趙佩文，王 新，吳逸飛，姚曉紅，柳 永，孫 宏，葛向陽，湯江武，*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070； 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)與微生物研究所，浙江 杭州 310021)

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不同碳源促進(jìn)污染水體氮素轉(zhuǎn)化的微生態(tài)過程

趙佩文1，2，王 新2，吳逸飛2，姚曉紅2，柳 永2，孫 宏2，葛向陽1，湯江武2，*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070； 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)與微生物研究所，浙江 杭州 310021)

在試驗(yàn)條件下，向氮污染河道水體中C/N按15∶1補(bǔ)加甲醇、乙醇、乙酸鈉、檸檬酸鈉、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、羧甲基纖維素鈉，檢測水體氨氮、亞硝酸鹽、硝酸鹽、總氮的變化，以及在此過程中水體細(xì)菌胞外酶活性、細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果顯示，除甲醇、羧甲基纖維素鈉外，補(bǔ)加有機(jī)碳源顯著降低了水體氨氮的含量，水體β-葡萄糖苷酶活性在碳源補(bǔ)加后快速增加，補(bǔ)加葡萄糖、蔗糖、麥芽糖的水體中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)明顯異于其他處理，表明添加有機(jī)碳源可顯著加快污染水體中氮素的轉(zhuǎn)化，水體微生物在此過程中起到關(guān)鍵作用。水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和代謝活性對不同類型有機(jī)碳源有著不同的響應(yīng)，因而添加不同有機(jī)碳源對水體氮素轉(zhuǎn)化具有不同的促進(jìn)作用。

有機(jī)碳源；污染水體；細(xì)菌群落；PCR-DGGE；細(xì)菌代謝活性

隨著我國工業(yè)化進(jìn)程的加快和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展，水環(huán)境污染加劇，對污染水體的修復(fù)和治理也成為相關(guān)研究的重要領(lǐng)域。生物修復(fù)技術(shù)具有環(huán)境友好、生態(tài)節(jié)能的優(yōu)點(diǎn)，是最具發(fā)展前景的水體原位修復(fù)技術(shù)，水體污染物的轉(zhuǎn)化、降解主要依賴微生物的作用，然而對于氮素污染水體而言，有機(jī)碳源的缺乏是水體氮素轉(zhuǎn)化、去除的主要限制性因素[1-4]。不同有機(jī)碳源用于污染水體的氮素去除在成本、環(huán)境效應(yīng)上具有顯著的差異，不少研究人員開展了篩選適合不同水體環(huán)境修復(fù)有機(jī)碳源的研究，取得了較好的效果[5-9]。微生物對不同有機(jī)碳源有著不同的生態(tài)效應(yīng)，補(bǔ)加碳源后微生物類群、群落結(jié)構(gòu)、代謝活性等的變化必將對微生物強(qiáng)化修復(fù)產(chǎn)生重要的影響，然而迄今為止對于這個微生態(tài)過程尚缺乏了解。為此，以氮污染河道水體為研究對象，初步探索不同種類有機(jī)碳源補(bǔ)加對水體氮素轉(zhuǎn)化、去除的微生態(tài)過程的影響，旨在為污染水體微生物強(qiáng)化修復(fù)技術(shù)的優(yōu)化、應(yīng)用提供有益參考。

1 材料與方法

1.1 供試水樣及試驗(yàn)方法

試驗(yàn)用水樣采集自杭州市城郊河道，采樣時水體溫度26.3℃，pH值7.38，溶解氧含量2.37mg·L-1，水體氨氮含量8.20mg·L-1，總氮含量8.49mg·L-1，CODMn23.0mg·L-1，總磷0.33mg·L-1，TOC 7.24mg·L-1。水樣分裝在編號1—9的試驗(yàn)水槽中，每個水槽裝入水量約200L。以試驗(yàn)水樣中氨氮含量為基準(zhǔn)，以15∶1的C/N將甲醇、乙醇、乙酸鈉、檸檬酸鈉、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)等分別加入1—8號水槽中，各種試劑的總添加量依次為：甲醇 55.3mL，乙醇40.0mL，乙酸鈉 56.2g，檸檬酸鈉67.0g，葡萄糖45.1g，蔗糖 39.0g，麥芽糖41.0g，CMC-Na 41.4g，以9號作為空白對照，試驗(yàn)環(huán)境溫度設(shè)置為24℃。河道中采集水樣的水質(zhì)和微生物指標(biāo)為各試驗(yàn)槽的起始值，水樣的采集時間分別為12、24、48h。

1.2 β-葡萄糖苷酶活性的測定

水體中β-葡萄糖苷酶活性的測定采用熒光模擬底物法(fluorogenic model substrates，F(xiàn)MS)，參照文獻(xiàn)[10-11]改進(jìn)后的測定方法進(jìn)行。每個樣品均測定3個平行樣，以平均值表示該水樣中β-葡萄糖苷酶的活性。

1.3 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

1.3.1 水樣細(xì)菌總DNA的提取

采集50mL水樣，用0.22μm微孔濾膜過濾收集菌體，濾膜用鋁箔包裹，液氮速凍后存于-20℃冰箱備測。提取DNA時，將收集了大量菌體的濾膜剪成碎片，然后采用MOBIO PowerWater?DNA Isolation Kit，參照試劑盒附帶的操作步驟，提取樣品中的DNA，獲得的DNA用Nanodrop 2000檢測后，存于-20℃冰箱備用。

1.3.2 基因片段的PCR擴(kuò)增和DGGE分析

用于DGGE分析的片段為細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)片段，所用引物為連有GC夾子的細(xì)菌341F和517R[12]，參考文獻(xiàn)[10-11]采用的方法，進(jìn)行16S rDNA V3區(qū)片段的擴(kuò)增和DGGE分析。所用的聚丙烯酰胺凝膠濃度為8%，變性梯度40%～60%。電泳完成后，PAGE膠用EB染色并用天能凝膠成像系統(tǒng)獲取DGGE圖譜，經(jīng)Quantity One-1-D軟件進(jìn)行數(shù)字化分析后，用Matlab軟件進(jìn)行矩陣和主成分分析。

1.3.3 主要細(xì)菌種類的測序分析

對DGGE凝膠中的主要條帶進(jìn)行切膠、PCR回收、克隆轉(zhuǎn)化，獲得載有16S rDNA V3區(qū)基因片段的陽性克隆，每個條帶獲得的陽性克隆隨機(jī)挑選3個進(jìn)行測序分析。獲得的序列結(jié)果在GenBank中進(jìn)行BLAST分析，選取相似序列，用MEGA 4.1軟件進(jìn)行比對后，以Neighbor-Joining法構(gòu)建主要細(xì)菌種類的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 分析方法

水樣中氨氮、亞硝酸鹽、硝酸鹽、總氮含量的測定，均采用對應(yīng)國家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，分別為HJ 536—2009、HJ/T 197—2005、HJ/T 346—2007、HJ 636—2012。水樣中TOC的測定采用耶拿N/C 3100型總有機(jī)碳測定儀，參照儀器提供的方法進(jìn)行測定，均測定3個平行。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one way ANOVA)，對有顯著差異的各處理采用Tukey法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 水體總有機(jī)碳和氮素含量的變化

有機(jī)碳源的加入，使得試驗(yàn)水體的總有機(jī)碳含量與對照組相比增加了15倍左右。在水體土著微生物的作用下，隨時間延長，總有機(jī)碳含量逐漸降低，其中，添加CMC-Na的試驗(yàn)水體中，微生物對總有機(jī)碳利用能力較差(圖1)。

添加有機(jī)碳源后，各處理的水體氨氮、亞硝酸鹽、硝酸鹽、總氮均發(fā)生了變化。不同有機(jī)碳源對氨氮的變化有著不同的影響，相較于對照組，除了添加甲醇、CMC-Na的試驗(yàn)水體外，氨氮含量在有機(jī)碳源添加之后均呈顯著下降趨勢，但降至一定值之后呈平穩(wěn)趨勢。添加葡萄糖、蔗糖和麥芽糖的試驗(yàn)水體中，氨氮含量在12h后迅速從8.2mg·L-1降低至3.2mg·L-1以下，去除率超過60%，顯著優(yōu)于添加其他碳源的試驗(yàn)水體(圖1)。和氨氮含量的變化趨勢相反，各試驗(yàn)水體中亞硝酸鹽的含量在添加有機(jī)碳源12h后迅速升到高點(diǎn)，然后呈下降趨勢(圖1)。添加不同種類碳源對水體硝酸鹽含量變化的影響不同，添加乙酸鈉、葡萄糖、麥芽糖處理的水體中硝酸鹽的含量在12h內(nèi)顯著升高，在12—24h呈下降趨勢，但在24h后與添加其他各類碳源的處理一樣呈升高趨勢(圖1)。相較于對照組，添加有機(jī)碳源的各試驗(yàn)水體中總氮含量均呈顯著的下降趨勢，其中，加入乙酸鈉、檸檬酸鈉、葡萄糖、蔗糖的水體中48h后總氮去除率為19.0%～21.3%，顯著高于其他處理(圖1)。

圖1 添加有機(jī)碳源后試驗(yàn)水體中總有機(jī)碳、氨氮、亞硝酸鹽、硝酸鹽、總氮含量的變化Fig.1 Variation of total organic carbon，ammonia，nitrite，nitrate，total nitrogen in experimental waters after addition of different organic carbon

2.2 水體β-葡萄糖苷酶活性的變化

β-葡萄糖苷酶是水體細(xì)菌轉(zhuǎn)化、利用碳源的關(guān)鍵胞外酶，是細(xì)菌生態(tài)活性和功能的重要指標(biāo)。試驗(yàn)水體中添加檸檬酸鈉、葡萄糖、蔗糖之后，β-葡萄糖苷酶活性相較于對照組顯著上升，添加其他碳源的水體中的β-葡萄糖苷酶活性在12h之后開始顯著上升，在24h達(dá)到高點(diǎn)后開始下降，其中添加檸檬酸鈉的水體中β-葡萄糖苷酶活性在24h最高，達(dá)2.73μmol·L-1·h-1。上述結(jié)果表明，補(bǔ)加的有機(jī)碳源對水體中細(xì)菌活性有明顯的促進(jìn)作用，其中，尤以添加檸檬酸鈉、葡萄糖、蔗糖對水體β-葡萄糖苷酶活性的促進(jìn)效果為好(圖2)。

2.3 水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化

應(yīng)用PCR-DGGE技術(shù)分析添加有機(jī)碳源后水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化，圖3泳道中的不同條帶表示不同種細(xì)菌OTU，條帶亮度的變化可一定程度反映出不同細(xì)菌OTU的量的變化?？梢钥闯?，從添加碳源后12h開始，細(xì)菌群落即發(fā)生變化。主成分分析結(jié)果在二維圖中客觀顯示了細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化，添加葡萄糖、蔗糖、麥芽糖顯著影響水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，與其他處理差異明顯。外源有機(jī)碳源加入一段時間之后，水體中細(xì)菌群落處于相對穩(wěn)定的狀態(tài)(圖4)。對DGGE圖譜中的主要條帶進(jìn)行切膠回收、克隆、測序，通過系統(tǒng)發(fā)育分析顯示試驗(yàn)水體中細(xì)菌的主要種類和多樣性(圖5)，代表不同細(xì)菌OTU的條帶在不同采樣時間的變化，是不同種類細(xì)菌對水體環(huán)境條件，尤其是碳源加入響應(yīng)的結(jié)果。

圖2 添加有機(jī)碳源后試驗(yàn)水體中葡萄糖苷酶活性的變化Fig.2 Variation of β-D-glucosidase activity in experimental waters after addition of different organic carbon

C為對照，泳道上方數(shù)字1—8代表添加碳源分別為甲醇、乙醇、乙酸鈉、檸檬酸鈉、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和CMC-Na；泳道標(biāo)記的連字符后數(shù)字1、2、3分別代表12、24、48h取樣。C-0為初始對照。圖4同。C，Control; 1-8in front of each line represented methanol，ethanol，sodium acetate，sodium citrate，glucose，sucrose，maltose，and CMC-Na，respectively.The number 1，2，3followed by “-” represented sample time of 12，24，48h.C-0were initial samples of control.The same as in Fig.4

通過分析發(fā)現(xiàn)，尚未能培養(yǎng)的一株γ-proteobacterium細(xì)菌(圖3中Band 5)對葡萄糖、果糖、麥芽糖較為敏感，該菌在添加葡萄糖、果糖、麥芽糖48h后在細(xì)菌群落中的豐富度分別為28.5%、39.1%和42.0%。分別屬于Flavobacterium (圖3中Band 1)、Acinetobacter(圖3中Band 2、Band 4)的細(xì)菌則可能對醇類和有機(jī)酸鹽類比較敏感，屬于Flavobacterium(圖3中Band 1)的細(xì)菌在添加乙醇和乙酸鈉48h后在細(xì)菌群落中的豐富度分別為30.4%和29.9%。

圖4 添加有機(jī)碳源后水體中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化的PCA分析結(jié)果Fig.4 PCA of bacterial community structure based on DGGE profiles

圖5 試驗(yàn)水體中主要菌群的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of main bacteria in experimental waters

3 討論

長期以來，人類生產(chǎn)和生活產(chǎn)生的活性氮大量向水體釋放，已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出水體氮的生物地球化學(xué)循環(huán)的載荷，使地表水氮素累積，引起富營養(yǎng)化。氨氮是最易流失于水體的氮素，且由于氨氧化過程的限制，易于在水體積累，是影響水體水質(zhì)的主要污染物。自然水體中氮的循環(huán)受限于氨氧化和反硝化兩個過程，主要依賴微生物的作用[1，13]。由于氨氮在多數(shù)污染水體中的積累，使得水體C/N較低，嚴(yán)重影響微生物對水體氮素的利用和轉(zhuǎn)化。因此，在水體生物修復(fù)體系中，添加有機(jī)碳源是一種重要的促進(jìn)氮循環(huán)的方式。當(dāng)前研究和應(yīng)用中，常用于補(bǔ)充碳源的有碳含量較高的污水[3，14-15]、低分子碳水化合物[2，16-17]和天然有機(jī)質(zhì)[6，9，18-19]等。本研究中選用的有機(jī)碳源是常見的低分子碳水化合物，添加有機(jī)碳源后可顯著加快污染水體中氮素的轉(zhuǎn)化，但不同種類的有機(jī)碳源影響氮素轉(zhuǎn)化的效率不同，其中，添加葡萄糖、蔗糖和麥芽糖后，氨氮去除率超過60%，總氮去除率在19.0%～21.3%之間。以氮素轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵步驟——氨氮的變化為例，添加葡萄糖、蔗糖和麥芽糖對氨氮去除效果明顯，盡管在氨氮含量降低的同時，亞硝酸鹽含量升高，總氮含量降低，但從數(shù)量的變化來看，添加有機(jī)碳源后氨氮的轉(zhuǎn)化中同化作用占主導(dǎo)地位。這表明水體中微生物對有機(jī)碳源利用的選擇性是導(dǎo)致不同水體氮素含量變化差異的主要原因。

水環(huán)境中微生物對溶解有機(jī)物的轉(zhuǎn)化、利用需要經(jīng)過細(xì)菌胞外酶的作用，因而細(xì)菌胞外酶活性是水體細(xì)菌的活性和功能的重要指標(biāo)，是一個重要的水環(huán)境生態(tài)參數(shù)[10-11]。由于環(huán)境中微生物的群體屬性，細(xì)菌胞外酶活性的變化也是細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和功能變化的外在表現(xiàn)。添加有機(jī)碳源之后，試驗(yàn)水體中的β-葡萄糖苷酶活性快速升高，意味著微生物活性快速升高，24h后隨著可利用碳源的消耗，β-葡萄糖苷酶活性逐漸降低。水體中氮素變化的過程與β-葡萄糖苷酶活性的變化也有著一定的對應(yīng)關(guān)系，這也可以進(jìn)一步證實(shí)，添加的有機(jī)碳源促進(jìn)了水體中微生物的變化，進(jìn)而影響水體氮素的變化。

水體微生物在氮素轉(zhuǎn)化過程中起到關(guān)鍵作用，其功能變化與群落結(jié)構(gòu)的變化是相適應(yīng)的。有機(jī)碳源的添加是一個改變水體微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)鍵因素，進(jìn)而引發(fā)不同的生態(tài)效應(yīng)。本研究結(jié)果表明，葡萄糖、蔗糖、麥芽糖對水體中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響與其他有機(jī)碳源有明顯差異，這種差異可能是水體中微生物對不同類型有機(jī)碳源利用的選擇性所致。DGGE圖譜中不同的優(yōu)勢條帶代表不同種對環(huán)境變化響應(yīng)的優(yōu)勢細(xì)菌，如試驗(yàn)水體中尚未能培養(yǎng)的一株γ-proteobacterium細(xì)菌，對葡萄糖、果糖、麥芽糖較為敏感，而分別屬于Flavobacterium、Acinetobacter的細(xì)菌則可能對醇類和有機(jī)酸鹽類比較敏感，這些細(xì)菌在整個群落的結(jié)構(gòu)和功能變化中起到重要作用。這表明，水體中可能存在許多尚未發(fā)現(xiàn)的選擇性利用碳源的微生物，而這些微生物在一定的有利因素下具有較好的氮素轉(zhuǎn)化、去除的作用。本研究中添加有機(jī)碳源影響水體氮素轉(zhuǎn)化和細(xì)菌群落變化的過程，事實(shí)上就是碳源促進(jìn)某類微生物生長，導(dǎo)致水體微生物群落結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化，從而快速轉(zhuǎn)化氮素的過程。

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(責(zé)任編輯 高 峻)

Microbial ecological process of nitrogen transformation accelerated by different organic carbon in polluted water

ZHAO Pei-wen1，2，WANG Xin2，WU Yi-fei2，YAO Xiao-hong2，LIU Yong2，SUN Hong2，GE Xiang-yang1，TANG Jiang-wu2，*

(1.CollegeofLifeScienceandTechnology，HuazhongAgriculturalUniversity，Wuhan430070，China; 2.InstituteofPlantProtectionandMicrobiology，ZhejiangAcademyofAgriculturalScience，Hangzhou310021，China)

In the present study，methanol，ethanol，sodium acetate，sodium citrate，glucose，sucrose，maltose，and CMC-Na was added in nitrogen-polluted urban river water with C/N of 15∶1.Variation of ammonia，nitrite，nitrate，total nitrogen were detected by national standard method，β-glucosidase activity were determined using the fluorogenic model substrates，and the change of bacterial community structure were analyzed by PCR-DGGE.It was shown that contents of ammonia decreased significantly after organic carbon sources addition except methanol or CMC-Na.Addition of organic carbon sources increased β-glucosidase activity.Bacterial community structure differed obviously with addition of glucose，sucrose and maltose.The results indicated that addition of organic carbon could accelerate transformation of nitrogen in the nitrogen-polluted water，in which microbes played key role.Bacterial community and metabolic activity had different responses to varied organic carbons，which would lead to different strength on nitrogen transformation acceleration.

organic carbon; polluted water; bacterial community; PCR-DGGE; bacterial metabolic activity

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.11.17

2016-03-14

浙江省公益技術(shù)應(yīng)用研究項目(2015C33046)；浙江省重大科技專項重點(diǎn)社發(fā)項目(2015C03004)；浙江省農(nóng)科院創(chuàng)新提升工程項目；溫州市水體污染控制與治理科技創(chuàng)新項目(S20140021)

趙佩文(1991—)，女，湖北武漢人，碩士研究生，主要研究方向?yàn)槲⑸锷鷳B(tài)學(xué)。E-mail: 332726781@qq.com

*通信作者，湯江武，E-mail: tangjiangwu@sina.com

Q938.1

A

1004-1524(2016)11-1915-07

浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報ActaAgriculturaeZhejiangensis，2016，28(11): 1915-1921

http://www.zjnyxb.cn趙佩文，王新，吳逸飛，等.不同碳源促進(jìn)污染水體氮素轉(zhuǎn)化的微生態(tài)過程[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2016，28(11)： 1915-1921.