謝 放，常黎明，李建宏，張 育，張亞軍，劉 帥

(蘭州交通大學(xué) 化學(xué)與生物工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

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中國被毛孢有性發(fā)育啟動前后cDNA文庫的構(gòu)建

謝 放，常黎明，李建宏，張 育，張亞軍，劉 帥

(蘭州交通大學(xué) 化學(xué)與生物工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

構(gòu)建了中國被毛孢有性發(fā)育啟動前后的cDNA文庫。采用Total RNA Kit Ⅰ法提取總RNA，磁珠法分離mRNA，反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA。獲得的cDNA經(jīng)蛋白酶K與SfiⅠ消化酶切并純化，連接到載體pUC19上，采用電轉(zhuǎn)化法將其轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞DH-5α中。之后測定文庫的克隆數(shù)、重組率、插入片段大小。結(jié)果顯示，文庫1含1.09×106個重組體，藍(lán)白斑實驗顯示重組率為92.5%；文庫2含1.13×106個重組體，藍(lán)白斑實驗顯示重組率為92%；兩文庫重組DNA片段的大小范圍均在500～2000bp。說明本試驗中所提取的 RNA 其純度很好，完全可以達(dá)到后續(xù)研究的要求。

中國被毛孢；有性發(fā)育；cDNA文庫

冬蟲夏草Ophiocordycepssinensis(Berk.) G.H.Sung，J.M.Sung，Hywel-Jones &Spatafora是我國青藏高原所特產(chǎn)的一種珍稀中藥材，因獨特藥用價值和產(chǎn)地生態(tài)條件的特殊性[1-2]，賦予其極高的經(jīng)濟(jì)價值，近年來，市場價格更是飆升到相當(dāng)于黃金的程度。自20世紀(jì)80年代起，我國學(xué)者就對冬蟲夏草進(jìn)行了廣泛的研究，如沈南英等[3]最早分離出該菌種并研究了冬蟲夏草的菌絲的生長特性；本課題組從冬蟲夏草蟲體上分離出一株真菌并對它的生長特性及其與冬蟲夏草菌的相互關(guān)系進(jìn)行了研究[4]；梁宗琦等[5]對冬蟲夏草子囊孢子的發(fā)育進(jìn)行了觀察研究，揭示了子囊孢子發(fā)育過程的特點和規(guī)律；莫名和等[6]、劉作易等[7]分別對冬蟲夏草的微循環(huán)產(chǎn)孢和子囊孢子的發(fā)育過程進(jìn)行了研究；此外，李黎等[8]對子囊孢子的發(fā)育與彈射、李玉玲[9]對青海玉樹冬蟲夏草子囊孢子的生長發(fā)育進(jìn)行觀察研究；焦彥朝等[10]將冬蟲夏草的生物活性物質(zhì)及其藥用作用進(jìn)行了系統(tǒng)綜述。但是，由于中國被毛孢人工培養(yǎng)技術(shù)的限制，前人對其研究幾乎都是從細(xì)胞學(xué)、形態(tài)學(xué)等方面進(jìn)行的，是靜態(tài)的分析測定，沒有與生長發(fā)育相聯(lián)系。對于冬蟲夏草菌——中國被毛孢Hirsutellasinensis子實體發(fā)育的規(guī)律，國內(nèi)外目前仍是空白，而解決這一問題，將有助于了解冬蟲夏草發(fā)育的奧秘，同時對最終實現(xiàn)人工栽培也具有十分重要的意義。本課題組利用自己分離出的甘肅產(chǎn)地的菌種，成功地在培養(yǎng)基上培育出了冬蟲夏草子實體，其形態(tài)與天然子實體相同，經(jīng)多代轉(zhuǎn)接，反復(fù)試驗，均能穩(wěn)定地形成子實體。這一突破為中國被毛孢子實體發(fā)育規(guī)律的研究奠定了基礎(chǔ)。

cDNA文庫在研究某類特定細(xì)胞中基因組的表達(dá)狀態(tài)以及在表達(dá)基因的功能鑒定方面具有特殊的優(yōu)勢，從而使它在個體發(fā)育[11]、細(xì)胞分化、細(xì)胞周期調(diào)控等方面的研究中備受研究者青睞。本研究以課題組[12]已經(jīng)獲得的中國被毛孢子實體人工培養(yǎng)技術(shù)為基礎(chǔ)，分別在子實體發(fā)育前和子實體發(fā)育原基期取樣并構(gòu)建cDNA文庫，旨在為進(jìn)一步研究其發(fā)育的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌種分離自甘肅冬蟲夏草主產(chǎn)地甘南榨油溝產(chǎn)冬蟲夏草子實體；已經(jīng)結(jié)合DNA序列比對研究鑒定為中國被毛孢H.sinensis.X.J.Liu[13]，經(jīng)本課題組特殊培養(yǎng)處理，令其在人工培養(yǎng)基上產(chǎn)生子實體[12]，分別在子實體發(fā)育前(1號樣品)和子實體發(fā)育原基期(2號樣品)取樣 (圖1)。

A，子實體發(fā)育前菌落；B，形成中的子實體原基A，Colony before the fruiting body development; B，The formating primordia of the fruiting body

1.2 試劑及儀器

1.2.1 主要試劑

Total RNA KitⅠ(Omega)；PolyATtractmRNA Isolation System Ⅲ(Promega)；SMART cDNA Library Construction Kit(Clontech)；QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen)；Advantage 2Polymerase Mix(Clontech)；SfiⅠ(NEB)；DL2000Marker(TaKaRa).

1.2.2 主要儀器及耗材

臺式離心機(jī)Centrifuge 5418R(eppendorf)；PCR儀MyCycler(Bio-rad)；電泳儀HE-120(Tanon)；凝膠成像儀2500(Tanon)；紫外分光光度計Nano Drop 2000(Thermo)；各型號tip，離心管(Axygen)。

1.3 方法

1.3.1 RNA提取

Total RNA KitⅠ試劑盒提取，分別進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳和紫外分析測定。瓊脂糖凝膠電泳采用1%瓊脂糖凝膠濃度，120V電壓15min。

1.3.2 mRNA的分離

采用PolyATtractmRNA Isolation System Ⅲ(磁珠法)分離純化mRNA，取mRNA溶于60μL DEPC水中，取6μL測D值，確定其含量。

1.3.3 cDNA第一鏈合成

(1)在0.2mL PCR管中依次加入總RNA(1μg)，SMART Ⅳ Oligonucleotide(1μL)，CDS Ⅲ/3′ PCR Primer(1μL)，ddH2O(2μL)構(gòu)成5μL反應(yīng)體系；(2)72℃溫浴2min；(3)冰浴2min，離心后依次加入5×First-Strand Buffer(2μL)，20mmol·L-1DTT(1μL)，10mmol·L-1dNTP Mix (1μL)，PowerScript Reverse Transcriptase(1μL)構(gòu)成5μL反應(yīng)體系；(4)42℃溫浴1h。

1.3.4 LD-PCR

(1)將PCR儀預(yù)熱到95℃；(2)在0.2mL反應(yīng)管中依次加入cDNA第一鏈產(chǎn)物(2μL)，ddH2O(80μL)，10×Advantage 2PCR Buffer (10μL)，CDS Ⅲ/3′ PCR Primer(2μL)，50×dNTP Mix(2μL)，5′ PCR Primer(2μL)，50×Advantage 2Polymerase Mix(2μL)構(gòu)成100μL反應(yīng)體系；(3)1000r·min-1離心1min后放至已預(yù)熱的PCR儀中；(4)PCR程序設(shè)置：95℃預(yù)變性1min，95℃變性15s，66℃退火20s，72℃延伸1min，18個循環(huán)后72℃延伸4min。

1.3.5 蛋白酶K消化

(1)每50μL擴(kuò)增的雙鏈cDNA中加入20μL蛋白酶K(20μg·μL-1)；(2)混勻并短暫離心；(3)45℃溫浴20min，離心30s；(4)加入等體積酚/氯仿/異戊醇混合液劇烈振蕩2min；(5)14000r·min-1離心5min；(6)收集上層液體到另一干凈的離心管中，棄去中間層和下層溶液；(7)加入等體積的氯仿/異戊醇混合液劇烈振蕩1～2min；(8)14000r·min-1離心5min；(9)收集上層液體到另一干凈的離心管中，棄去中間層和下層溶液；(10)加入1/10體積的3mol·L-1乙酸鈉，2.5倍體積95%的室溫乙醇，室溫條件下于14000r·min-1離心20min；(11)棄上清，用100μL 80%乙醇洗沉淀物；(12)空氣干燥沉淀物約10min；(13)加85μL去離子水溶解沉淀；(14)取5μL樣品電泳檢測。

1.3.6 SfiⅠ消化

(1)在1.5mL離心管中依次加入2μg ds-cDNA (79μL)，10×Sfi Buffer(10μL)，SfiⅠ(10μL)，100×BSA(1μL)構(gòu)成100μL反應(yīng)體系；(2)充分混勻，50℃溫浴2h。

1.3.7 酶切cDNA純化

(1)加入等體積酚/氯仿/異戊醇混合液劇烈振蕩2min；(2)14000r·min-1離心5min；(3)收集上層液體到另一干凈的離心管中，棄去中間層和下層溶液；(4)加入等體積的氯仿/異戊醇混合液劇烈振蕩2min；(5)14000r·min-1離心5min；(6)收集上層液體到另一干凈的離心管中，棄去中間層和下層溶液；(7)加入1/10體積的3mol·L-1乙酸鈉，2.5倍體積95%的室溫乙醇，室溫條件下立即14000r·min-1離心20min；(8)棄去上清，用100μL 80%乙醇洗沉淀物；(9)空氣干燥沉淀物約10min；(10)加100μL去離子水溶解沉淀。

1.3.8 cDNA 與pUC19載體連接

在0.2mL PCR管中依次加入ds-cDNA 5μL，50ng·mL-1Vector 1μL，10×Ligation Buffer 1μL，10mmol·L-1ATP 1μL，T4DNA Ligase 1μL，ddH2O 1μL構(gòu)成10μL體系后4℃反應(yīng)過夜(所用克隆載體為pUC19的改造載體)。

1.3.9 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化

(1)取200μL感受態(tài)宿主菌(DH-5α)，放置冰上融化；(2)加入上述1μL連接液，輕輕混勻后置于冰上30min；(3) 42℃水浴熱休克90s，迅速放入冰上2min；(4)加入300μL SOC培養(yǎng)基(不含抗生素)，置于37℃搖床，轉(zhuǎn)速200r·min-1，復(fù)蘇45min；(5)菌液涂布于15cm培養(yǎng)皿上(Apr-IPTG/x-gal LB固體培養(yǎng)基)，37℃過夜培養(yǎng)。

1.3.10 文庫克隆鑒定

(1)挑克隆，37℃，200r·min-1培養(yǎng)過夜，取1μL菌液作為PCR模板，在PCR管中依次加入10×PCR Buffer 2.5μL，50×dNTP Mix 0.5μL，引物M13F:5’-GGT AAC GCC AGG GTT TTC C-3’；M13R:5’-CAG GAA ACA GCT ATG ACC-3’各0.5μL，rTaq0.5μL，PCR模板1.0μL，ddH2O 19.5μL構(gòu)成25μL反應(yīng)體系；(2)輕拍混勻各組分，1000r·min-1離心1min后放至已預(yù)熱的PCR儀中；(3)PCR程序設(shè)置：94℃預(yù)變性3min，94℃變性30s，68℃退火30s，72℃延伸1min，36個循環(huán)后72℃延伸5min；(4)從各管中分別取5μL電泳檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA抽提、純化及質(zhì)檢

如表1和圖2所示：測定1號樣品(M1)總RNA的D260/D280=2.14，計算濃度為0.0277μg·μL-1瓊脂糖凝膠電泳總RNA顯示28S和18S兩條帶，亮度比例約2∶1，分離純化的mRNA測D值，計算濃度為100μg·mL-1；測定2號樣品(M2)總RNA的D260/D280=1.96，計算濃度為0.0163μg·μL-1。瓊脂糖凝膠電泳總RNA顯示28S和18S兩條帶，亮度比例約2∶1，但2號樣品相應(yīng)條帶的總亮度較1號樣品明顯降低，分離純化的mRNA測D，計算濃度為100μg·mL-1。在28S和18S核糖體帶之間一般可以看到一片彌散的EB染色物質(zhì)，可能是由mRNA和其他異型RNA組成。

2.2 cDNA合成檢測

取產(chǎn)物于10g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測如圖3，可見分布在500bp以上呈長瀑布狀條帶，顯示cDNA smear較長。

2.3 計算菌落數(shù)及重組率

構(gòu)建的文庫進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，如圖4。1號文庫共有菌落數(shù)為1098個，其中藍(lán)斑82個，重組率為92.5%，2號文庫菌落數(shù)為1132個，其中藍(lán)斑91個，重組率為92%。

2.4 文庫檢測

取5μL子座部分cDNA電轉(zhuǎn)化后的菌液涂布平板，37℃過夜培養(yǎng)后1號文庫共長了1090個單菌落，轉(zhuǎn)化后共得1000μL菌液，所以庫容為1.09×106。2號文庫共長了1130個單菌落，轉(zhuǎn)化后共得1000μL菌液，所以庫容為1.13×106。兩個文庫分別挑取24個克隆做PCR后接著做瓊脂糖凝膠電泳鑒定，插入片段鑒定電泳結(jié)果如圖5。從圖5可知，1號文庫的插入片段的大小范圍在500～2000bp之間，達(dá)到了cDNA文庫構(gòu)建要求[14]。

表1 RNA檢測結(jié)果
Table 1 RNA test results

樣本Sample濃度Concentration/(μg·μL-1)D260/D280體積Volume/L總量Amount/μgM10.02772.14401.1M20.01631.96400.7

圖2 RNA電泳圖Fig.2 RNA electrophoresis gel image

所用marker為TaKaRa公司的DL2000，從上到下條帶依次為2000、1000、750、500、250、100bpThe size of Marker from top to bottom is 2000，1000，750，500，250and 100bp，respectively

圖4 1號(A)和2號(B)cDNA文庫藍(lán)白斑結(jié)果Fig.4 The results of the blue and white test for cDNA library 1and library 2

3 討論

基因序列是基因研究的基礎(chǔ)，而基因?qū)＠麆t是基因產(chǎn)業(yè)的基礎(chǔ)。因而，基因資源是國際上爭奪的重要戰(zhàn)略資源。那么中藥基因資源的保護(hù)與開發(fā)，對未來中藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展關(guān)系重大。有關(guān)冬蟲夏草的研究多集中于活性組分和藥理特性的研究，而對于功能基因的研究，目前僅見于Zhang等[15]的工作。因此，冬蟲夏草相關(guān)功能基因的研究已成為一項非常迫切的任務(wù)，而cDNA文庫技術(shù)又是功能基因研究的基礎(chǔ)，本研究只針對有性發(fā)育過程cDNA文庫構(gòu)建的方法做了闡述，而對于其深層次生物信息的挖掘，有待進(jìn)一步的研究。對于冬蟲夏草cDNA文庫的研究，劉燕南等[16]、馮輝[17]曾分別將子座部分和菌核部分構(gòu)建了兩個cDNA文庫，然而，其所用材料為野生冬蟲夏草，對于人工條件下子實體的發(fā)育過程和發(fā)育機(jī)理仍然是空白，本研究首次以人工培養(yǎng)的子實體為材料，構(gòu)建cDNA文庫，旨在為進(jìn)一步揭示冬蟲夏草發(fā)育規(guī)律和次級代謝產(chǎn)物發(fā)育基因奠定基礎(chǔ)。

所用marker為TaKaRa公司的DL2000，從上到下條帶依次為2000、1000、750、500、250、100bpMarker for TaKaRa DL2000，from top to bottom with the following sequence is 2000，1000，750，500，250and 100bp，respectively

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(責(zé)任編輯 張 韻)

Construction of cDNA libraries from Hirsutella sinensis before and after sexual development

XIE Fang，CHANG Li-ming，LI Jian-hong，ZHANG Yu，ZHANG Ya-jun，LIU Shuai

(SchoolofChemicalandBiologicalEngineering，LanzhouJiaotongUniversity，Lanzhou730070，China)

The cDNA libraries were constructed fromHirsutellasinensisbefore and after the sexual development，respectively.Total RNA KitⅠ method was used to extract total RNA.The mRNA was separated by magnetic particles，and then double stranded cDNA was synthesized by reverse transcription.The obtained cDNA was purified by proteinase K andSfiⅠdigestive enzymes and connected to the carrier pUC19，then transferred into strain DH-5α with competent cells，by electrotransformation.Afterwards，the clone number，reconstruction ratio and the size of the insert fragment of the library were measured.The results showed that library 1contained 1.09×106recombinants，the blue and white test showed the reconstruction ratio was 92.5%，library 2contained 1.13×106recombinants，and the blue and white test showed the reconstruction ratio was 92%.The size of reconstructed DNA fragments in two libraries ranged from 500to 2000bp.It showed that RNA extracted in this experiment had good purification degree，which was enough to meet the requirements for subsequent research.

Hirsutellasinensis; sexual development; cDNA library

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.11.14

2016-03-16

國家自然科學(xué)基金項目(215069)

謝放(1962—)，男，甘肅蘭州人，副教授，研究方向為資源與環(huán)境微生物。 E-mail: xfrankf@163.com

Q93

A

1004-1524(2016)11-1895-06

浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報ActaAgriculturaeZhejiangensis，2016，28(11): 1895-1900

http://www.zjnyxb.cn

謝放，常黎明，李建宏，等.中國被毛孢有性發(fā)育啟動前后cDNA文庫的構(gòu)建[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2016，28(11)： 1895-1900.