紀(jì)建華

（漢中職業(yè)技術(shù)學(xué)院，藥學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)系，陜西漢中723000）

分析測(cè)試

不同方法測(cè)定殼聚糖脫乙酰度的比較

紀(jì)建華

（漢中職業(yè)技術(shù)學(xué)院，藥學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)系，陜西漢中723000）

以1H核磁共振波譜法測(cè)定結(jié)果為參考，評(píng)價(jià)差示掃描量熱法與電位滴定法測(cè)定殼聚糖脫乙酰度的準(zhǔn)確度。試驗(yàn)結(jié)果表明，差示掃描量熱法測(cè)定結(jié)果與1H核磁共振波譜法更為接近，且標(biāo)準(zhǔn)偏差小于1.5%，表現(xiàn)出較好的準(zhǔn)確度和精密度。另外在不同時(shí)段和日間的測(cè)定結(jié)果也較為一致，具有較好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。與電位滴定法相比，差示掃描量熱法操作簡便、快速，直接測(cè)定固體樣品，無需預(yù)處理樣品和配置、標(biāo)定、儲(chǔ)存標(biāo)準(zhǔn)溶液，從而可滿足相關(guān)工業(yè)快速檢測(cè)要求。

殼聚糖；脫乙酰度；差示掃描量熱法；電位滴定法；方法比較

殼聚糖是甲殼素氨基上部分脫除乙?；漠a(chǎn)物，由2-乙酰氨基-2-脫氧-β-D-葡萄糖（GlcNAc）與2-氨基-2-脫氧-β-D-葡萄糖通過β-1,4糖苷鍵共聚構(gòu)成（GlcN），見圖1。

圖1　殼聚糖化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1Chemical structure of chitosan

因其來源豐富且安全、無毒、可生物降解，從而被廣泛用于醫(yī)藥、化工、紡織等行業(yè)[1]。殼聚糖脫乙酰度（Degree ofdeacetylation,DD%）是殼聚糖分子氨基上脫去乙?；陌俜直龋叩统潭戎苯佑绊懻扯?、膜張力、螯合系數(shù)及免疫活性等物理、化學(xué)和生物學(xué)性質(zhì)[2]。

目前，測(cè)定殼聚糖脫乙酰度的方法有：酸堿滴定法[3]、電位滴定法[4]及1H核磁共振波譜法（1H NMR）[5]等，其中1H NMR法被美國標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試組織認(rèn)定為測(cè)定殼聚糖脫乙酰度標(biāo)準(zhǔn)分析方法[6]，但由于分析時(shí)間較長且儀器裝置較為昂貴，限制了廣泛應(yīng)用。差示掃描量熱法（DSC）具有操作簡便，分析時(shí)間短，可直接用于固體樣品測(cè)定的特點(diǎn)，而被用于殼聚糖脫乙酰度的測(cè)定[7]，電位滴定法則作為國內(nèi)行業(yè)仲裁方法，在實(shí)驗(yàn)室分析中大量應(yīng)用[3]。本研究以1H NMR測(cè)定結(jié)果為參考，評(píng)價(jià)差示掃描量熱法與電位滴定法測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度。試驗(yàn)結(jié)果表明：與電位滴定法相比，差示掃描量熱法測(cè)定結(jié)果與1HNMR更為接近，具有較好的準(zhǔn)確度，且操作簡便、快速，直接測(cè)定固體樣品，無需預(yù)處理樣品和配置、標(biāo)定、儲(chǔ)存標(biāo)準(zhǔn)溶液，從而可滿足相關(guān)工業(yè)快速檢測(cè)要求。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1主要儀器與試劑

STA449F3型DSC/TGA同步熱分析儀（德國耐馳）；Varian Inova-600核磁共振波譜儀；微孔濾膜（天津津騰）；FA1204B電子天平（上海精科）；CJJ-781型磁力攪拌器；DZF型真空干燥箱；Scientz-50ND型冷凍干燥機(jī)；雷磁pHS-3D型酸度計(jì)；雷磁E-201-C型pH復(fù)合玻璃電極

殼聚糖（山東豐泰生物科技有限公司）；D2O與DCl（阿拉丁試劑）；其余所用試劑皆為分析純，試驗(yàn)用水為蒸餾水。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1樣品制備稱取10.0g殼聚糖樣品，攪拌完全溶解于600mL0.5mol·L-1醋酸溶液中，通過0.45μm濾膜過濾后，往濾液中滴加1.5mol·L-1NaOH溶液至殼聚糖沉淀完全析出，依次使用蒸餾水與無水乙醇將其洗至中性，冷凍干燥取出，研磨均勻，通過100目篩過濾，放入真空干燥箱105℃下干燥6h后，放置于干燥器中保存?zhèn)溆肹8]。

1.2.21H NMR法稱取殼聚糖0.003g，加入至3mL D2O中，另加入1mol·L-1DCl 250μL，完全溶解后，放置于核磁共振波譜儀內(nèi)，實(shí)驗(yàn)條件：質(zhì)子光譜寬度：10，掃描數(shù)：8，弛豫延遲：15s，脈沖角：90°，采樣時(shí)間：2min，采樣點(diǎn)數(shù)：3.2×104，記錄1H NMR圖譜[5]，按照下式計(jì)算殼聚糖脫乙酰度。

式中H-AC：共聚結(jié)構(gòu)單元2-乙酰氨基-2-脫氧-β-D-葡萄糖中乙?；?個(gè)氫原子峰面積；H-2/6：基本結(jié)構(gòu)單元2,5-縮水甘露糖中6個(gè)氫原子峰面積；DD%：殼聚糖脫乙酰度。

1.2.3差示掃描量熱法稱取0.005g殼聚糖樣品，置于剛玉坩堝中，在流速50～100mL·min-1的N2氛圍下，按照5℃·min-1的升溫速率從常溫升至450℃，從記錄的DSC曲線上求出295℃附近放熱分解峰的峰面積（A295）。按照下式計(jì)算出脫乙酰度[7]，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次。

1.2.4電位滴定法準(zhǔn)確稱量0.25g殼聚糖樣品，加入足量的0.10mol·L-1HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液攪拌至完全溶解后，邊逐步滴加0.10mol·L-1NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液，邊記錄溶液pH的變化，滴定至第二突躍點(diǎn)結(jié)束后，繪制pH-VNaOH滴定曲線，根據(jù)電位滴定突躍點(diǎn)時(shí)消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，計(jì)算出殼聚糖的氨基含量和脫乙酰度[4]，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次。

式中CNaOH：NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol·L-1；V1：到達(dá)第一突躍點(diǎn)消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；V2：到達(dá)第二突躍點(diǎn)消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；mdry：干燥樣品重，g；16.02，氨基摩爾質(zhì)量，g·mol-1；WNH2：殼聚糖的氨基含量，%；203.2為GlcNAc基本結(jié)構(gòu)單元摩爾質(zhì)量，g·mol-1；42.04：GlcNAc與GlcN基本結(jié)構(gòu)單元摩爾質(zhì)量之差，g·mol-1；為殼聚糖脫乙酰度，%。

2　結(jié)果與討論

2.1DSC與1H NMR的比較

殼聚糖的差示掃描量熱曲線，見圖2。

圖2　殼聚糖樣品DSC曲線Fig.2DSC curve of chitosan

在110℃附近的吸熱峰（A峰），歸屬于殼聚糖中自由水與結(jié)合水的蒸發(fā)。在295℃附近的放熱分解峰（B峰），是由于殼聚糖中2-氨基-2-脫氧-β-D-葡萄糖的分解所致。在400℃附近放熱分解峰（C峰），則由于殼聚糖中2-乙酰氨基-2-脫氧-β-D-葡萄糖的分解。隨著殼聚糖脫乙酰度的增大，B峰的峰高與峰面積逐漸增大，而C峰的峰高與峰面積則相應(yīng)減少。差示掃描量熱法與1H NMR法分別測(cè)定殼聚糖脫乙酰度的結(jié)果，見表1。

表1　差示掃描量熱法與1H NMR測(cè)定結(jié)果比較Tab.1Comparison with the result of DSC and1H NMR

從表1中可見，差示掃描量熱法與1H NMR測(cè)定結(jié)果最大相差僅為0.81%，且標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于1.5%，表明方法具有較好的精密度。在95%置信度下，對(duì)差示掃描量熱法與1H NMR測(cè)定結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)，tcalc值均小于ttab，故而兩種方法測(cè)定結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。

2.2電位滴定法與1H NMR的比較

電位滴定法與酸堿滴定法測(cè)定殼聚糖脫乙酰度原理類似，利用OH-離子分別中和殼聚糖溶液中過量HCl和質(zhì)子化氨基，二者消耗NaOH溶液體積差（V2-V）1即為中和質(zhì)子化氨基所需堿溶液體積，滴定曲線見圖2。

圖2　電位滴定曲線Fig.2Curve of potentiometric titration

表2為電位滴定法與1H NMR法分別測(cè)定殼聚糖脫乙酰度的結(jié)果，電位滴定法與1H NMR測(cè)定結(jié)果最大相差為3.92%，且標(biāo)準(zhǔn)偏差與差示掃描量熱法相比較大，其原因?yàn)闅ぞ厶莾H溶于強(qiáng)酸性溶液，當(dāng)樣品溶液滴定至弱酸性時(shí)，殼聚糖沉淀開始逐漸析出，并粘附于玻璃電極的膜表面，溶液變得越來越渾濁與粘稠，從而嚴(yán)重干擾電極對(duì)溶液H+活度的響應(yīng)，延長了測(cè)定時(shí)間[9]。在95%置信度下，對(duì)電位滴定法與1H NMR測(cè)定結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)，tcalc值均小于ttab，兩種方法測(cè)定結(jié)果也無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異，但二者的差值與“2.1”中tcalc與ttab的差值相比較小，表明與電位滴定法相比，差示掃描量熱法與1H NMR測(cè)定結(jié)果更為接近。

表2　電位滴定法與1H NMR測(cè)定結(jié)果比較Tab.2Comparison with the result of potentiometric titration and1H NMR

2.3穩(wěn)定性

采用差示掃描量熱法和電位滴定法，在不同時(shí)間段下，分別測(cè)定同一殼聚糖樣品脫乙酰度，見表3。

表3　兩種方法穩(wěn)定性比較（n=3）Tab.3Compare with the stability of two methods（n=3）

差示掃描量熱法在不同時(shí)間段下測(cè)定結(jié)果之間幾乎一致，最大相差僅為1.01%，沒有明顯變化，但電位滴定法隨著樣品溶液放置時(shí)間的延長，測(cè)定結(jié)果不斷偏高，這可能由于在溶液中H+的催化作用下，β-1,4糖苷鍵發(fā)生斷裂,導(dǎo)致殼聚糖發(fā)生水解，影響結(jié)果的測(cè)定[10]，而差示掃描量熱法由于直接測(cè)定固體樣品，從而克服了樣品水解對(duì)結(jié)果產(chǎn)生的干擾，具有較好的穩(wěn)定性。

2.4重現(xiàn)性

分別對(duì)差示掃描量熱法與電位滴定法的重現(xiàn)性進(jìn)行考察，結(jié)果見表4。

表4　兩種方法重現(xiàn)性比較（n=3）Tab.4Compare with the robustness of two methods（n=3）

兩種方法在不同環(huán)境下的測(cè)定結(jié)果之間均較為一致，且與1H NMR測(cè)定結(jié)果相近，表明采用兩種分析方法測(cè)定殼聚糖脫乙酰度時(shí)均具有較好的重現(xiàn)性。

3　結(jié)論

從上述試驗(yàn)結(jié)果可知，與電位滴定法相比，差示掃描量熱法與1H NMR測(cè)定結(jié)果更為接近，且標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于1.5%，具有較好的準(zhǔn)確度和精密度，由于直接測(cè)定固體樣品，從而無需預(yù)處理樣品和配置、標(biāo)定、儲(chǔ)存標(biāo)準(zhǔn)溶液，避免了殼聚糖的水解干擾測(cè)定結(jié)果，具有較好的穩(wěn)定性。同時(shí)，差示掃描量熱法操作簡便、快速，結(jié)果重現(xiàn)性好，從而可滿足相關(guān)工業(yè)生產(chǎn)快速檢測(cè)要求。

［1］蔣挺大.殼聚糖［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2001.

［2］謝宇.殼聚糖及其衍生物制備與利用［M］.北京：中國水利水電出版社，2010.

［3］中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.SC/T 3403-2004.甲殼質(zhì)與殼聚糖［S］.北京：中華人民共和國農(nóng)業(yè)部，2005.

［4］賈志慎，李奇彪.雙突躍電位滴定法測(cè)定殼聚糖脫乙酰度［J］.化學(xué)世界，2001，41（5）：240-241.

［5］Hirai A，Odani H，Nakajima A.Determination of degree of deacetylation of chitosan by1H NMR spectroscopy［J］.PolymerBulletin，1991，26（1）：87-94.

［6］American Standard Test Method，ASTMInternational，［2003］.http: //www.astm.org.

［7］Guinesi L S，Cavalheiro E T G.The use of DSC curves to determine the acetylation degree of chitin/chitosan samples［J］.ThermochimicaActa，2006，444（2）：128-133.

［8］Santos Z M，Caroni A L P F，Pereira M R，et al.Determination of deacetylation degree of chitosan：a comparison between conductometric titration and CHN elemental analysis［J］.Carbohydrate Research，2009，344（18）：2591-2595.

［9］WangC，Yuan F，Jin L，et al.Evaluation of the deacetylation degree of chitosan with two-abrupt-change coulometric titration［J］.Electroanalysis，2015，55（4）：885-893.

［10］董岸杰，孫多先.殼聚糖的水解反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究［J］.高分子材料科學(xué)與工程，2000，16（2）：41-43.

Determination of the degree of deacetylation of chitosan by different methods

JI Jian-hua
（Department of Pharmacology,Vocation and Technology College of Hanzhong,Hanzhong 723000,China）

The accuracy result of differential scanning calorimetry（DSC）and potentiometric titration was evaluated by1H NMR method as standard reference.The research revealed that the DSC resultsweremore closed to those from1H NMR and the standard deviations were lower than 1.5%,which possessed better accuracy and precision.In addition,the differences between inter-day and inter-time were very small showing the stability and robustness of the technique.Compare with potentiometric titration,with merit of simplicity,convenience,quickness, directly measured solid samplewhich no needsfor the preparation,standardization,storage of the standard solutionandpretreatment needless.Thereby,it could satisfy the demand of rapid testing of corresponding industrial production.

chitsoan；degree of deacetylation；differential scanning calorimetry；potentiometric titration；method comparison

O657.99

A

10.16247/j.cnki.23-1171/tq.20161123

2016-07-06

紀(jì)建華（1982-），男，陜西漢中人，講師，碩士，主要從事藥物分析教學(xué)與研究。