃素對軟骨細胞的保護作用有Nrf 2-ARE信號通路參與。

綜上所述，由氧自由基引起的氧化應(yīng)激參與了骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展，在骨關(guān)節(jié)炎患者的軟骨細胞中確實存在著氧化應(yīng)激反應(yīng)。姜黃素能提高軟骨細胞的SOD活性，提高氧自由基清除水平，部分糾正抗氧化應(yīng)激，有強大的抗炎、抗降解作用，對軟骨細胞具有保護作用，其作用機制可能與激活Nrf 2-ARE信號通路有關(guān)。

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(本文編輯：董軍杰)

Effects of curcumin on oxidative stress and the secretion of MMP-13 and IL-6 of chondrocytes in osteoarthritis patients

SONGYongzhou,TONGJiuhui,LIMing,etal.

DepartmentofOrthopedics,SecondHospitalAffiliatedtoHebeiMedicalUniversity,Hebei,Shijiazhuang050000

Objective To observe the effects of curcumin on oxidative stress and the secretion of matrix metalloproteinase 13 (MMP-13) and interleukin-16 (IL-6) of chondrocytes in osteoarthritis (OA) patients. Methods The chondrocytes from articular cartilage with OA and the normal articular cartilage were prepared and cultured in vitro. The chondrocytes were treated by curcumin for 24 h. The contents of MMP-13, IL-6 and malondialdehyde (MDA) and the activity of superoxide dismutase (SOD) were measured in all groups. The nuclear factor E2-related factor 2 (Nrf 2) mRNA and its protein expression were measured by real-time PCR and Western blot. The nuclear translocation of Nrf 2 was detected by Laser scanning confocal microscopy so as to investigate its intervention on inflammatory injury cells. Results There were significantly changes of SOD, MDA, MMP-13 and IL-16 after intervention of curcumin in OA chondrocytes group. As compared with normal chondrocytes group, the mRNA and protein expression of Nrf 2 in OA chondrocytes group were decreased, and the Nrf 2 activity in the nucleus was enhanced. The mRNA and protein expression of Nrf 2 after intervention in OA chondrocytes group were increased, and the Nrf 2 activity in the nucleus was enhanced. Conclusion The curcumin can partially correct oxidant stress of OA chondrocytes, reduce imflammation reaction, has protective effects of OA chondrocytes.

Osteoarthritis; Traditional Chinese herbs therapy; Curcumin; MMP-13; IL-6

10.3969/j.issn.1002-2619.2016.09.017

※ 項目來源：河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點課題(編號：20150666)

R282.710.7；R684.305.31

A

1002-2619(2016)09-1344-05

宋永周(1973—)，男，副教授，博士。從事骨關(guān)節(jié)退行性疾病的臨床研究工作。

2016-05-17)

△ 通訊作者：河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院骨科，河北 石家莊 050000

1 河北省石家莊市第三醫(yī)院骨科，河北 石家莊 050011