吳偉懷，楊先鋒，梁艷瓊，汪全偉，鄭金龍，鄭肖蘭，習(xí)金根，李銳，張馳成，賀春萍*，易克賢*

（1.農(nóng)業(yè)部橡膠樹生物學(xué)與遺傳資源利用重點實驗室/省部共建國家重點實驗室培育基地—海南省熱帶作物栽培生理學(xué)重點實驗室/農(nóng)業(yè)部儋州熱帶作物科學(xué)觀測實驗站，海南儋州571737；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護研究所/農(nóng)業(yè)部熱帶農(nóng)林有害生物入侵檢測與控制重點開放實驗室/海南省熱帶農(nóng)業(yè)有害生物檢測監(jiān)控重點實驗室，海南?？?71101；3.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技信息研究所，海南?？?71101）

甘蔗黑穗病菌和赤腐病菌雙重PCR檢測體系的建立

吳偉懷1，2，楊先鋒1，梁艷瓊2，汪全偉3，鄭金龍2，鄭肖蘭2，習(xí)金根2，李銳2，張馳成2，賀春萍2*，易克賢2*

（1.農(nóng)業(yè)部橡膠樹生物學(xué)與遺傳資源利用重點實驗室/省部共建國家重點實驗室培育基地—海南省熱帶作物栽培生理學(xué)重點實驗室/農(nóng)業(yè)部儋州熱帶作物科學(xué)觀測實驗站，海南儋州571737；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護研究所/農(nóng)業(yè)部熱帶農(nóng)林有害生物入侵檢測與控制重點開放實驗室/海南省熱帶農(nóng)業(yè)有害生物檢測監(jiān)控重點實驗室，海南?？?71101；3.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技信息研究所，海南?？?71101）

目前，針對甘蔗黑穗病菌與赤腐病菌單個病菌檢測體系已相繼建立，但是仍然未見兩個病原菌的雙重PCR檢測方法。在本研究中，根據(jù)黑穗病菌交配型bE基因、甘蔗赤腐病菌特異性SCAR片段序列的特異性引物，在二者單一PCR檢測體系的基礎(chǔ)上，建立并優(yōu)化可同時檢測黑穗病菌和赤腐病菌的雙重PCR檢測方法。建立的雙重PCR檢測體系可從黑穗病菌與赤腐病菌樣品中分別擴增出320 bp和442 bp的特異條帶。靈敏度分析結(jié)果表明，對混合模板黑穗病菌與赤腐病菌的最低檢測水平量均為0.1ng。

甘蔗黑穗病菌；甘蔗赤腐病菌；雙重PCR；檢測體系

甘蔗黑穗病與甘蔗赤腐病是我國甘蔗種植區(qū)中普遍發(fā)生的兩種真菌病害。前者由甘蔗鞭黑粉菌Sporisorium scitamineum引起，其典型特征是黑鞭在種植約120d才會出現(xiàn)[1]，而后者則由鐮型炭疽菌Colletotrichum falcatum Went引起，二者最初的傳播均可通過種莖傳播，屬于種傳播病害?，F(xiàn)有研究表明，控制甘蔗黑穗病害比較難，目前主要依靠種植抗病品種、種植無病種莖苗以及結(jié)合植物檢疫[1-2]。因此，建立病害的靈敏、可靠且高通量的檢測技術(shù)體系是有必要的。

目前，針對黑穗病菌與赤腐病菌單個病原菌檢測體系已相繼建立。早在1996年，Albert和Schenck基于Usilago maydis bE交配基因設(shè)計了引物對bE4/bE8用于擴增甘蔗黑穗病菌“＋”、“－”交配型單倍體；通過該引物對擴增得到的bE基因區(qū)域與Usilago maydis和Ustilago hordei具有70%的同源性。應(yīng)用這對引物可以從甘蔗組織和甘蔗黑穗病菌雙核菌絲體的混合DNA中擴增到目的片段[3]。隨后，這對引物被用于從發(fā)病甘蔗組織中分離獲得的甘蔗黑穗病菌單倍體和雙核菌絲體DNA進行擴增，獲得了495 bp大小的特異片段，而從酵母狀細(xì)菌和腐生真菌DNA中沒有擴增出目的條帶，進一步證明了該對引物能用于該病菌的特異性檢測[4]。最近，同樣基于bE交配基因序列特異性區(qū)域，設(shè)計了特異性引物bEQ-F/bEQ-R以及TaqMan探針（bEQ-P），從而成功建立了甘蔗黑穗病菌TaqMan Real-time PCR檢測體系，使得其檢測靈敏度提高到10 ag（黑穗病菌）以及0.8 ng（甘蔗基因組DNA）[5]。在甘蔗赤腐病菌方面，Nithya等通過RAPD分析來自印度Tamil Nadu不同甘蔗赤腐病菌菌株，鑒定了一個對赤腐病菌特異的RAPD OPE-01標(biāo)記，該標(biāo)記可從基因組中擴增出約560bp的序列。基于此序列，設(shè)計了1對能從赤腐病菌基因組特異地擴增出大小為442bp的SCAR標(biāo)記[6]。隨后，Chandra等根據(jù)這442bp的特異性序列設(shè)計了兩個外引物以及兩個內(nèi)引物，最終形成了6組LAMP引物，并對其進行了篩選，建立了甘蔗赤腐病菌LAMP檢測體系，從而實現(xiàn)了該菌檢測的可視化[7]。然而，在實際生產(chǎn)中，這兩種病菌往往同時存在，此時，通過單一病原菌的檢測技術(shù)一一檢測則顯得很繁瑣。為此，本研究擬以黑穗病交配型bE基因、甘蔗赤腐病菌特異性SCAR片段序列特異設(shè)計引物，建立二者的雙重PCR體系，以期達(dá)到高通量、準(zhǔn)確、快速的檢測。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株本研究所用的甘蔗黑穗病菌菌株收集自廣東湛江甘蔗種植地，而甘蔗赤腐病菌株則采自海南澄邁甘蔗種植區(qū)（表1）。兩個對照菌株甘蔗輪斑病菌菌株采自海南昌江甘蔗地。以上菌株均保存于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護研究所。

1.2方法

1.2.1菌絲體收集及基因組DNA的提取利用馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基對各供試單孢菌株，于28℃，160 r/min搖菌約5d后，對菌絲體進行過濾收集。收集的菌絲體迅速于液氮中研磨，后進行基因組DNA提取。DNA提取采用真菌DNA提取試劑盒（E.Z.N.A Fungal DNA kit，Omega公司，美國）提取，具體實驗步驟參考其說明書進行。

1.2.2引物的確定與合成查閱文獻，根據(jù)已報道的特異引物，并下載其對應(yīng)靶基因或靶序列。最終從GenBank中下載甘蔗黑穗病菌交配型bE基因的序列（U61290.1）以及甘蔗赤腐病菌特異性SCAR標(biāo)記序列（JN545852）。根據(jù)多重PCR引物設(shè)計原則，對各病原菌已有特異性引物進行分析。最終確定用于本研究的甘蔗黑穗病菌引物為CLS 320F/R[8]，用于本研究的甘蔗赤腐病菌的引物為SCAR-F/R[6]。引物序列委托英駿生物技術(shù)有限公司采用脫鹽純化方式進行合成（表2）。

1.2.3PCR擴增體系及反應(yīng)條件基因組單一PCR反應(yīng)體系為20 μL，其中DNA模板各1μL，10 μL 2× EcoTaq PCR SuperMix，引物總體積為1 μL（10.0 μM），最后以ddH2O補齊。PCR反應(yīng)在Mastercycler gradient Mastercycler PCR擴增儀上進行，擴增程序為：94℃預(yù)變性3 min；隨后94℃變性30 s，55℃~64℃退火30 s，72℃延伸40 s，擴增35個循環(huán)；最后72℃延伸5 min，20℃保存。PCR擴增產(chǎn)物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下照相并保存。以單一PCR體系為參考，分別對引物體積（初始濃度均為10.0 μM）以及退火溫度兩個參數(shù)進行優(yōu)化，引物體積比分別設(shè)1∶1、1∶2、2∶1三個體積比，退火溫度則分別設(shè)55℃、58℃、61℃、64℃四個溫度梯度。

1.2.4雙重PCR體系的特異性分析選取13個黑穗病菌、8個赤腐病菌菌株，并以甘蔗輪斑病菌與ddH2O作為對照進行PCR特異性驗證。

1.2.5雙重PCR體系的靈敏度分析用超微量分光光度計（NanoDrop 2000c）分別將甘蔗黑穗病菌與甘蔗赤腐病菌基因組DNA初始濃度調(diào)整為100 ng/μL，用ddH2O采用濃度梯度稀釋法將兩個目標(biāo)菌DNA依次進行100～109倍的稀釋，并各取1μL進行PCR。PCR擴增產(chǎn)物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下照相并保存。以肉眼可見特異電泳條帶所對應(yīng)的DNA模板濃度，得出單一PCR與雙重PCR檢測的靈敏度。

表1　 供試菌株Table 1　Isolates used in this study

表2　 靶標(biāo)基因及特異引物序列

2　結(jié)果與分析

2.1雙重PCR擴增體系的建立及優(yōu)化

分別對引物按體積比為1∶1、1∶2、2∶1進行反應(yīng)體系配制，然后在退火溫度按55℃、58℃、61℃、64℃反應(yīng)條件下分別進行PCR擴增（圖1，A、B、C）。實驗結(jié)果表明，當(dāng)引物體積比為1∶1，退火溫度為55℃時，PCR擴增出來的條帶比較均勻且條帶清晰，其檢測結(jié)果與單一PCR擴增結(jié)果比較相一致（圖1A）。

圖1　雙重PCR與單一PCR擴增Fig.1 Duplex and single PCR amplification

2.2雙重PCR體系的特異性分析

利用已建立的雙重PCR擴增體系，分別對兩種目標(biāo)菌以及1種非目標(biāo)菌進行雙重PCR體系的特異性分析。結(jié)果表明，在兩種目標(biāo)菌中13個甘蔗黑穗病菌與8個甘蔗赤腐病菌均出現(xiàn)了與預(yù)期大小一致的特異性條帶，而在非目標(biāo)菌甘蔗輪斑病菌的兩個菌株中均未出現(xiàn)特異性條帶（圖2）。在陰性對照水中也無任何條帶出現(xiàn)（圖2）。由此可見，該雙重PCR體系具有良好的特異性。

2.3雙重PCR體系的靈敏度檢測

各取1μL已按10倍遞進稀釋法稀釋過的甘蔗黑穗病菌樣品DNA（初始濃度為100 ng/μL）、甘蔗赤腐病菌DNA（初始濃度為100 ng/μL）、以及二者按等體積混合的混合模板進行PCR檢測的靈敏度分析。檢測結(jié)果表明，當(dāng)稀釋倍數(shù)為103時，即甘蔗黑穗病菌基因組DNA濃度為0.1 ng/μL，擴增出清晰條帶；而在稀釋倍數(shù)為104時，無可見條帶（圖3A）。當(dāng)稀釋倍數(shù)為103時，即甘蔗赤腐病基因組DNA濃度為0.1 ng/μL，擴增出清晰條帶；而在稀釋倍數(shù)為104時，即甘蔗赤腐病菌基因組DNA濃度為0.01 ng/μL，沒有擴增出可見條帶（圖3B）。由此表明，可以從稀釋103倍的甘蔗黑穗病菌、赤腐病菌DNA中檢測出清晰條帶。而在雙重PCR結(jié)果中，當(dāng)稀釋103倍時，即甘蔗黑穗病菌、甘蔗赤腐病菌基因組DNA濃度均為0.1 ng/μL時，擴增出清晰條帶；而在稀釋104倍時，只有微弱的印跡（圖3C）。由此可見單一PCR檢測與雙重PCR檢測靈敏度是一致的。所以，用此雙重PCR檢測體系，在擴增35個循環(huán)后，1%瓊脂糖凝膠電泳顯示最低檢測DNA模板水平均為0.1 ng。

圖2　雙重PCR特異性分析Fig.2 The specificity analysis of the duplex PCR

圖3　雙重PCR與單一PCR靈敏度比較分析Fig.3 Detection sensitivity comparison between multiplex PCR and mono-PCR

3　討論

傳統(tǒng)上對病原真菌鑒定需要進行病原菌培養(yǎng)，然后根據(jù)其病原菌形態(tài)、致病性測定以及孢子形態(tài)特征等方面進行鑒定，此方法步驟繁瑣，耗時費力。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，許多PCR、多重PCR、Real-time PCR以及近年新發(fā)展起來的LAMP技術(shù)已廣泛用于病原菌的檢測。與傳統(tǒng)方法相比，這些方法普遍具有快速、靈敏等特點。就甘蔗病害而言，許多研究者將這些方法應(yīng)用于甘蔗病害的檢測，僅甘蔗黑穗病菌交配型bE基因已被不同地區(qū)的學(xué)者用做PCR檢測的靶標(biāo)基因[3-5，8]。如Chen基于黑穗病菌bE交配型基因序列保守區(qū)域設(shè)計了一對特異性引物對CLS 320F/CLS 320R，利用該對引物對來自臺灣不同甘蔗品種的黑穗病菌進行了分子檢測，能從中擴增出一條320bp的條帶[8]。此外，PCR檢測技術(shù)也已廣泛應(yīng)用在甘蔗細(xì)菌病害甘蔗宿根矮化病菌、甘蔗花葉病毒PCR檢測[9]、甘蔗黃葉病毒PCR檢測[9，11]，以及植原體病害甘蔗白葉病菌PCR檢測[12-13]、甘蔗草苗病菌PCR檢測[14]。總之，一些甘蔗重要病原菌的單一PCR檢測技術(shù)已初步建立，部分甘蔗病毒病的高通量檢測技術(shù)體系也已建立[15]。本試驗在參考前人的研究結(jié)果基礎(chǔ)之上[3-5，7-8]，基于黑穗病交配型bE基因、甘蔗赤腐病菌特異性SCAR片段序列保守區(qū)域，按照多重PCR引物設(shè)計原理，建立了兩種常見甘蔗真菌病害快速檢測的雙重PCR方法。檢測結(jié)果表明，可從黑穗病菌與赤腐病菌樣品中分別擴增出320 bp和442 bp的特異條帶。靈敏度分析結(jié)果表明，對混合模板中黑穗病菌與赤腐病菌的最低檢測水平量均為0.1ng。這一結(jié)果與單一檢測黑穗病菌與甘蔗赤腐病菌的結(jié)果相一致[3，6]。

在多重PCR檢測體系中，靶基因的選擇至關(guān)重要。一般選擇一些看家基因。如ITS、beta微管蛋白、肌動蛋白、延長因子、細(xì)胞色素氧化酶基因等保守基因的序列特異性分析，從而確定合適的靶標(biāo)基因。通過分析這些看家基因序列的特異性，從中查詢到一些比較特異的區(qū)段，設(shè)計引物。誠然，這些基因序列并不是總有足夠多的變異的位點來區(qū)分所有的種。如甘蔗赤腐病菌其靶標(biāo)序列則是通過RAPD分析來自印度Tamil Nadu不同甘蔗赤腐病菌菌株獲得特異性片段，然后再將特異片段轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記[6]。除此之外，引物設(shè)計質(zhì)量直接影響多重PCR的特異性與靈敏度，這些是在建立多重PCR檢測體系時值得注意的。

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Establishment of Duplex PCR Detection System for Sporisorium scitamineum and Colletotrichum falcatum from Sugarcane

WU Wei-huai1,2,YANG Xian-feng1,LIANG Yan-qiong2,WANG Quan-wei3,ZHENG Jin-long2, ZHENG Xiao-lan2,XI Jin-gen2,LI Rui2,ZHANG Chi-cheng2,HE Chun-ping2*,YI Ke-xian2*

(1.Opening Project Fund of Key Laboratory of Rubber Biology and Genetic Resource Utilization,Ministry of Agriculture/State Key Laboratory Breeding Base of Cultivation＆Physiology for Tropical Crops/Danzhou Investigation&Experiment Station of Tropical Crops,Ministry of Agriculture,Danzhou,Hainan 571737;2.Environment and Plant Protection Institute,CATAS/Ministry of Agriculture Key Laboratory for Monitoring and Control of Tropical Agricultural and Forest Invasive Alien Pests/Hainan Key Laboratory for Detection and Control of Tropical Agricultural Pests,Haikou,Hainan 571101,China;3.Institute of Scientific and Technical Information CATAS,Haikou,Hainan 571101,China)

At present,the polymerase chain reaction assay have developed for accurate and sensitive detection of smut(Sporisorium scitamineum)and red rot disease（Colletotrichum falcatum）in sugarcane respectively,but duplex PCR detection method of them still did not be established.In the present study,a polymerase chain reaction assay was developed for simultaneous detection of S.scitamineum and C.falcatum using the specific primer pair CLS 320F/R and SCAR F/R based on the bE region of S.scitamineum and the SCAR regions of C. falcatum respectively.The results showed that the 320 bp and 442 bp specific fragment was amplified only from S.scitamineum and C.falcatum,respectively.The detection sensitivity of S.scitamineum and C.falcatum was both 0.1 ng for genomic DNA.

Sporisorium scitamineum;Colletotrichum falcatum；duplex PCR;detection system

S435.661

A

1007－2624（2016）02－0001－04

10.13570/j.cnki.scc.2016.02.001

2016-01-14

中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所省部重點實驗室/科學(xué)觀測實驗站開放課題（RRI-KLOF201506）；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項(2012hzs1J012、2014hzs1J012、2015hzs1J014)。

吳偉懷，男，博士，副研究員；研究方向：植物病理；電話：0898-08986696238；E-mail：weihuaiwu2002@163.com

賀春萍，女，碩士，副研究員；研究方向，植物病理；E-mail：hechunppp@163.com。

易克賢，男，博士，研究員；研究方向：分子抗性育種。E-mail：yikexian@126.com。