郝艷芳，朱巧平，謝安明

?

·實(shí)驗(yàn)論著·

玻璃體腔注射VAS2870對(duì)小鼠氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變的保護(hù)作用

郝艷芳1,2，朱巧平1,2，謝安明1

1Department of Ophthalmology, the First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061, Shaanxi Province, China;2Department of Ophthalmology, the First Hospital of Yulin, Yulin 719000, Shaanxi Province, China

?METHODS: Neonatal C57BL/6J mice were divided randomly into three groups: normoxic control group, PBS injection of OIR group and VAS2870 injection of OIR group. The mice of the latter two groups were exposed to 75% oxygen from the postnatal 7d (P7) to the postnatal 12d (P12) to induced OIR. VAS2870 was administered by intravitreal injection (0.5μL) in a mice model of OIR in P12. Another set of mice model of OIR were received a similar treatment with PBS. All eyes were collected at P17. The right eyes were whole mounted and stained with Lectin to observe the growth of retinal vessels; The eyes were enucleated to assess the levels of reactive oxygen species ROS/RNS. The expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) and Nox4 mRNA were detected by western blot and RT-PCR, respectively.

?RESULTS: In the retina of OIR, VAS2870 reduced the retinal avascular area and neovascularization, the hypoxia-induced increase in ROS levels, the protein expression of VEGF and gene expression of Nox4 mRNA.

?CONCLUSION: NOX4 enzyme inhibition with VAS2870 has potent anti-oxidative stress effects in the retina, indicating its potential as a treatment for retinopathy of prematurity.

目的：觀察玻璃體腔注射VAS2870對(duì)C57小鼠氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變的影響。

方法：將新生C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為3組，分別為正常對(duì)照組、VAS2870注射OIR組和無菌PBS緩沖液注射OIR組。將后兩組小鼠在出生后第7d(P7)至P12置于體積分?jǐn)?shù)為75%±2%的恒定高氧氧箱中以構(gòu)建OIR模型，在P12時(shí)給予幼鼠雙眼玻璃體腔注射VAS2870(0.5μL)，另一組幼鼠雙眼注射同等劑量的無菌PBS緩沖液。三組小鼠均在P17時(shí)取右眼行視網(wǎng)膜鋪片和Lectin染色，觀察視網(wǎng)膜中央無血管區(qū)及病理性新生血管的情況；取右眼行視網(wǎng)膜組織定量檢測(cè)ROS/RNS含量；取左眼應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)Nox4 mRNA含量，并應(yīng)用Western-blot測(cè)定視網(wǎng)膜組織中VEGF的表達(dá)。

結(jié)果：VAS2870注射OIR組小鼠視網(wǎng)膜中央無血管區(qū)面積較無菌PBS緩沖液注射OIR組明顯減少(P<0.05)，病理性新生血管數(shù)目明顯減少(P<0.05)；VAS2870注射OIR組小鼠視網(wǎng)膜組織Nox4 mRNA的表達(dá)量明顯低于無菌PBS緩沖液注射組；VAS2870注射OIR組小鼠視網(wǎng)膜組織ROS含量較無菌PBS緩沖液注射組明顯降低(P<0.05)；VAS2870注射OIR組小鼠視網(wǎng)膜組織VEGF的表達(dá)明顯低于無菌PBS緩沖液注射組(P<0.05)。

結(jié)論：在小鼠OIR模型中，VAS2870可抑制Nox4 mRNA的表達(dá)，減少ROS/RNS，下調(diào)VEGF的生成，在視網(wǎng)膜病變進(jìn)程中具有保護(hù)作用。

VAS2870；氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變；氧自由基；血管內(nèi)皮生長因子

引用：郝艷芳，朱巧平，謝安明.玻璃體腔注射VAS2870對(duì)小鼠氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變的保護(hù)作用.國際眼科雜志2016;16(12):2200-2203

0引言

早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(retinopathy of prematurity，ROP)是一種多發(fā)生于早產(chǎn)兒或低體重嬰幼兒的視網(wǎng)膜增生性病變，與出生后暴露于波動(dòng)氧誘導(dǎo)未發(fā)育成熟視網(wǎng)膜血管的收縮和閉塞形成無血管區(qū)并繼發(fā)病理性新生血管大量生成有著密切關(guān)系，后期可引起視網(wǎng)膜脫離，嚴(yán)重危害患兒的視力[1]。雖然在防治方面取得一些進(jìn)展，但該病變一旦發(fā)生，進(jìn)展很快，可有效治療的時(shí)間窗口很窄，仍無法有效地阻止病變的進(jìn)展。目前針對(duì)視網(wǎng)膜病變進(jìn)展的基本發(fā)病機(jī)制為靶點(diǎn)的治療已成為新的戰(zhàn)略[2]。在ROP的病理過程中，視網(wǎng)膜暴露于不斷波動(dòng)的氧分壓中，引起視網(wǎng)膜缺血缺氧，產(chǎn)生過量的活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)/活性氮自由基(reactive nitrogen species，RNS)，可直接對(duì)視網(wǎng)膜血管造成損傷。NADPH氧化酶是血管內(nèi)皮細(xì)胞ROS/RNS的主要來源，在外來信號(hào)刺激下激活或失活，從而迅速升高或降低細(xì)胞內(nèi)的ROS/RNS水平[3]。Nox4是NADPH氧化酶家族中的一員，在人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞中高度表達(dá)[4]。Nox4是一種多效性信號(hào)肽，可通過多種信號(hào)通路發(fā)揮多樣的功能，包括細(xì)胞生長和分化、血管壁重塑、血管發(fā)生和腫瘤生長[5]。然而，目前有關(guān)Nox4在氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變(oxygen-induced retinopathy，OIR)模型中的作用尚不完全清楚，本研究擬使用Nox4特異性抑制劑VAS2870，給予高氧波動(dòng)中的C57BL/6J新生幼鼠雙眼玻璃體腔注射，觀察幼鼠視網(wǎng)膜病變的發(fā)生情況，為ROP的防治提供新的治療方向。

1材料和方法

1.1材料 新生C57BL/6J小鼠(西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)共96只，按照隨機(jī)原則選取64只為OIR組，另32只正常對(duì)照組。OIR組新生小鼠隨機(jī)分為VAS2870注射OIR組和無菌PBS注射OIR組，每組各32只。每組新生幼鼠與母鼠同籠飼養(yǎng)直至造模完成，按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，晝夜比12h∶12h，溫度控制(24±1)℃，濕度為50%～60%。

1.2方法

1.2.1小鼠OIR模型的建立 參照小鼠OIR模型建立方法[6]，在出生后第7d(P7)，將新生C57BL/6J小鼠與母鼠共同置于體積分?jǐn)?shù)75%±2%的恒定高氧箱中飼養(yǎng)，常規(guī)食水供應(yīng)，在P12返回正?？諝庵欣^續(xù)飼養(yǎng)。正常對(duì)照組小鼠則置于正?？諝庵酗曫B(yǎng)。

1.2.2小鼠玻璃體腔注射 在P12返回正常空氣中取幼鼠稱重后，4.3%水合氯醛(0.01mL/g，腹腔注射)麻醉后使用復(fù)方托吡卡胺散大兩側(cè)瞳孔，生理鹽水濕潤眼表，左氧氟沙星滴眼，使小鼠側(cè)臥在手術(shù)臺(tái)，在解剖顯微鏡下?lián)荛_眼瞼，暴露角鞏膜緣。使用10-0針在角鞏膜緣后1mm做切口，33G注射器刺入玻璃體腔，注射0.5μL的VAS2870，對(duì)照組注射無菌PBS 0.5μL。術(shù)后紅霉素眼膏涂眼預(yù)防感染。

1.2.3小鼠視網(wǎng)膜鋪片Lectin染色及圖像分析 造模結(jié)束后(P17)，使用1%戊巴比妥鈉(30mg/kg，腹腔注射)過量麻醉處死幼鼠，取右眼置于4%多聚甲醛4固定。在手術(shù)顯微鏡下用角膜剪沿眼球的角鞏膜剪開，去除角膜、虹膜、晶狀體及玻璃體，分離視網(wǎng)膜。分離的視網(wǎng)膜組織于4%多聚甲醛溶液固定3h，用PBS(0.01mol/L，pH：7.4)漂洗5min，用1%牛血清白蛋白+0.5% Triton+0.01mol/L PBS在室溫中封閉2.5h，加入抗體Isolectin B4過夜，用PBS漂洗5min×3次后在手術(shù)顯微鏡下以視盤為中心，放射狀切開視網(wǎng)膜，平鋪于載玻片上，樹脂膠封片。

1.2.4 RT-PCR測(cè)定各組小鼠視網(wǎng)膜組織Nox4 mRNA表達(dá)量 造模結(jié)束后(P17)，以上述實(shí)驗(yàn)方法分離得到視網(wǎng)膜，按照Trizol試劑盒說明書提取視網(wǎng)膜總RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按照Promega公司試劑盒提供的實(shí)驗(yàn)程序完成。PCR引物序列：Nox4：正向序列：5’-CAG GAG GGC TGC TGA AGT ATC AA-3’和反向序列：5’-TGA CTG GCT TAT TGC TCC GGA TA-3’。GAPDH：正向序列：5’-TCT GGA AAG CTG TGG CGT G-3’和反向序列：5’-CCA GTG AGC TTC CCG TTC AG-3’。檢測(cè)幼鼠視網(wǎng)膜組織中Nox4 mRNA的表達(dá)量。

1.2.5蛋白免疫印跡法(Western blot)測(cè)定各組小鼠視網(wǎng)膜組織VEGF表達(dá)量 造模結(jié)束后(P17)，取眼球分離小鼠視網(wǎng)膜組織后置于細(xì)胞裂解液(1% Triton X-100，50mmol/L Tris，1mmol/L EDTA，0.1% SDS，1%脫氧膽酸鈉)中勻漿。BCA法測(cè)定蛋白濃度，取等量蛋白樣品，10% SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜。加入一抗，室溫孵育12h，HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育2h。ECL顯影后，半定量分析視網(wǎng)膜組織中VEGF條帶的光密度值。

1.2.6高質(zhì)熒光測(cè)定各組小鼠視網(wǎng)膜組織氧化應(yīng)激活性氧(ROS) 造模結(jié)束后(P17)，取眼球分離視網(wǎng)膜后用預(yù)冷的GENMED清理液漂洗2～3次；視網(wǎng)膜組織加入100μL GENMED稀釋液，漩渦混合器充分震蕩充分混勻后移取50μL組織勻漿物或50μL GENMED稀釋液(背景對(duì)照)到96孔平板上，加入950μL GENMED染色液和GENMED稀釋液的染色工作液，充分混勻后放37℃恒溫水孵育20min，避免光照。隨后使用避熒光定量分光光度儀(M5)檢測(cè)：激發(fā)波長490nm，散發(fā)波520nm。對(duì)比OIR模型組ROS熒光度/常氧對(duì)照組ROS熒光強(qiáng)度值。

1.2.7圖像觀察 熒光顯微鏡下拍攝視網(wǎng)膜血管染色圖像，應(yīng)用Adobe Photoshop CS6合成視網(wǎng)膜全圖，參照Connor等[7]分析方法選取視網(wǎng)膜無血管區(qū)、病理性新生血管和視網(wǎng)膜總面積(以像素為單位)，分別計(jì)算無血管區(qū)和病理性新生血管與視網(wǎng)膜總面積比值。

2結(jié)果

2.1三組小鼠視網(wǎng)膜血管化情況 三組小鼠視網(wǎng)膜血管染色鋪片顯示，在P17時(shí)，正常對(duì)照組小鼠視網(wǎng)膜血管化已經(jīng)完成，血管走形規(guī)則，分支良好(圖1A)；兩組小鼠OIR模型構(gòu)建成功，VAS2870注射OIR組和無菌PBS注射組小鼠視網(wǎng)膜中央均出現(xiàn)程度不同的無血管化區(qū)域(綠色線標(biāo)出區(qū)域，圖1B～C)以及呈團(tuán)簇狀的新生血管(白色箭頭所指，圖1B～C)。統(tǒng)計(jì)分析顯示：VAS2870注射OIR組小鼠視網(wǎng)膜中央無血管區(qū)面積顯著減少(t=8.393，P<0.05)，病理性新生血管數(shù)目減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.014，P<0.05，表1)。

2.2三組小鼠視網(wǎng)膜組織Nox4 mRNA表達(dá)情況 RT-PCR結(jié)果顯示，在P17時(shí)正常小鼠視網(wǎng)膜組織中有少量Nox4 mRNA表達(dá)；兩組OIR模型組中小鼠視網(wǎng)膜組織Nox4 mRNA的表達(dá)量明顯升高。統(tǒng)計(jì)分析顯示，三組間小鼠視網(wǎng)膜Nox4 mRNA的表達(dá)量差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=151.98，P<0.05)，VAS2870注射OIR組和無菌PBS緩沖液注射組小鼠視網(wǎng)膜Nox4 mRNA的表達(dá)量均明顯高于正常對(duì)照組(均P<0.05)，而VAS2870注射OIR組小鼠視網(wǎng)膜Nox4 mRNA的表達(dá)量明顯低于無菌PBS注射組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)。

圖1 三組小鼠視網(wǎng)膜血管染色鋪片圖(×400) A：常氧對(duì)照組；B：無菌PBS注射OIR模型組；C：VAS2870

注射OIR模型組。

表1 OIR模型小鼠視網(wǎng)膜無血管區(qū)以及病理性新生血管像素百分比

(±s，%)

注：aP<0.05vsPBS注射OIR組。

2.3三組小鼠視網(wǎng)膜組織VEGF表達(dá)情況 Western blot結(jié)果顯示：兩組OIR模型組中小鼠視網(wǎng)膜組織VEGF的表達(dá)量明顯升高。統(tǒng)計(jì)分析顯示，三組間小鼠視網(wǎng)膜VEGF表達(dá)量的差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=102.703，P<0.05)，VAS2870注射OIR組和無菌PBS緩沖液注射組小鼠視網(wǎng)膜VEGF表達(dá)量均明顯高于正常對(duì)照組(均P<0.05)，而VAS2870注射OIR組小鼠視網(wǎng)膜VEGF表達(dá)量明顯低于無菌PBS注射組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2)。

2.4三組小鼠視網(wǎng)膜組織ROS生成情況 在P17時(shí)，正常小鼠視網(wǎng)膜組織中有少量的ROS生成；兩組OIR模型組小鼠視網(wǎng)膜組織中ROS生成量均明顯增加。統(tǒng)計(jì)分析顯示，三組間小鼠視網(wǎng)膜ROS生成量差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=86.856，P<0.05)，VAS2870注射OIR組和無菌PBS緩沖液注射組小鼠視網(wǎng)膜ROS生成量均明顯高于正常對(duì)照組(均P<0.05)，而VAS2870注射OIR組小鼠視網(wǎng)膜ROS生成量明顯低于無菌PBS注射組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3)。

3討論

視網(wǎng)膜組織代謝活躍、氧含量及耗氧量高、不飽和脂肪酸含量高，且經(jīng)常暴露于可見光下，對(duì)活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)/活性氮自由基(reactive nitrogen species，RNS)的損傷敏感[8]。研究顯示，在出生后早產(chǎn)兒未發(fā)育成熟的視網(wǎng)膜暴露于外界不斷波動(dòng)的氧分壓(高氧低氧相交替)中，導(dǎo)致視網(wǎng)膜局部缺血缺氧，引發(fā)過量的ROS/RNS生成，過量生成的自由基具有直接細(xì)胞毒性，損傷正常的血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷，使正常生長發(fā)育的視網(wǎng)膜血管停滯，并繼發(fā)生成病理性新生血管，嚴(yán)重者可牽拉引起視網(wǎng)膜脫離。因此，氧化應(yīng)激在ROP的病理進(jìn)程中扮演著重要的作用[9]。

表2 三組小鼠視網(wǎng)膜Nox4 mRNA表達(dá)量

±s

注：aP<0.05vs正常對(duì)照組；cP<0.05vsPBS注射OIR組。

圖2 三組小鼠視網(wǎng)膜組織VEGF蛋白表達(dá)水平的免疫印跡結(jié)果 A：蛋白印記條帶；B：VEGF蛋白表達(dá)的條形圖。

圖3 三組小鼠視網(wǎng)膜組織ROS熒光強(qiáng)度相對(duì)值。

在OIR模型中的研究顯示，視網(wǎng)膜局部缺血缺氧可活化NADPH氧化酶，引起局部ROS/RNS升高，從而上調(diào)VEGF表達(dá)、促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、促進(jìn)視網(wǎng)膜無血管區(qū)和病理性新生血管的形成，而注射夾竹桃麻素抑制NADPH氧化酶的活性后可減少視網(wǎng)膜無血管區(qū)及病理性新生血管的形成[10-11]。進(jìn)一步的研究顯示，NADPH氧化酶家族的亞單位參與了內(nèi)皮細(xì)胞的功能調(diào)節(jié)和血管發(fā)生的調(diào)控。Nox家族組包括7個(gè)成員，分別為Nox1，Nox2，Nox3，Nox4，Nox5，Duox1和Duox2。在血管系統(tǒng)，Nox1，Nox2，Nox4和Nox5均有表達(dá)，Nox4在人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞中高度表達(dá)[12]。

在實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，在兩組幼鼠OIR造模成功后，視網(wǎng)膜中心均形成明顯的無血管區(qū)，周邊視網(wǎng)膜繼發(fā)形成病理性新生血管，且在視網(wǎng)膜組織Nox4 mRNA的表達(dá)量、ROS/RNS生成量及VEGF的表達(dá)也較正常對(duì)照組明顯增加。在P12使用VAS2870特異性抑制Nox4活性后，幼鼠視網(wǎng)膜中心的無血管區(qū)較PBS組明顯減小，病理性新生血管的數(shù)量也減少，視網(wǎng)膜組織中Nox4 mRNA的表達(dá)量下降，ROS/RNS生成量及VEGF的表達(dá)量均明顯下降，說明在小鼠OIR模型中，視網(wǎng)膜缺血缺氧可活化Nox4，促進(jìn)視網(wǎng)膜無血管區(qū)以及病理性新生血管的形成，而抑制Nox4活性可減輕視網(wǎng)膜血管的病變。

前期研究顯示在低氧培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞中可檢測(cè)到Nox4 mRNA表達(dá)增加，且血管內(nèi)皮細(xì)胞增生、移行形成管腔也明顯增加，而在低氧培養(yǎng)的Nox4基因敲除小鼠內(nèi)皮細(xì)胞中所形成的管腔明顯減少，且用藥物抑制Nox4活性后，可減少缺氧組織中新生血管的密度[13-14]。在其他缺血/缺氧誘導(dǎo)的新生血管模型中，在內(nèi)皮細(xì)胞Nox4過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠上臂缺血組織中主動(dòng)脈毛細(xì)血管萌芽增加[15]。總之，這些研究都說明內(nèi)皮細(xì)胞Nox4可促進(jìn)缺血缺氧狀態(tài)下的血管發(fā)生，抑制Nox4活性后可減少新生血管的形成[16]。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在小鼠氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變模型中VAS2870可抑制Nox4活性，減少ROS/RNS的生成，下調(diào)VEGF的表達(dá)從而發(fā)揮視網(wǎng)膜保護(hù)作用，可能成為治療的潛在靶點(diǎn)。

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Protection of VAS2870 to oxygen-induced retinopathy in mice

Yan-Fang Hao1,2, Qiao-Ping Zhu1,2, An-Ming Xie1

An-Ming Xie.Department of Ophthalmology, the First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061, Shaanxi Province, China. Xie9102@163.com

?AIM: To investigate the protective effect of VAS2870 on mice oxygen-induced retinopathy (OIR) and the possible underlying mechanisms.

VAS2870; oxygen-induced retinopathy; reactive oxygen species; reactive nitrogen species; vascular endothelial growth factor

1(710061)中國陜西省西安市，西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科；2(719000)中國陜西省榆林市第一醫(yī)院眼科

郝艷芳，在讀碩士研究生，主治醫(yī)師，研究方向：眼底病。

謝安明，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向：眼底病.Xie9102@163.com

2016-07-02

2016-11-03

:Hao YF, Zhu QP, Xie AM. Protection of VAS2870 to oxygen-induced retinopathy in mice.GuojiYankeZazhi(IntEyeSci) 2016;16(12):2200-2203

10.3980/j.issn.1672-5123.2016.12.07

Received：2016-07-02 Accepted：2016-11-03