徐玉明 曹建民 陳玉平 王平 韓婷婷 黃巧婷

1杭州師范大學(xué)體育與健康學(xué)院（杭州 310036）2北京體育大學(xué)運動人體科學(xué)學(xué)院（北京 100086）

低氧調(diào)控大鼠運動性肌損傷的特征MicroRNA表達

徐玉明1曹建民2陳玉平1王平1韓婷婷2黃巧婷2

1杭州師范大學(xué)體育與健康學(xué)院（杭州 310036）2北京體育大學(xué)運動人體科學(xué)學(xué)院（北京 100086）

目的：篩選低氧調(diào)控大鼠運動性肌損傷（EIMD）的特征MicroRNA（miRNA），預(yù)測分析特征miRNA調(diào)控膜損傷的靶點。方法：56只健康雄性SD大鼠平均分為安靜對照組（C），運動后常氧休息24小時組（N24）、48小時組（N48）、72小時組（N72）以及運動后低氧暴露24小時組（H24）、48小時組（H48）、72小時組（H72），采取一次間歇性離心運動復(fù)制EIMD模型。采用伊文氏藍（EBD）染色法鑒定EIMD膜損傷特征，基因芯片進行低氧和常氧之間差異性miRNA篩選，RT-qPCR驗證芯片結(jié)果后獲得特征miRNA表達譜，比對各組的特征miRNA和膜損傷相關(guān)特征蛋白以及信號通路核心分子的mRNA表達，預(yù)測和分析特征miRNA的可能靶基因及調(diào)控途徑。結(jié)果：篩選并驗證得出5條低氧調(diào)控大鼠EIMD的特征miRNA：miR-694、miR-1904、miR-881*、miR-211-5p、miR-465-5p。通過特征miRNA、膜損傷相關(guān)蛋白和相關(guān)通路核心分子進行綜合對比以及生物信息學(xué)分析得出，miR-694的靶標可能性較大的是dystrophin、JNK和AKT以及mTOR；miR-211-5p的靶標可能性較大的是mTOR。結(jié)論：低氧可以影響EIMD大鼠腓腸肌miRNA表達譜發(fā)生明顯改變。miR-694和miR-211-5p有可能與低氧調(diào)控EIMD膜損傷的miRNA調(diào)控機制密切相關(guān)。

低氧；運動；骨骼??；損傷；膜；微小RNA

由高原訓(xùn)練演變而成的常壓低氧訓(xùn)練逐漸受到國內(nèi)外體育工作者的重視。骨骼肌是決定運動能力的根本因素，但目前關(guān)于低氧對骨骼肌影響的研究遠遠不夠。查閱國內(nèi)外文獻資料發(fā)現(xiàn)，更多的人熱衷于如何通過低氧訓(xùn)練進一步提高人體的運動能力，而很少有人關(guān)注低氧對運動性肌損傷（exercise-induced muscle damage，EIMD）的影響。膜損傷是EIMD的主要特征之一，在一定程度上可以被低氧所影響，這一點已經(jīng)被我們的前期研究證實。我們通過低氧運動實驗以及單獨低氧刺激非運動實驗發(fā)現(xiàn)，在低氧環(huán)境下運動或休息時，均會出現(xiàn)EIMD或類似的肌細胞損傷，表明除了機械應(yīng)力牽拉之外，低氧刺激也可導(dǎo)致肌纖維膜完整性下降和膜骨架蛋白dystrophin（抗肌萎縮蛋白）的丟失及其加劇，結(jié)果提示機械應(yīng)力并非細胞膜通透性改變的唯一原因[1，2]。那么，低氧通過何種途徑對EIMD膜損傷發(fā)揮調(diào)控作用？其相關(guān)機制研究值得期待。

MicroRNA（miRNA）已成為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點之一。研究發(fā)現(xiàn)，骨骼肌特異性miRNA，如miRNA-1、miRNA-133和miRNA-206，與骨骼肌內(nèi)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)密切相關(guān)[3，4]。有研究提示，MAPK與miRNA關(guān)系密切[5]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，低氧運動EIMD二次損傷后雖然mRNA的基因表達與蛋白變化關(guān)系密切，但其調(diào)控時間有一定程度的滯后，并不能很好地解釋dystrophin的代謝變化，結(jié)果提示除mRNA轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)之外，可能還存在一種轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)機制。那么低氧是否通過miRNA途徑來調(diào)控EIMD后的膜損傷修復(fù)，也引起我們的興趣。為此，本研究檢測和驗證低氧調(diào)控大鼠EIMD的特征miRNA表達，并進行低氧對EIMD膜損傷的相關(guān)miRNA調(diào)節(jié)機制的初步探索。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

8周齡雄性SD大鼠56只，體重196.75±8.14 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）2012-001，級別：SPF。國家標準嚙齒類動物飼料，分籠飼養(yǎng)，自由飲食、進水，12小時光照/12小時熄燈模擬日晝交替。室溫22±2℃，相對濕度30%～60%。

大鼠先適應(yīng)環(huán)境3天，根據(jù)體重采用隨機數(shù)表法隨機分為7組，安靜對照組（C），運動后常氧休息24小時組（N24）、48小時組（N48）、72小時組（N72）以及運動后低氧暴露24小時組（H24）、48小時組（H48）、72小時組（H72），每組均8只。具體見表1。

表1 實驗動物分組

1.2 運動方案與低氧處置

除安靜對照組外，所有大鼠在常氧環(huán)境下進行為期4天的適應(yīng)性跑臺訓(xùn)練和一次間歇性下坡跑離心運動，運動參數(shù)為：速度26.8 m/min，坡度－16°，運動5 min×10組，組間歇1 min。

運動后常氧休息組大鼠置于常壓常氧環(huán)境中飼養(yǎng)休息，而低氧暴露組大鼠置于常壓低氧環(huán)境中飼養(yǎng)。低氧的氧濃度為12.7%（DY-30制氮機，北京創(chuàng)文氣體設(shè)備有限公司；UP5-5.5空氣壓縮機：美國英格索蘭公司；RD-8HA冷凍干燥機：杭州超濾；KY-2F控氧儀，浙江建德）。

1.3 取材與處理

每組取2只大鼠，在取材前24 h進行腹腔注射熒光染料伊文氏藍（evans blue dye，EBD，Sigma），EBD分子量為961，是一種經(jīng)典的示蹤劑，它與血清蛋白結(jié)合形成伊文氏藍－白蛋白復(fù)合物（ESA），胞外的EBD可被熒光顯微鏡（568 nm）檢測出。如果胞內(nèi)大量出現(xiàn)，表明肌纖維膜完整性破壞[1，6]。

注射前EBD通過Millex-GP 0.22 μm過濾器（Millipore，Bedford）進行滅菌，注射量為1 mg EBD/0.1 ml PBS（PBS，pH 7.4）/10 g體重[2，7]。其中，N24和H24組EBD注射時間為運動后即刻，N48和H48組EBD注射時間為運動后24 h，N72和H72組EBD注射時間為運動后48 h。

首先，于冰上將腓腸肌切成小塊，用錫紙編號、包好，迅速投入液氮中，冰凍暫存，待取材完成后把腓腸肌標本轉(zhuǎn)移至－80℃冰箱保存，以備基因檢測使用。其

次，將每組2只EBD染色大鼠的腓腸肌于冰上切取3× 3×5 mm3大小的組織塊，放在提前準備的膠囊殼上，加入OCT包埋劑均勻包埋組織塊。然后投入用液氮預(yù)冷的裝有正己烷（－70℃）的小燒杯中速凍，用錫紙包裹好放入液氮保存，用于制作冷凍切片。

1.4 細胞膜的完整性檢測

將液氮保存的EBD染色并組織包埋過的腓腸肌組織塊在Leica冰凍切片機（CM 1850）內(nèi)進行切片，厚度為6 μm。熒光顯微鏡568 nm檢測。每樣本測量上、下、左、右、中部5個視野，利用激光共聚焦顯微鏡（Leica sp8）觀察EBD切片，并通過IPP光密度分析軟件統(tǒng)計EBD陽性細胞數(shù)目，以此反映肌纖維細胞膜完整性改變的范圍和力度。

1.5 miRNA基因芯片檢測及分析

1.5.1 基因芯片檢測

樣品進行RNA提取，然后應(yīng)用TaqMan miRNA reverse transcription kit（Life Technologies）進行反轉(zhuǎn)錄cDNA，再應(yīng)用7900HT Fast Real-Time PCR System進行miRNA array（Rodent A+B板）檢測。本部分實驗由北京邦菲生物科技公司完成。

1.5.2 差異miRNA的篩選

將兩組數(shù)據(jù)計算得到的Delta Ct（即每個miRNA位點的CT值-內(nèi)參基因的CT值）進行比較，計算得到每個miRNA位點在兩組數(shù)據(jù)之間的差異倍數(shù)。在計算過程中，所有CT值大于35的位點及未檢測到熒光信號的位點（Undetermined）其CT值均作為35計算。差異miRNA篩選標準：差異在2倍以上，P≤0.05。

1.6 實時熒光定量RT-qPCR

1.6.1 miRNA檢測

根據(jù)miRNA芯片分析結(jié)果，挑選出8種miRNA，包括miR-694、miR-1904、miR-881*、miR-467a、miR-211-5p、miR-465-5p、miR-337-3p、miR-493-3p，用SYBR GreenⅠReal Time PCR方法進行驗證，PCR擴增引物序列（北京Invitrogen公司合成）見表2。

表2 本研究miRNA擴增引物序列

采用TRNzol總RNA提取試劑進行樣本RNA提取，實驗操作按產(chǎn)品說明書進行；采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser進行cDNA反轉(zhuǎn)錄；用miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒（KR201）進行反轉(zhuǎn)錄；用ABI 7500型熒光定量PCR儀，給出各反應(yīng)孔的Ct值，以U6為內(nèi)參，采用2-△△CT法進行數(shù)據(jù)的相對定量分析。

1.6.2 RNA檢測

為了進一步探索分析目標miRNA對EIMD膜損傷的調(diào)控功能，采用實時熒光定量PCR檢測EIMD膜損傷相關(guān)特征蛋白和相關(guān)通路核心分子的mRNA表達，進行靶基因的初步篩選和分析，方法同上，PCR擴增引物序列（北京Invitrogen公司合成）見表3。

表3 本研究RNA擴增引物

1.7 特征miRNA靶基因生物信息學(xué)預(yù)測

查閱Mirbase數(shù)據(jù)庫，利用MIRDB和TARGETSCAN-VERT生物信息學(xué)軟件對實驗所篩選的特征miRNA進行靶基因預(yù)測分析。MIRDB和TARGETSCAN-VERT均是比較流行的miRNA靶標預(yù)測軟件，通過檢測miRNA與靶基因3’-UTR區(qū)靶位點的匹配度，計算引起翻譯抑制或mRNA降解的效率。本研究在對特征miRNA與膜損傷相關(guān)分子、相關(guān)通路核心分子基因表達關(guān)系及其相關(guān)性分析的基礎(chǔ)上，圍繞EIMD膜損傷進行雙向查詢與預(yù)測。

1.8 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行分析。所有數(shù)據(jù)均以“均數(shù)±標準差”（±s）的形式表示。采用T檢驗分析進行低氧和常氧對應(yīng)組之間的顯著性差異檢驗，采用Pearson相關(guān)分析法進行相關(guān)性檢驗，顯著性水平為P＜0.05或P＜0.01。

2 結(jié)果

2.1 EIMD動物模型復(fù)制的鑒定

結(jié)果表明，除C組肌纖維內(nèi)沒有明顯的EBD染料侵入之外；其余各組均出現(xiàn)明顯的EBD陽性纖維（圖1），表明纖維膜完整性破壞。

數(shù)據(jù)顯示（表4），一次性間歇離心運動后常氧環(huán)境下休息，骨骼肌陽性細胞率隨著運動后時間的延長而增加，于運動后48 h達到峰值，隨后72 h逐漸下降；低氧與常氧相比，陽性細胞率于運動后24 h達到最高，且由48 h至72 h下降趨緩，各組與常氧對應(yīng)組之間均存在顯著性差異（P<0.05）。

2.2 低氧和常氧對應(yīng)組的差異性表達miRNA芯片篩查

根據(jù)綜合倍數(shù)篩選：與N24組相比，在H24組樣本中，篩選出96個差異性表達miRNA，其中93個上調(diào)miRNA及3個下調(diào)miRNA；與N48組相比，H48組樣本中，篩選出123個差異性表達miRNA，僅有1個上調(diào)miRNA，其余122個均為下調(diào)miRNA。與N72組相比，H72組樣本中，篩選出23個差異性表達miRNA，其中5個上調(diào)miRNA，18個下調(diào)miRNA。

T檢驗的P值篩選：差異倍數(shù)FC≥2.0，P＜0.05者認為存在差異性表達，符合條件差異性表達miRNA：H24組樣本中，篩選出11個差異性表達miRNA，包括10個上調(diào)miRNA和1個下調(diào)miRNA；H48組樣本中，篩選出23個差異性表達miRNA，全部為下調(diào)miRNA。H72組樣本中，篩選出2個差異性表達miRNA，均為上調(diào)miRNA（表5）。

2.3 差異miRNA的RT-qPCR驗證

結(jié)合3組結(jié)果，分別從20倍（除了48h對應(yīng)組為15倍）以上miRNA分子中選取8種miRNA進行驗證，包括miR-694、miR-1904、miR-881*、miR-467a、miR-211-5p、miR-465-5p、miR-337-3p、miR-493-3p。

圖1 本研究各組腓腸肌EBD染色熒光顯微觀察圖

表4 EBD陽性細胞率結(jié)果

表5 低氧和常氧對應(yīng)組之間的差異性表達miRNA

采用SYBR Green I RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，其中miR-467a、miR-337-3p、miR-493-3p結(jié)果與芯片結(jié)果不一致，為假陽性。另miR-694在72 h對應(yīng)組（N72—H72）倍數(shù)差異顯著，為假陰性。其余5個miRNA分子基因表達水平與芯片結(jié)果相比較，除了倍數(shù)差異較大之外，差異變化總體基本一致（圖2）。因此，將miR-694、miR-1904、miR-881*、miR-211-5p、miR-465-5p列為低氧調(diào)控EIMD的特征miRNA，即下一步探討研究的目的miRNA。

圖2 差異miRNA的RT-qPCR驗證結(jié)果

2.4 特征miRNA與膜損傷相關(guān)分子、相關(guān)通路核心分子基因表達的關(guān)系

RT-qPCR檢測結(jié)果表明，24 h對應(yīng)組（H24—N24）之間，膜損傷相關(guān)蛋白Dystrophin、Calpain3和相關(guān)通路核心分子JNK基因表達存在顯著性差異（P＜0. 05），與之對應(yīng)的是miR-1904、miR-881*、miR-694；48 h對應(yīng)組（H48—N48）之間，僅有相關(guān)通路核心分子P38基因表達存在顯著性差異（P＜0.05），與之對應(yīng)只有miR-694；而72 h對應(yīng)組（H72—N72）之間，相關(guān)通路核心分子AKT、mTOR基因表達存在顯著性差異（P＜0.05），與之對應(yīng)的是miR-211-5p、miR-465-5p、miR-694。

表6 各對應(yīng)組基因差異表達指標

2.5 靶基因的生物信息學(xué)初步查詢與分析

查閱Mirbase數(shù)據(jù)庫，利用MIRDB和TARGETSCAN-VERT針對5個目的miRNA以及6個膜損傷相關(guān)分子進行雙向預(yù)測靶基因查詢，結(jié)果如表7。將表7與表6結(jié)果進行綜合對比分析可以得出，miR-694的靶標可能性較大的是dystrophin、JNK和AKT以及mTOR；miR-211-5p的靶標可能性較大的是mTOR。

表7 生物信息學(xué)預(yù)測靶基因結(jié)果

3 討論

本研究中，為了探討低氧對EIMD膜損傷的相關(guān)miRNA調(diào)節(jié)機制，我們首先在采用一次間歇性下坡跑離心運動成功復(fù)制出EIMD大鼠模型的基礎(chǔ)上，分別對應(yīng)設(shè)置了EIMD低氧24小時和48小時恢復(fù)組。考慮到低氧對EIMD恢復(fù)的阻滯作用，增設(shè)了常氧和低氧恢復(fù)72小時組。其次，采用Life Technologies的miRNA表達譜芯片技術(shù)分析低氧和常氧對應(yīng)組之間的差異表達miRNA，研究低氧調(diào)控大鼠EIMD膜損傷的特征miRNA表達。

我們通過差異倍數(shù)篩選芯片結(jié)果后發(fā)現(xiàn)，對應(yīng)組之間相比，24 h組、48 h組和72 h組分別篩選出96個、123個和23個差異miRNA；根據(jù)綜合倍數(shù)和T檢

驗的P值進一步篩選分別得出11個、23個和2個差異miRNA；為了集中研究范圍，增加差異倍數(shù)為FC≥20（24h對應(yīng)組例外），P＜0.05再次篩選為8種特征miRNA；通過RT-qPCR驗證結(jié)果剔除3個假陽性miRNA，最終將miR-694、miR-1904、miR-881*、miR-211-5p、miR-465-5p共5種miRNA列為低氧調(diào)控EIMD的特征miRNA。研究發(fā)現(xiàn)，芯片結(jié)果有假陽性和假陰性發(fā)生，但這些特征miRNA經(jīng)過嚴格地篩選和驗證，其最終結(jié)果比較可靠。查閱低氧和miRNA的相關(guān)文獻，僅有心肺機能方面平滑肌和心肌的相關(guān)研究，而未見到有關(guān)骨骼肌方面的研究報道，本研究所發(fā)現(xiàn)的低氧調(diào)控EIMD的特征miRNA，為今后的相關(guān)研究提供了新的途徑。

心臟毒素誘發(fā)的損傷、基因敲除以及離體實驗等肌損傷調(diào)控研究發(fā)現(xiàn)，miR-133[4]和miR-206[3]均與肌損傷有關(guān)。但本研究結(jié)果的低氧與常氧之間的差異miRNA沒有包括miR-1、miR-133、miR-206、miR-499等任一肌特異性miRNA，表明低氧對EIMD的影響并非通過肌特異性miRNA進行調(diào)控。

為了進一步探討低氧對大鼠EIMD調(diào)控的miRNA機制，本研究還比較分析了特征miRNA與膜損傷相關(guān)分子、相關(guān)通路核心分子基因表達的關(guān)系，假設(shè)提出3條疑似調(diào)控線路，分別是24 h對應(yīng)組的miR-694、miR-1904、miR-881*—JNK—Dystrophin、Calpain3；48 h對應(yīng)組的miR-694—P38；72 h對應(yīng)組的miR-694、miR-211-5p、miR-465-5p—AKT、mTOR。值得關(guān)注的是，miR-694在24 h、48 h和72 h對應(yīng)組均表現(xiàn)為差異，國內(nèi)外至今還未見有關(guān)miR-694的任何報道，其生物學(xué)功能應(yīng)引起重視和進一步研究。

mTOR（mammalian target of rapamycin，哺乳類動物雷帕霉素靶蛋白）屬于磷脂酰肌醇激酶相關(guān)激酶家族成員，是哺乳動物細胞內(nèi)自噬非常重要的信號分子之一[8]。mTOR存在兩種復(fù)合物形式，即由mTOR與raptor、deptor、PRAS40和mLST8組成的mTOR C1（mTOR complex 1）和由mTOR與rictor、sin1、mLST8、deptor及protor形成的mTOR C2（mTOR complex 2）[9]。mTOR C1對雷帕霉素敏感，調(diào)節(jié)細胞增殖、凋亡和自噬等；而mTOR C2對雷帕霉素耐受，與細胞骨架構(gòu)建和細胞運動有關(guān)[10]，也有報道m(xù)TOR與低氧誘導(dǎo)因子HIF-1α表達關(guān)系密切[11]。文獻發(fā)現(xiàn)，miR-211和miR-465a的生物學(xué)功能目前主要表現(xiàn)在參與多種腫瘤細胞的調(diào)控方面[12，13]。表7結(jié)果不支持miR-465a與mTOR之間的調(diào)控關(guān)系，而支持miR-211參與mTOR調(diào)控的可能性，這一點還需下一步進行功能學(xué)和結(jié)構(gòu)學(xué)的實驗證實。

了解miRNA的作用機制，關(guān)鍵是明確miRNA及其靶基因的相互作用。本研究對特征miRNA靶基因的生物信息學(xué)查詢與分析（表7），在綜合分析的基礎(chǔ)上，將上述3條疑似調(diào)控線路進一步聚焦到2個miRNA：miR-694和miR-211-5p。本研究推測，EIMD低氧恢復(fù)時，miR-694的高表達可以調(diào)控對應(yīng)靶標dystrophin基因表達降低而導(dǎo)致EIMD膜損傷，其相關(guān)信號通路可能與JNK和AKT有關(guān)。另外，還可能存在一條途徑：低氧刺激通過miR-211-5p調(diào)控mTOR而影響EIMD低氧恢復(fù)，表7結(jié)果顯示miR-211-5p的可能靶基因為Rictor，其參與構(gòu)成的mTOR C2主要功能包括細胞骨架構(gòu)建，提示其可能與EIMD膜損傷有關(guān)，但這一通路具體如何作用于膜相關(guān)蛋白而影響其通透性，本研究沒有發(fā)現(xiàn)更多信息和提示。

綜上結(jié)果表明，miR-694和miR-211-5p可能是大鼠EIMD膜損傷調(diào)控的特征miRNA，尤其是miR-694在低氧對EIMD的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。目前相關(guān)領(lǐng)域關(guān)于miRNA的研究較少，本研究新靶點的發(fā)現(xiàn)及其相關(guān)調(diào)控機制的提示可以為后續(xù)研究提供新的途徑，具有較大的研究前景。

4 小結(jié)

本研究應(yīng)用芯片技術(shù)篩選出低氧調(diào)控EIMD的特征miRNA表達譜，表明低氧可以影響EIMD大鼠腓腸肌miRNA表達譜明顯改變。研究認為miR-694和miR-211-5p有可能與低氧調(diào)控EIMD的miRNA調(diào)控機制密切相關(guān)，應(yīng)該進一步采用過表達miRNA以及活體miRNA干擾實驗進行miRNA靶基因的功能驗證，為低氧訓(xùn)練中合理控制和預(yù)防運動性損傷等研究尋求突破。

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The Specific MicroRNA Expression Influenced by Hypoxia of Exercises-induced Muscle Damage Rats

Xu Yuming1，Cao Jianmin2，Chen Yuping1，Wang Ping1，Han Tingting2，Huang Qiaoting2
1 Sports and health college of Hangzhou Normal University，Hangzhou 310036，China 2 Sport science college of Beijing Sport University，Beijing 100086，China Corresponding Author：Xu Yuming，Email：xuyuming110@126.com

Objective To screen the specific MicroRNAs（miRNAs）expressions influenced by hypoxia，and predict the specific miRNAs regulated target of sarcolemmal damage of exercise-induced muscle damage（EIMD）rats.Methods Fifty-six male Sprague-Dawley rats were randomly divided into a normoxic control group（C），a post-exercise 24-hour normoxic recovery group（N24），a post-exercise 48-hour normoxic recovery group（N48），a post-exercise 72-hour normoxic recovery group（N72），and post-exercise 24/48/72-hour hypoxic recovery groups（H24/H48/H72）.The EIMD model was introduced to all rats through an acute eccentric exercise and the EIMD characteristics were verified using Evan's blue dye（EBD）staining. Differentially expressed miRNAs between hypoxia and normoxia were detected using the microarray assay.The specific miRNAs expressions were further validated using the real-time quantitative PCR（RT-qPCR）.The specific miRNAs and mRNA expressions of associated proteins and core molecules in related pathway of the sarcolemmal damage were compared among the different groups to analyze and predictargets of specific miRNAs and its regulation approach.Results Five specific expressed miRNAs were found，including miR-694，miR-1904，miR-881*，miR-211-5p and miR-465-5p.The result of comparative analysis and

hypoxia，exercise，skeletal muscle，damage，sarcolemma，MicroRNA

2016.2.23

國家自然科學(xué)基金資助項目（31271276）

徐玉明，Email：xuyuming110@126.com

bioinformatics indicated that predicted targets of miR-694 were more likely to include dystrophin，JNK，AKT and mTOR，and that of miR-211-5p was mTOR.Conclusion The expression profile of miRNAs in EIMD rat is significantly affected by hypoxia．MiR-694 and miR-211-5p may be closely related to the mechanism in specific miRNA expression，which is influenced by hypoxia in the sarcolemmal damage of EIMD rats.