甕巧云，趙彥敏，張 賀，宋晉輝，馬海蓮，袁進成，劉穎慧，*

(1.河北北方學(xué)院 農(nóng)林科技學(xué)院，河北 張家口 075000； 2.張家口市廣播電視大學(xué)，河北 張家口 075000)

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玉米ZmREM基因的克隆與逆境脅迫后表達分析

甕巧云1，趙彥敏2，張 賀1，宋晉輝1，馬海蓮1，袁進成1，劉穎慧1，*

(1.河北北方學(xué)院 農(nóng)林科技學(xué)院，河北 張家口 075000； 2.張家口市廣播電視大學(xué)，河北 張家口 075000)

B3超家族基因是植物中特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，參與植物生長發(fā)育、形態(tài)建成及抗逆境脅迫等過程。從玉米黃早4中獲得一個含有2個B3-DNA結(jié)合域的基因，為B3超家族基因，命名為ZmREM。該基因全長1047bp，編碼含有349個氨基酸的蛋白。Blast比對結(jié)果表明，ZmREM和谷子含有B3結(jié)構(gòu)域蛋白、高粱的假定蛋白相似性分別為81%和84%。ZmREM基因是組成型表達，在根中表達量最高。同時ZmREM基因的轉(zhuǎn)錄水平可以為干旱、鹽、冷和熱所誘導(dǎo)。因此，ZmREM可能參與玉米多種非生物脅迫應(yīng)答途徑。

玉米；REM轉(zhuǎn)錄因子；基因克??；非生物脅迫

B3超家族基因廣泛存在于擬南芥、水稻、番茄、玉米等多種植物，是植物中特有的一類轉(zhuǎn)錄因子[1-5]。該超家族基因根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)域和功能的特征可分為5個家族，包括ABI3-VP1、ARF(生長素響應(yīng)因子)、HSI (high-level expression of sugar-inducible)、RAV (related to ABI3-VP1)、REM (reproductive meristem)[6]。研究表明，B3超家族基因在植物生長發(fā)育和形態(tài)建成、逆境脅迫過程中發(fā)揮著重要的作用。如：擬南芥ARF家族基因，在鹽脅迫條件下大多數(shù)ARF基因表達量下調(diào)；ARF2參與乙烯信號傳導(dǎo)途徑；ARF5和ARF7調(diào)控細胞分化；ARF7和ARF9還參與生長的信號傳導(dǎo)途徑，影響著植物側(cè)根的形成；擬南芥過量表達ABI3基因增加了At2S3、AtCRC、AtEM1、AtSOM和AtEM6的表達量，35S∶ABI3轉(zhuǎn)基因種子對 ABA 更加敏感[6]；擬南芥abi3-5種子對脫落酸敏感，在種子萌發(fā)期表型顯著；辣椒中RAVI轉(zhuǎn)錄因子CARAV1受到病原菌、ABA等植物激素和非生物脅迫的誘導(dǎo)，表達量上調(diào)。過表達CARAV1后激活了轉(zhuǎn)基因擬南芥株系中PR相關(guān)基因的表達，并且提高了植株對病原菌的抗性及其對高鹽、滲透脅迫的抗性等[7-13]。

莫曉婷等[3]通過生物信息學(xué)方法已經(jīng)明確了玉米中含有49個B3超家族基因。ZmRAV1是目前玉米中唯一一個明確功能的B3超家族基因，在干旱、鹽和脫落酸脅迫下，ZmRAV1基因表達量增加；同時，過量表達ZmRAV1的擬南芥經(jīng)鹽和滲透脅迫后，在萌芽率、根長度、電解質(zhì)透出率等方面與野生型有明顯的區(qū)別。鑒于植物B3超家族基因在逆境脅迫應(yīng)答過程具有重要作用，本試驗以玉米為材料，以期克隆獲得玉米B3超家族基因。分析玉米不同組織中，各種非生物脅迫后B3超家族基因表達變化，明確其與玉米抗逆脅迫的關(guān)系，以期進一步了解玉米抗逆脅迫機制，并通過基因轉(zhuǎn)化技術(shù)獲得抗逆轉(zhuǎn)基因玉米新種質(zhì)，為玉米抗逆分子育種服務(wù)。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

以玉米自交系黃早4為供試材料，種植于河北北方學(xué)院農(nóng)場，采用正常田間管理模式。分別取3棵植株的根、莖、葉、花絲、籽粒，液氮速凍后于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

取三葉期的玉米植株用于非生物脅迫處理，在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為25℃，14h光照/10h黑暗。非生物脅迫處理包括NaCl處理(濃度為250mmol·L-1)、干旱處理(20%聚乙二醇PEG溶液)、低溫(4℃)和高溫(42℃)處理。處理后分別于0、1、3、6、12和24h取樣，液氮速凍-80℃保存?zhèn)溆?。以未處理玉米植株為對照，每個處理重復(fù)3次。

1.2 總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄

按照植物總RNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)說明提取玉米植株總RNA。根據(jù)FastQuant RT Kit(With gDNase)說明反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA(天根生化科技(北京)有限公司)。

1.3 基因的克隆

根據(jù)TAIR(TheArabidopsisInformation Resource)網(wǎng)站上提供的擬南芥AtREM基因(AT4G31610)，設(shè)計擴增ZmREM基因的引物。引物序列為F:5′-ATGGCTACGGTGTCCTC-3′，R:5′-CTAAAACTGCTCCCTGCGAA TG-3′ 。以合成的第一鏈 cDNA 為模板，利用 pfuTaqmix(天根生化科技(北京)有限公司)擴增目的基因。擴增體系包括 20μL pfuTaqmix，2μL cDNA，正向引物和反向引物各 1μL(10μmol·L-1)，補水至50μL。擴增條件為94℃，10min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min，35個循環(huán)；72℃，10min；4℃保存。利用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結(jié)果。將目的條帶進行回收，由華大基因進行測序。

1.4 生物信息學(xué)分析

利用NCBI網(wǎng)站的BLAST工具與GenBank已知物種基因進行比對分析；利用Conserved Domain Search Service(CD Search)軟件搜索基因的保守結(jié)構(gòu)域；利用在線軟件Prot Scale (http://web.expasy.org/protscale)預(yù)測目的蛋白氨基酸序列的疏水性/親水性；利用SWISS-MODEL在線工具(http://swissmodel.expasy.org/interactive)進行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測，并利用可視化工具Swiss-PdbViewer進行查看。

1.5 ZmREM基因?qū)崟r熒光定量PCR分析

利用實時熒光定量PCR技術(shù)，分析各種非生物脅迫后基因表達變化情況。設(shè)計引物為：正義：5′-TGTATCAATAATGCGGAGGG-3′和反義：5′-CAAAGTCTAACCACTCTCCC-3′。利用 High Capacity cDNA Reverse Transcription Kits及Power SYBR Green PCR Master Mix(ABI公司)試劑于熒光定量 PCR儀(Agilent 3000P)上進行PCR擴增。20μL反應(yīng)體系中包括 10μL 2×SYBR Green 1，1μL cDNA(稀釋后)，正向引物和反向引物各 0.5μL (10μmol·L-1)，8μL ddH2O。擴增程序為 95℃ 5min預(yù)變性，30個擴增循環(huán)(95℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min)；72℃，10min，每個樣品設(shè) 3次重復(fù)。利用MxPro-Mx3000P軟件和Excel軟件分析、處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZmREM基因的克隆和特性分析

本研究根據(jù)擬南芥AtREM基因(AT4G31610)設(shè)計引物，以玉米反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA為模板，擴增獲得一條單一條帶。獲得的玉米cDNA序列經(jīng)與Maize GDB數(shù)據(jù)庫比對，結(jié)果顯示該基因為一個新基因，目前還沒有研究報道。CD Search分析發(fā)現(xiàn)該序列含有2個B3-DNA結(jié)合域，屬于REM基因，故將該基因命名為ZmREM(圖1)。ZmREM基因全長 1047bp，編碼含有349個氨基酸的蛋白(圖2-A)。該蛋白富含甘氨酸、纈氨酸和精氨酸等，其分子量和等電點分別為 38.86ku和8.64。將ZmREM與GenBank中已知基因進行BLAST比對。結(jié)果表明，該基因與高粱假定蛋白同源性為84%；與谷子含有B3結(jié)構(gòu)域蛋白同源性為81%。

Prot Scale預(yù)測ZmREM蛋白氨基酸序列的疏水性/親水性如圖2-C所示。根據(jù)氨基酸分值越低親水性越強，分值越高疏水性越強的規(guī)律，可以看出，多肽鏈第25位具有最高的分值2.111和最強的疏水性; 第99位具有最低的分值-2.567和最強的親水性。ZmREM大部分氨基酸具有疏水性，推測該蛋白屬于疏水性蛋白。利用SWISS-MODLE蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫對獲得的ZmREM蛋白進行保守位點和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測。結(jié)果表明，該蛋白含有7個折疊和4個螺旋，其三維結(jié)構(gòu)顯示ZmREM主要為螺旋—折疊—螺旋的結(jié)構(gòu)(圖2-B)。

2.2 玉米不同組織中ZmREM基因表達分析

以孕穗期玉米植株的根、莖、葉、花絲、籽粒為材料，利用實時熒光定量PCR技術(shù)分析ZmREM基因在不同組織中的表達情況。結(jié)果表明，ZmREM基因是組成型表達，在各組織中均檢測到ZmREM基因的表達。其中根的表達量最高，其次依次是葉、籽粒、莖、花絲(圖3)。ZmREM在玉米不同組織中的差異表達，可能和其功能不同相關(guān)。

圖1 玉米ZmREM蛋白功能域預(yù)測Fig.1 Domains prediction of ZmREM protein

A, PCR擴增結(jié)果; B, 蛋白的三維結(jié)構(gòu)圖;C, 蛋白疏水性/親水性預(yù)測A, PCR result; B, The three-dimensional structures of ZmREM; C, Predication of hydrophobicity/hydropholicity

圖3 玉米不同組織中ZmREM基因表達分析Fig.3 Expression analysis of ZmREM in different tissues of maize

2.3 非生物脅迫后ZmREM基因的表達分析

對三葉期玉米植株分別進行PEG、NaCl、4℃和42℃脅迫處理，利用實時熒光PCR技術(shù)分析了不同非生物脅迫后ZmREM基因的表達情況。結(jié)果表明，ZmREM基因的表達受PEG、NaCl、4℃和42℃脅迫后誘導(dǎo)上調(diào)表達，且不同處理后基因的表達變化趨勢不同(圖4)。PEG和42℃處理后ZmREM表達量變化均表現(xiàn)為隨著處理時間的延長表達量逐漸升高的趨勢，于24h時表達量最高。冷脅迫處理后ZmREM表達量變化表現(xiàn)為先升高后降低。處理后0～12h隨著處理時間的延長，ZmREM表達量持續(xù)上升并于12h達到最高值，12h后表達量開始下降。NaCl脅迫處理后，ZmREM表達量呈現(xiàn)下降的趨勢。由此可見，ZmREM基因受PEG、NaCl、4℃和42℃脅迫后誘導(dǎo)表達，在玉米應(yīng)答脅迫反應(yīng)中可能起重要作用。

A，PEG處理；B，42℃處理；C，4℃處理；D，NaCl處理A，PEG; B，42℃;C，4℃; D，NaCl

3 討論

REM家族基因是一類含有B3功能域轉(zhuǎn)錄因子，該家族不同成員之間含有 B3功能域的數(shù)量存在較大差異?；ㄒ薆oREM1是植物中最先分離獲得的REM基因，該基因在生殖分生組織表達[14]。AtREM1是BoREM1同源基因，含有3個B3功能域。AtREM1在擬南芥生殖分生組織中表達，參與花的發(fā)育過程[15-16]。擬南芥VRN1(Reduced Vernalization Response 1)，含有2個B3功能域。該基因在各個組織中大量表達，通過與DNA進行結(jié)合來維持植物的春化作用[17-19]。Matias-Hernandez等[20]明確了擬南芥VDD(Verdandi/REM20)基因影響種子發(fā)育過程中的胚囊分化；Otho等[21]發(fā)現(xiàn)REM22、REM23、REM24和REM25在擬南芥花發(fā)育各階段表達。目前，關(guān)于其他物種REM基因尤其是玉米REM基因還沒有進行深入研究，它們在植物逆境脅迫過程中的作用還有待研究。本研究從玉米中獲得了一個含有2個B3功能域，屬于REM家族基因。通過實時熒光定量PCR技術(shù)，明確了該基因為組成型表達。同時該基因的轉(zhuǎn)錄水平受到干旱、鹽、冷和熱脅迫等的誘導(dǎo)表達。因此，我們推測ZmREM可能參與玉米多種脅迫應(yīng)答途徑。然而關(guān)于ZmREM基因功能以及對脅迫信號如何精確應(yīng)答，還需要繼續(xù)深入研究。

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(責(zé)任編輯 張 韻)

國家重點研發(fā)計劃“長江中下游水稻化學(xué)肥料和農(nóng)藥減施增效綜合技術(shù)集成研究與示范”項目正式立項

該項目由浙江省農(nóng)科院牽頭，聯(lián)合中國水稻所、全國農(nóng)技中心、長江中下游六省一市農(nóng)科院、涉農(nóng)高校、農(nóng)技推廣部門以及有關(guān)企業(yè)等24家單位共同承擔(dān)。根據(jù)項目目標和區(qū)域內(nèi)不同生態(tài)和種植制度特點下設(shè)9個課題。

項目主要通過水稻品種的篩選與合理布局、化肥減量減損增效和養(yǎng)分替代、病蟲害非化學(xué)防治、精準高效農(nóng)藥使用、肥藥協(xié)同增效等技術(shù)的突破，結(jié)合現(xiàn)有成熟技術(shù)，集成創(chuàng)新不同種植制度下的綜合技術(shù)模式，并應(yīng)用效果評價來調(diào)整和完善技術(shù)。通過管理機制創(chuàng)新，集成科研、推廣、農(nóng)資生產(chǎn)經(jīng)銷者、農(nóng)業(yè)經(jīng)營主體和政府多元協(xié)同的示范推廣體系,同時建設(shè)信息化平臺和扶持商業(yè)化專業(yè)服務(wù)組織，實現(xiàn)新技術(shù)的快速傳播與應(yīng)用、提升技術(shù)推廣應(yīng)用效果。與農(nóng)業(yè)部已經(jīng)設(shè)立的示范區(qū)緊密結(jié)合，建立核心示范區(qū)，開展更大范圍的技術(shù)示范和輻射帶動。

通過研究將形成適合長江中下游稻區(qū)不同生態(tài)區(qū)水稻化肥農(nóng)藥減施增效技術(shù)模式，并建立相應(yīng)技術(shù)規(guī)程。通過基地示范、新型經(jīng)營主體和現(xiàn)代職業(yè)農(nóng)民培訓(xùn)，可減少化肥農(nóng)藥不合理施用帶來的農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全和環(huán)境污染風(fēng)險，為保障生態(tài)環(huán)境安全和農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全，推動“供給側(cè)”改革和農(nóng)業(yè)發(fā)展“轉(zhuǎn)方式、調(diào)結(jié)構(gòu)”，促進農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供強有力的科技支撐。

經(jīng)過五年努力，在本稻區(qū)示范推廣1000萬畝，實現(xiàn)示范區(qū)內(nèi)的肥料利用率提高8個百分點、化肥減量施用17%，化學(xué)農(nóng)藥利用率提高11個百分點、農(nóng)藥減量施用30%。

Cloning of ZmREM and its expression analysis in maize under stress

WENG Qiao-yun1，ZHAO Yan-min2，ZHANG He1，SONG Jin-hui1，MA Hai-lian1，YUAN Jin-cheng1，LIU Ying-hui1，*

(1.CollegeofAgricultureandForestry，HebeiNorthUniversity，Zhangjiakou075000，China; 2.ZhangjiakouRadio&TVUniversity，Zhangjiakou075000，China)

The plant-specific B3superfamily constituted a large transcription factor superfamily.They play central roles in plant development，morphogenesis and stress-resistance.Taking total RNA of maize as template，REM gene was cloned by use the method of reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR).Length of 1047bp cDNA sequence that encoding 349amino acids was obtained.CD search result showed that it contained two B3-DNA domains and was named asZmREM.Blast result indicated thatZmREMhad 84% and 81% homology withSorghumbicolorhypothetical protein andSetariaitalicaB3domain-containing protein.In various tissues，gene expression in root was the highest.The expression ofZmREMin maize was induced by heat，high-salt，cold and PEG treatment.These results suggested thatZmREMmight be a stress related gene of maize.

maize (ZeamaysL.); REM transcription factor; gene cloning; abiotic stress

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.11.03

2016-03-31

國家自然科學(xué)基金(31101155)；河北北方學(xué)院重大項目(ZD201407，ZD201305)；河北省科技廳項目(13226326)

甕巧云(1979—)，女，河北定州人，博士，副教授，從事植物抗逆機制研究。E-mail: nkxwqy@163.com

*通信作者，劉穎慧，E-mail: leely519@126.com

S513

A

1004-1524(2016)11-1822-06

浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報ActaAgriculturaeZhejiangensis，2016，28(11): 1822-1827

http://www.zjnyxb.cn

甕巧云，趙彥敏，張賀，等.玉米ZmREM基因的克隆與逆境脅迫后表達分析[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2016，28(11)： 1822-1827.