賈永鋒　朱金梅

探討細(xì)菌16S rRNA基因檢測(cè)對(duì)新生兒敗血癥早期診斷的意義

賈永鋒①朱金梅②

目的：探討細(xì)菌16S核糖體核糖核酸(16S rRNA)基因檢測(cè)對(duì)新生兒敗血癥早期診斷的意義。方法：對(duì)126例疑似新生兒敗血癥患兒的血標(biāo)本進(jìn)行16S rRNA基因聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)，并同時(shí)做血培養(yǎng)，比較分析兩種方法檢測(cè)細(xì)菌病原體的快速性、敏感性和特異性。結(jié)果：126例疑似新生兒敗血癥患兒的血標(biāo)本經(jīng)血培養(yǎng)檢測(cè)陽(yáng)性率為13.8%(17/126)；經(jīng)PCR檢測(cè)陽(yáng)性率為22.2%(28/126)，PCR檢測(cè)陽(yáng)性率明顯高于血培養(yǎng)檢測(cè)陽(yáng)性率，差異顯著(x2=10.234，P=0.004)。以血培養(yǎng)為“金標(biāo)準(zhǔn)”，PCR檢測(cè)靈敏度為88.2%(15/17)、特異度為88.1%(96/109)。從操作時(shí)間分析，血培養(yǎng)和PCR檢測(cè)的平均時(shí)間分別為(28.9±4.3)h和(7.5±1.2)h，PCR檢測(cè)速度明顯快于血培養(yǎng)。結(jié)論：細(xì)菌16S rRNA基因PCR檢測(cè)方法速度快、敏感性高且特異性強(qiáng)，不受抗生素的干擾，可為新生兒敗血癥的早期診斷提供可靠依據(jù)。

16S rRNA基因；新生兒敗血癥；早期診斷；聚合酶鏈反應(yīng)

[First-author’s address] Neonatology Department, Shangluo Central Hospital, Shangluo 721000, China.

新生兒敗血癥(septicemia of newborn)是新生兒常見(jiàn)疾病之一，指新生兒期致病菌經(jīng)各種途徑侵入其血循環(huán)系統(tǒng)，并在其中生長(zhǎng)繁殖、產(chǎn)生毒素，最終造成全身性的炎癥反應(yīng)[1]。該病的病因較復(fù)雜，常見(jiàn)致病菌有大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄菌、克雷白桿菌及B組鏈球菌等，主要通過(guò)宮內(nèi)感染、產(chǎn)時(shí)感染及產(chǎn)后感染[2]。新生兒時(shí)期該病的發(fā)生率和病死率均較高，但因缺乏典型的臨床表現(xiàn)和體征，往往病情進(jìn)展迅速，嚴(yán)重威脅新生兒的生命，故早期診斷明確病原菌與及時(shí)應(yīng)用有效抗菌藥物亦非常重要。

目前，臨床上的血培養(yǎng)檢測(cè)細(xì)菌常用方法由于檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，且陽(yáng)性率較低，難以達(dá)到早期診斷的目的[3]。聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)已被廣泛用于檢測(cè)細(xì)菌等微生物，并成為細(xì)菌16S核糖體核糖核酸(16S rRNA)基因檢測(cè)的重要方法[4-7]。為此，本研究對(duì)126例疑似新生兒敗血癥患兒的血標(biāo)本進(jìn)行細(xì)菌16S rRNA基因PCR檢測(cè)，旨在探討新生兒敗血癥快速、可靠的早期診斷方法，為臨床提供診斷依據(jù)。

1　資料與方法

1.1一般資料

參照中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科分會(huì)新生兒學(xué)組制定的《新生兒敗血癥診療方案》[8]診斷標(biāo)準(zhǔn)，選取2014年1月至2015年1月商洛市中心醫(yī)院新生兒科擬診斷的126例新生兒敗血癥患兒，其中男患兒79例、女患兒47例；年齡2 h至30 d。分別對(duì)所有患兒的血標(biāo)本進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)及細(xì)菌16S rRNA基因檢測(cè)，抽取每例患兒2 ml靜脈血做血培養(yǎng)，同時(shí)抽取1 ml靜脈血做細(xì)菌16S rRNA基因檢測(cè)。同期抽取25名正常新生兒相同血標(biāo)本做質(zhì)量控制，對(duì)照菌株為：大腸埃希菌(ATCC25923)、金黃色葡萄球菌(ATCC25922)由細(xì)菌室提供，分別選擇所有細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌及革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的16S設(shè)計(jì)合成三對(duì)共同引物，由上海細(xì)胞生物學(xué)研究所癌基因室合成。本研究使用BacT/ALERT 120全自動(dòng)血培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)。

1.2納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

(1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合診斷標(biāo)準(zhǔn)中擬診斷的新生兒敗血癥患兒；②未感染其他血液性疾病的患兒。

(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①檢測(cè)前已確診的新生兒敗血癥患兒；②抽取或檢測(cè)過(guò)程中受污染的血標(biāo)本。

1.3儀器設(shè)備

采用FTC-2000A型熒光定量PCR儀(西安賽維斯生物科技有限公司)；DYY-8C穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀(成都明萱電子科技有限公司)：2～600 V、1～200 mA，穩(wěn)流、穩(wěn)壓且連續(xù)可調(diào)，數(shù)顯，雙輸出，可同時(shí)帶2個(gè)電泳槽，用于常壓電泳；JD-801專業(yè)數(shù)碼凝膠成像與分析系統(tǒng)(南京瞰森儀器有限公司)；BacT/ALERT 120全自動(dòng)血培養(yǎng)系統(tǒng)(上海祥和科學(xué)技術(shù)有限公司)。

1.4操作方法

1.4.1血標(biāo)本DNA提取

(1)抗凝全血加PBS液，離心、棄上清。使用TE緩沖液[Tris鹽酸緩沖液中加入乙二胺四乙酸四鈉(EDTA)制成]、蛋白酶K溶液及10%的十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)溶液懸浮沉淀，于56 ℃水浴5 h。冷卻至4℃時(shí)，加入等體積的Tris-HCl(pH值8.0)酚，顛倒混勻，以10000 r/min的速度離心15 min，吸取上層水相。

(2)加入等體積氯仿和(或)異戊醇，顛倒混勻，4℃10000 r/min離心10 min。取上層水相加入10%體積的3 mol/L的乙酸鈉(pH值5.2)，混勻后，加入2.5倍體積的100%的乙醇，顛倒混勻，-20 ℃孵育過(guò)夜，4℃ 10000 r/min離心20 min，棄上清。

(3)去盡乙醇，加入70%的乙醇1 ml，混勻，4 ℃5000 r/min離心10 min，棄上清，室溫干燥10 min，至白色沉淀物周邊變白，加入20 μlTE緩沖液溶解，-20 ℃冰箱保存。

1.4.2細(xì)菌DNA提取

挑取菌落用TE緩沖液制成0.5 ml的懸浮液，加入100 μl溶菌酶溶液，于37 ℃孵育30 min，再加入10%的SDS液150 μl、20 μl蛋白酶K溶液，充分混勻后，于56 ℃孵育3 h至沉淀物完全溶解，震搖數(shù)次使之混勻。后續(xù)步驟同血標(biāo)本DNA的提取，同時(shí)以200 μl的TE緩沖液按上述方法提取后作為PCR操作的陰性對(duì)照。

1.4.3PCR反應(yīng)

用引物擴(kuò)增對(duì)照菌株：大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌，并用DNA提取過(guò)程中同步操作的TE緩沖液作為陰性對(duì)照，10×PCR緩沖液5 μl，4種dNTP混合物4μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，水生嗜熱菌(thermus aquaticus，Taq)DNA聚合酶0.5μl，模板2 μl，加入37.5 μl已消毒過(guò)濾的去離子水，混勻后離心數(shù)秒后按預(yù)變性95 ℃ 10 min、94 ℃ 45 s、60 ℃ 30 s以及72 ℃ 60 s參數(shù)擴(kuò)增，共35個(gè)循環(huán)，于72 ℃延伸10 min，置于4 ℃保存待檢。

1.4.4PCR結(jié)果判斷

使用瓊脂糖凝膠電泳判斷PCR產(chǎn)物中有無(wú)DNA。將混合物及DNA Marker加至樣品槽中，80 V電泳30 min，凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)中拍照并保留記錄，370 bp處有熒光者為陽(yáng)性。

1.5觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

觀察血標(biāo)本經(jīng)血培養(yǎng)與PCR檢測(cè)后的陽(yáng)性例數(shù)、兩種方法的檢測(cè)時(shí)間；計(jì)算兩種方法的檢測(cè)陽(yáng)性率；以傳統(tǒng)檢測(cè)的血培養(yǎng)為評(píng)價(jià)“金標(biāo)準(zhǔn)”，計(jì)算PCR檢測(cè)的靈敏度和特異度。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x-±s)表示，計(jì)數(shù)資料用率(%)表示。兩種方法的檢測(cè)結(jié)果采用配對(duì)x2檢驗(yàn)進(jìn)行差異性比較，a=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　 結(jié)果

(1)對(duì)126例疑似新生兒敗血癥患兒的血標(biāo)本進(jìn)行血培養(yǎng)檢測(cè)，其中陽(yáng)性率為13.8%(17/126)；經(jīng)PCR檢測(cè)，陽(yáng)性率為22.2%(28/126)，PCR檢測(cè)陽(yáng)性率明顯高于血培養(yǎng)檢測(cè)陽(yáng)性率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=10.234，P＜0.05)。以血培養(yǎng)為“金標(biāo)準(zhǔn)”，PCR檢測(cè)靈敏度和特異度分別為88.2%(15/17)和88.1%(96/109)，血培養(yǎng)與PCR法兩者的陽(yáng)性符合率為11.9%(15/126)，見(jiàn)表1。

表1　血培養(yǎng)與PCR方法檢測(cè)結(jié)果比較(例)

(2)兩種方法檢測(cè)28例正常對(duì)照者的血標(biāo)本均為陰性。從操作時(shí)間分析，血培養(yǎng)和PCR檢測(cè)的平均時(shí)間分別為(50.9±4.3)h和(7.5±1.2)h，PCR檢測(cè)速度明顯快于血培養(yǎng)；PCR產(chǎn)物的核酸電泳成像如圖1所示。

圖1　PCR產(chǎn)物核酸電泳成像圖

3　討論

16S rRNA基因是細(xì)菌上編碼rRNA相對(duì)應(yīng)的DNA序列，存在于所有細(xì)菌的基因組中，16S rRNA具有高度的保守性和特異性，且其基因序列足夠長(zhǎng)(包含約50個(gè)功能域)。隨著PCR技術(shù)的出現(xiàn)及核酸研究技術(shù)的不斷完善與發(fā)展，16S rRNA基因檢測(cè)技術(shù)已成為病原菌檢測(cè)和鑒定的一種強(qiáng)有力工具。相對(duì)于常規(guī)的血培養(yǎng)技術(shù)，PCR技術(shù)除了具有敏感性高、特異性強(qiáng)及檢測(cè)時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn)，其最大的優(yōu)勢(shì)是檢測(cè)結(jié)果不受血標(biāo)本中存在的各種抗菌藥物的干擾[9-12]。因此，該技術(shù)不僅能將常規(guī)血培養(yǎng)無(wú)法檢測(cè)的細(xì)菌識(shí)別出來(lái)，實(shí)現(xiàn)對(duì)病原菌快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行分類鑒定和檢測(cè)，還可以用于疑似某種感染性疾病并已采用某些抗菌藥物治療的患者[12]。

臨床上新生兒敗血癥早期往往缺乏特異的臨床癥狀及體征，主要表現(xiàn)為非特異性癥狀，包括精神差、反應(yīng)不佳、哭聲減弱無(wú)調(diào)以及奶欲減退等。因此，對(duì)該病的早期診斷必須依靠一定的檢測(cè)技術(shù)快速準(zhǔn)確地找到病原菌。目前，臨床上診斷新生兒敗血癥除血培養(yǎng)外，還有白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血小板計(jì)數(shù)、C反應(yīng)蛋白以及降鈣素原等非特異指標(biāo)檢測(cè)，但這些非特異指標(biāo)的檢測(cè)因本身?xiàng)l件的限制而存在缺陷，不能做到快速準(zhǔn)確地早期診斷。通常作為診斷“金標(biāo)準(zhǔn)”的血培養(yǎng)因陽(yáng)性率較低，且檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)也不能達(dá)到早期診斷的目的，故本研究采用細(xì)菌16S rRNA基因PCR檢測(cè)方法，對(duì)126例疑似新生兒敗血癥患兒的血標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，其陽(yáng)性率明顯高于血培養(yǎng)檢測(cè)的陽(yáng)性率，表明PCR檢測(cè)技術(shù)診斷陽(yáng)性率較高。

本研究檢測(cè)結(jié)果顯示，有13份血標(biāo)本PCR陽(yáng)性而血培養(yǎng)陰性，原因可能為血培養(yǎng)所用血標(biāo)本細(xì)菌濃度太低，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果為假陰性；入院前患者服用的抗生素抑制了細(xì)菌生長(zhǎng)，導(dǎo)致血培養(yǎng)結(jié)果為陰性。有2份血標(biāo)本血培養(yǎng)陽(yáng)性而PCR陰性，可能原因?yàn)椋貉獦?biāo)本本身無(wú)細(xì)菌，因血培養(yǎng)時(shí)被細(xì)菌污染而導(dǎo)致血培養(yǎng)為假陽(yáng)性；血標(biāo)本中含有PCR反應(yīng)酶的抑制劑導(dǎo)致PCR陰性。本研究結(jié)果表明，以血培養(yǎng)為“金標(biāo)準(zhǔn)”，PCR檢測(cè)技術(shù)靈敏度和特異度均較高。此外，從操作時(shí)間分析，PCR檢測(cè)速度明顯快于血培養(yǎng)。而本研究結(jié)果與國(guó)內(nèi)相關(guān)學(xué)者對(duì)16S rRNA基因PCR法的研究報(bào)道結(jié)果基本一致[13-16]。

綜上所述，細(xì)菌16S rRNA基因PCR法不僅具有速度快、敏感性高、特異性強(qiáng)以及檢測(cè)時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn)，且不受抗生素的干擾，臨床上可為新生兒敗血癥早期診斷提供快速和準(zhǔn)確的病原學(xué)依據(jù)。

[1]LeDoare K，Heath PT.An overview of global GBS epidemiology[J].Vaccine，2013，31：D7-12.

[2]中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)新生兒學(xué)組，中華醫(yī)學(xué)會(huì)中華兒科雜志編輯委員會(huì).新生兒敗血癥診療方案[J].中華兒科雜志，2003，41(12)：897-899.

[3]呂其軍，史太陽(yáng)，周芳，等.16S rRNA基因檢測(cè)在膿毒癥早期診斷中的研究進(jìn)展[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2016，26(10)：2395-2397.

[4]Wilson KH，Blitchington RB，Greene RC.Amplification of bacterial 16S ribosomal DNA with polymerase chain reaction[J].J Clin Microbiol，1990，28(9)：1942-1946.

[5]崔穎鵬，黃朱亮.細(xì)菌16S核糖體RNA基因檢測(cè)杰氏棒狀桿菌一株[J].中華診斷學(xué)電子雜志，2015，3(4)：296-298.

[6]王遠(yuǎn)明，杜惠容，陳恒，等.16S rRNA基因檢測(cè)對(duì)新生兒敗血癥診斷價(jià)值的Meta分析[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2012，9(24)：11-13.

[7]祝擷英，王立軍，張紅愛(ài).16S rRNA基因檢測(cè)在新生兒化膿性腦膜炎早期診斷中的應(yīng)用[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志，2012，41(10)：1389-1390.

[8]中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)新生兒學(xué)組，中華醫(yī)學(xué)會(huì)中華兒科雜志編輯委員會(huì).新生兒敗血癥診療方案[J].中華兒科雜志，2003，41(12)：897-899.

[9]郭盼，馬萍，王海龍，等.BD BACTEC 9120血培養(yǎng)儀聯(lián)合血清降鈣素原在血流感染診斷中的應(yīng)用[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)裝備，2015，12(10)：91-94.

[10]呂治，彭國(guó)麗，蘇建榮.細(xì)菌16S rRNA基因PCR診斷細(xì)菌性陰道病的研究[J].首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，33(2)：153-157.

[11]陳淑麗，茅雙根.新生兒敗血癥相關(guān)實(shí)驗(yàn)室診斷指標(biāo)的研究進(jìn)展[J].遼寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2016，37(2)：104-106.

[12]陳秉宇，呂火祥，謝一唯.血液細(xì)菌16SrRNA基因檢測(cè)的診斷價(jià)值[J].全科醫(yī)學(xué)臨床與教育，2007，5(5)：370-371，377.

[13]楊祖卿.16S rRNA基因在臨床上的應(yīng)用進(jìn)展[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)兒科學(xué)分冊(cè)，2005，32(4)：252-255.

[14]張勇，凌建英.16S rRNA基因在快速診斷新生兒敗血癥的病原菌研究[J].中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志，2014，22(1)：71-72.

[15]張樹(shù)芹.16S rRNA基因擴(kuò)增在新生兒敗血癥診斷中的研究[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2012，22(4)：744-746.

[16]葉麗君，喻長(zhǎng)法，段達(dá)榮，等.16S rRNA基因檢測(cè)在自發(fā)性腹膜炎快速診斷中的應(yīng)用價(jià)值[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2015，25(12)：1978-1979，1993.

Research significance about the detection of 16SrRNA gene in the early diagnosis of neonatal septicemia

JIA Yong–feng, ZHU Jin-mei// China Medical Equipment,2016,13(11):90-93.

Objective: To study the significance about the detection of 16SrRNA gene in the early diagnosis of neonatal septicemia. Methods: 126 cases with suspecting neonatal septicemia meningitis were collected. Every sample was detected with blood culture and 16SrRNA gene polymerase chain reaction (PCR) test, comparing testing rapidity, sensitivity and specificity of bacterial pathogens of two kinds of methods. Results: The tests positive rate of 126 cases suspecting neonatal septicemia with blood culture was 13.8% (17/126). PCR detection positive rate was 22.2% (28/126). PCR detection positive rate was significantly higher than blood culture positive rate, and the difference was statistically significant (McNemar=10.234, P=0.004). Taking blood culture as the “gold standard”, the sensitivity of PCR detection was 88.2% (15/17) and specificity was 88.1% (96/109). Analyzing the operating time, the average test time of blood culture and PCR detection was (28.9±4.3)h and (7.5±1.2)h respectively. The test speed of PCR detection was faster than blood culture. Conclusion: PCR detection method of the bacterial 16SrRNA gene is fast, and has high sensitivity and strong specificity. It is not affected by the antibiotics, and can provide reliable basis for the early diagnosis of neonatal septicemia.

16SrRNA gene; Neonatal septicemia; Early diagnosis; Polymerase chain reaction

賈永鋒,男,(1973- ),本科學(xué)歷，副主任醫(yī)師。商洛市中心醫(yī)院新生兒科，從事新生兒診療工作。

1672-8270(2016)11-0090-04

R722.131

A

10.3969/J.ISSN.1672-8270.2016.11.027

①商洛市中心醫(yī)院新生兒科 陜西 商洛 721000

②重慶市中醫(yī)院檢驗(yàn)科 重慶 400021

2016-08-29