郝秀靜，陽 輝，王 娟，李 敏，李學強

(1. 西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室，寧夏銀川 750021；2. 寧夏大學，寧夏銀川 750021)

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◇基礎研究◇

18β-甘草次酸哌嗪衍生物抗肝癌SMMC-7721細胞活性研究

郝秀靜1,2，陽 輝2，王 娟1,2，李 敏1,2，李學強2

(1. 西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室，寧夏銀川 750021；2. 寧夏大學，寧夏銀川 750021)

目的 研究18β-甘草次酸哌嗪衍生物D34、D35對SMMC-7721細胞增殖的的抑制作用及對凋亡的影響。方法 用18β-甘草次酸哌嗪衍生物D34、D35以不同濃度、不同時間段處理SMMC-7721細胞，顯微鏡下觀察其對肝癌SMMC-7721細胞形態(tài)結構的影響；MTT法檢測18β-甘草次酸哌嗪衍生物D34、D35對SMMC-7721細胞的增殖抑制率；Hoechst-33258細胞凋亡染色試劑盒檢測細胞凋亡情況；Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡率。結果 MTT檢測結果表明，18β-甘草次酸哌嗪衍生物D34、D35能夠抑制肝癌SMMC-7721細胞增殖，且呈濃度依賴性(P<0.05)；流式細胞儀檢測細胞凋亡率，D35為26.71%、D34為36.95%。結論 18β-甘草次酸哌嗪衍生物D34、D35對SMMC-7721細胞有增殖抑制作用和促凋亡作用，且優(yōu)于18β-甘草次酸(GA)。

18β-甘草次酸；哌嗪衍生物；SMMC-7721；細胞凋亡

甘草(glycyrrhiza)是一味重要的傳統(tǒng)中藥，其主要的活性成分是甘草次酸[1-2]。研究表明，甘草次酸不僅具有抗炎、抗?jié)?、抗過敏、抗病毒、免疫調節(jié)等功效[3-6]，還能抑制一些腫瘤細胞的生長[7-8]。但是由于甘草次酸幾乎不溶于水以及高濃度時對正常細胞的毒性作用，制約了其在臨床上的應用[9]。研究表明，甘草次酸通過某些改造和修飾后，其生物活性明顯提高[10-11]。哌嗪基團是一個增效基團，能有效地調節(jié)藥物的脂水分配系數(shù)和酸堿平衡常數(shù)，在很多的活性藥物分子中都含有這一骨架結構，顯示出廣泛的生物活性，如抗微生物、抗高血壓、抗癌、消炎和止痛等[12-14]。本研究將寧夏大學化工學院制備的18β-甘草次酸-哌嗪化合物D34、D35作用于SMMC-7721細胞，檢測其對細胞增殖的抑制作用，為獲取新藥成分奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 18β-甘草次酸(GA，規(guī)格：97%，Sigma)，18β-甘草次酸哌嗪衍生物D34、D35(由本?；W院提供，簡稱D34、D35)；MTT(凱基)；RPMI 1640培養(yǎng)基(GIBCO)；胎牛血清(HyClone)；DMSO(Sigma)；PBS(Solarbio)；Hoechst-33258細胞凋亡染色試劑盒(碧云天)；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡雙染試劑盒(BD)。

1.2 主要儀器 微量移液器(Thermo)；酶標儀(BIO-RAD)；熒光顯微鏡(LEICA，DM2500)；生物顯微鏡(OLYMPUS)；流式細胞儀(BD FACSCalibur)；培養(yǎng)箱(上海一恒)。

1.3 細胞株SMMC-7721 細胞株取自寧夏大學西部特色資源保護與利用教育部重點實驗室保存的種質庫中。

1.4 方法

1.4.1 18β-甘草次酸哌嗪衍生物的合成路線 18β-甘草次酸與哌嗪基團進行酰胺化反應得到18β-甘草次酸-哌嗪化合物(圖1)。D34、D35為其中的兩種化合物。

圖1 18β-甘草次酸哌嗪衍生物的合成路線Fig.1 The method of synthesizing 18β-GA derivatives containing piperazine

1.4.2 SMMC-7721細胞的培養(yǎng) 培養(yǎng)基：RPMI 1640培養(yǎng)基(含有100 mL/L胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素)；培養(yǎng)條件：50 mL/L的CO2的培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)。

1.4.3 鏡檢法觀察18β-甘草次酸衍生物對肝癌SMMC-7721細胞形態(tài)結構的影響 先將D34、D35、GA用DMSO配制成質量濃度為5 mg/mL的貯備液，臨用前用培養(yǎng)液稀釋成濃度梯度為50、25、12.5、6.25、3.125 μg/mL，備用。取對數(shù)生長期細胞，以3×103個/孔接種于96孔板，每孔100 μL。24 h后去上清，加入已經配置好的待測藥物，每孔100 μL。設空白對照并且每個藥物濃度設置5個平行孔，繼續(xù)培養(yǎng)，在24、48、72 h三個時段用倒置熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài)結構的變化。

1.4.4 MTT法檢測D34、D35對肝癌SMMC-7721細胞的增殖抑制作用 取對數(shù)生長期細胞，以3×103個/孔接種于96孔板，每孔100 μL。24 h后去上清，加入已經配置好的待測藥物，每孔100 μL。設空白對照并且每個藥物濃度設置5個平行孔，MTT法檢測藥物對細胞的增殖抑制作用。按下述公式計算抑制率：

1.4.5 Hoechst染色觀察 取經D34、D35、GA(終質量濃度50 μg/mL)作用72 h后的細胞，根據(jù)細胞凋亡Hoechst-33258染色試劑盒提供的操作步驟處理后，用熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài)的變化。

1.4.6 流式細胞術檢測細胞凋亡 取對數(shù)生長期的細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，每孔1×106個細胞,培養(yǎng)12 h。實驗組分別加入終質量濃度均為50 μg/mL藥物GA、D35、D34，對照組加入等量培養(yǎng)液。48 h后，收集細胞，按BD公司的Annexin V-FITC/PI雙染檢測凋亡的試劑盒步驟處理，用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

2 結 果

2.1 18β-甘草次酸衍生物對肝癌SMMC-7721細胞形態(tài)結構的影響 在顯微鏡下，未經藥物處理的細胞增殖很快，細胞貼壁生長良好，未出現(xiàn)膨脹和皺縮現(xiàn)象；但實驗組隨著藥物濃度的增加以及作用時間的延長，細胞出現(xiàn)皺縮、裂解、甚至碎片化。提示18β-甘草次酸及其衍生物對肝癌細胞的細胞形態(tài)有明顯影響，抑制了細胞的生長(圖2)。

圖2 GA、D35、D34(50 μg/mL) 作用不同時間段對SMMC-7721細胞形態(tài)的影響Fig.2 Effects of GA, D35, D34 (50 μg/mL) on the morphology of SMMC-7721cells at different time points (×200)

2.2 D34、D35、GA對細胞增殖的抑制作用 MTT法結果顯示，不同濃度的GA、D35、D34對SMMC-7721細胞增殖均有抑制作用，呈濃度依賴性，且D35、D34對SMMC-7721細胞增殖抑制率高于GA。經單因素ANOVA分析，D34、D35各組抑制率與對照組GA相比除個別數(shù)據(jù)外差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表1)。

2.3 Hoechst-33258熒光染色顯示藥物對細胞形態(tài)結構影響 收集經GA、D35、D34(終質量濃度均為50 μg/mL)處理72 h后的細胞，按細胞凋亡Hoechst-33258染色試劑盒步驟操作，用熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài)。結果顯示，對照組細胞形態(tài)結構完整，經染色呈現(xiàn)正常的均勻的藍色，只有個別細胞破碎，呈現(xiàn)亮藍色；實驗組細胞結構變形，呈現(xiàn)碎片狀，熒光顏色呈現(xiàn)亮藍色(圖3)。提示D34、D35對肝癌細胞有誘導其凋亡的作用。

圖3 Hoechst 染色SMMC-7721細胞的凋亡情況Fig.3 Apoptosis of Hoechst staining of SMMC-7721 cells (72 h, ×400)

表1 不同濃度D34、D35、GA對SMMC-7721人肝癌細胞的抑制率Tab.1 The inhibition rate of D34, D35 and GA on SMMC-7721 cells

2.4 流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率的比較 收集經GA、D34、D35(終質量濃度均為50 μg/mL)作用48 h的細胞，對照組為加入與實驗組等量的培養(yǎng)液的細胞，按BD公司Annexin V-FITC/PI雙染的檢測凋亡的試劑盒步驟處理，上流式細胞儀檢測細胞凋亡率(FL1為FITC熒光通道，F(xiàn)L2為PI熒光通道)。結果顯示，GA作用細胞后的凋亡率為23.95%、D35為26.71%、D34為36.95%，均高于未加藥處理組(4.23%)，且D35、D34的流式檢測凋亡率高于GA組(圖4)。

圖4 SMMC-7721細胞流式凋亡圖(48 h, 50 μg/mL)Fig.4 Apoptosis of SMMC-7721cells detected by flow cytometry (48 h, 50 μg/mL)

3 討 論

甘草次酸及其衍生物具有廣泛的藥理活性，特別是在抗腫瘤方面。越來越多的研究表明，18β-甘草次酸對多種癌細胞，如HepG2肝癌細胞、胃癌細胞等表現(xiàn)出比較強的生物活性[15]。高振北等[16]對18β-甘草次酸A環(huán)進行改造，其體外抗腫瘤活性與GA比明顯增強。文獻也報道了對甘草次酸進行其他化學修飾和結構改造后活性的變化，其抗炎、抗腫瘤、抗病毒等活性均得到提高[10-11]。

哌嗪基團是一個增效基團，在很多的活性藥物分子中都含有這一骨架結構，一些藥物天然結構中增加這一活性基團后，生物活性明顯提高。李學強等[13]在青蒿素上嫁接哌嗪基團后，對肝癌細胞SMMC-7721的增殖抑制率明顯增強。本實驗將18β-甘草次酸與哌嗪進行酰胺化反應得到了18β-甘草次酸-哌嗪化合物，經初篩后選取其中的D34、D35作用于SMMC-7721肝癌細胞，尋求提高藥用效果、降低其毒副作用的新藥成分。

本研究結果表明，18β-甘草次酸哌嗪衍生物D34、D35等對SMMC-7721細胞均有抑制作用且優(yōu)于18β-甘草次酸，特別是D34在低濃度下作用48 h后對肝癌細胞增殖抑制率達到了53%；從流式細胞凋亡數(shù)據(jù)可知，D35、D34均可誘導SMMC-7721肝癌細胞的凋亡，都優(yōu)于18β-甘草次酸，且D34的促凋亡比例更高 。提示，18β-甘草次酸經過結構改造增加哌嗪基團以后，其生物活性明顯提高。本研究為篩選出高活性的甘草次酸衍生物類藥物奠定了實驗基礎。而關于18β-甘草次酸哌嗪衍生物對SMMC-7721細胞的促凋亡的作用機制以及是否對正常細胞有毒性等有待下一步的研究。

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(編輯 卓選鵬)

Effects of 18β-glycyrrhetinic acid derivatives containing piperazine on SMMC-7721 cell activity

HAO Xiu-jing1,2, YANG Hui2, WANG Juan1,2, LI Min1,2, LI Xue-qiang2

(1. Key Laboratory of Ministry of Education for Conservation and Utilization of Special Biological Resources in the Western China, Ningxia 750021; 2. Ningxia University, Ningxia 750021, China)

Objective To study the effects of 18β-glycyrrhetinic acid derivatives containing piperazine D34 and D35 on the proliferation and apoptosis of SMMC-7721cells. Methods The morphology of the cells treated with 18β-glycyrrhetinic acid derivatives containing piperazine D34 and D35 was observed under the microscope. The cellular inhibition rate was detected by MTT; apoptosis was detected by Hoechst-33258 Staining Kit; and apoptosis rate was analyzed by flow cytometry method. Results The proliferation of SMMC-7721 cells was significantly inhibited by 18β-glycyrrhetinic acid derivatives containing piperazine D34 and D35 in a dose-dependent manner (P<0.05). Conclusion 18β-glycyrrhetinic acid derivatives containing piperazine D34 and D35 can inhibit the proliferation and induce the apoptosis of SMMC-7721 cells, and they are superior to GA.

18β-glycyrrhetinic acid; piperazine derivative; SMMC-7721; apoptosis

2015-12-01

2016-05-23

國家自然科學基金資助項目(No.21062014)

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.21062014)

郝秀靜. E-mail: shuaxinxianlu@163.com

R966

A

10.7652/jdyxb201606005

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20161010.1656.008.html(2016-10-10)