盧 劍，范素芳，李 強(qiáng)，夏 靜，李 揮，張 巖,*

（1.江蘇省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，江蘇 南京 210029；2.河北省食品檢驗(yàn)研究院，河北 石家莊 050091；3.河北省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050091）

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定豬肉中萬古霉素、去甲萬古霉素和替考拉寧

盧 劍1，范素芳2,3，李 強(qiáng)2,3，夏 靜2,3，李 揮2,3，張 巖2,3,*

（1.江蘇省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，江蘇 南京 210029；2.河北省食品檢驗(yàn)研究院，河北 石家莊 050091；3.河北省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050091）

建立豬肉樣品中萬古霉素、去甲萬古霉素和替考拉寧的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法，采用選擇反應(yīng)監(jiān)測方式，外標(biāo)法定量。豬肉樣品經(jīng)0.1%甲酸-乙腈（85∶15，V/V）溶液提取，正己烷脫脂后，萬古霉素和去甲萬古霉素經(jīng)陽離子交換柱凈化、替考拉寧經(jīng)C18固相萃取柱凈化，以乙腈-0.1%甲酸為流動(dòng)相梯度洗脫，經(jīng)C18柱分離、質(zhì)譜進(jìn)行測定。添加量為10、20 μg/kg和50 μg/kg時(shí)，方法回收率范圍為75.3%～83.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于9%。豬肉中萬古霉素、去甲萬古霉素的檢出限、定量限分別為2 μg/kg和4 μg/kg，替考拉寧的檢出限、定量限分別為4 μg/kg和8 μg/kg。該方法適用于豬肉樣品中萬古霉素、去甲萬古霉素和替考拉寧的定性、定量檢測。

豬肉；萬古霉素；去甲萬古霉素；替考拉寧；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

萬古霉素和去甲萬古霉素屬于三環(huán)糖肽類抗生素[1]，可用于治療由嚴(yán)重耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和耐甲氧西林表皮葡萄球菌引起的感染[2]。替考拉寧也屬于糖肽類抗菌藥物[3]，是一種對革蘭氏陽性菌和厭氧微生物起作用的新型糖肽類抗生素[4]。萬古霉素的作用主要是抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，由于其較強(qiáng)的抗菌作用，萬古霉素在臨床上使用較少[5]。萬古霉素等糖肽類抗生素對牛乳腺炎等疾病具有較好的治療效果[1]。近年來，一些養(yǎng)殖者和飼料生產(chǎn)企業(yè)在動(dòng)物飼喂過程中添加萬古霉素等抗生素，對人類安全造成威脅[5]。

目前，萬古霉素、去甲萬古霉素和替考拉寧的測定方法主要有高效液相色譜法[6-12]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）法[1,4-5,13-19]、化學(xué)發(fā)光免疫法[20-21]、熒光偏振免疫法[2]等，多為測定血漿中濃度。由于萬古霉素、去甲萬古霉素和替考拉寧易溶于水，微溶于甲醇、乙腈等有機(jī)溶劑，因此前處理多采用高比例水相為提取液，后續(xù)還要經(jīng)固相萃取柱凈化。

本實(shí)驗(yàn)擬建立基于HPLC-MS/MS法的豬肉中萬古霉素、去甲萬古霉素和替考拉寧的快速測定方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉 市購；乙腈（色譜純） 美國Fisher Scientific公司；正己烷（分析純） 北京化學(xué)試劑公司；去離子水 屈臣氏集團(tuán)（香港）有限公司；萬古霉素、去甲萬古霉素和替考拉寧（A2-2）標(biāo)準(zhǔn)品（純度大于98%） 中國食品藥品檢定研究院；甲酸（色譜純）美國Supelco公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UltimateTM3000高效液相色譜儀（配有電噴霧離子源的Quantiva質(zhì)譜儀） 美國Thermo Scientific公司；3K13高速冷凍離心機(jī) 美國Sigma公司；VORTEX 3渦旋混勻儀 德國IKA公司；KQ-500DB超聲波清洗器昆山市超聲儀器公司；C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）、陽離子交換柱（3 mL、60 mg） 美國Waters公司；C18固相萃取柱（3 mL、100 mg） 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

萬古霉素、去甲萬古霉素和替考拉寧標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液的配制：分別準(zhǔn)確稱取10.20 mg萬古霉素、去甲萬古霉素和替考拉寧的標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，加入少量去離子水溶解，并用去離子水定容至刻度，制得的1 mg/mL萬古霉素、去甲萬古霉素和替考拉寧的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液于4 ℃條件下存儲。

萬古霉素、去甲萬古霉素和替考拉寧混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制：分別取萬古霉素、去甲萬古霉素和替考拉寧的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液1 mL于10 mL容量瓶中，用去離子水定容至刻度，得質(zhì)量濃度為100 μg/mL的萬古霉素、去甲萬古霉素和替考拉寧混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.2 樣品提取與凈化

提?。悍Q取5.0 g豬肉樣品，加入20 mL 0.1%甲酸-乙腈（85∶15，V/V）溶液，渦旋混勻3 min，超聲提取15 min，于4 ℃ 9 500 r/min離心5 min，取上清液10 mL待凈化。

凈化：向10 mL待凈化液中加入10 mL正己烷，渦旋混勻1 min，4 ℃ 9 500 r/min離心5 min，取下層清液過定性濾紙。萬古霉素、去甲萬古霉素：采用陽離子交換柱凈化，上樣前固相萃取柱依次用甲醇和0.1 mol/L鹽酸各3 mL活化，上樣后用3 mL甲醇淋洗，3 mL 體積分?jǐn)?shù)5%氨水-甲醇溶液洗脫，收集洗脫液于40 ℃氮吹至干，用1 mL 0.1%體積分?jǐn)?shù)甲酸溶液復(fù)溶，過0.22 μm微孔濾膜后，HPLC-MS/MS測定。替考拉寧：采用C18固相萃取柱凈化，上樣前依次用3 mL甲醇和3 mL水活化，3 mL 0.1%甲酸-乙腈（9∶1，V/V）溶液平衡，上樣后，分別用2 mL 0.1%甲酸-乙腈（9∶1，V/V）溶液和1 mL體積分?jǐn)?shù)50%甲醇溶液淋洗，棄去淋洗液，然后用8 mL甲醇洗脫，收集洗脫液于40 ℃氮吹至干，用1 mL體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸溶液復(fù)溶，過0.22 μm微孔濾膜后，HPLC-MS/MS測定。

1.3.3 HPLC-MS/MS條件

1.3.3.1 HPLC條件

采用Waters ACQUITY UPLC BEH Shield C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）進(jìn)行目標(biāo)化合物的分離，乙腈和0.1%甲酸溶液為流動(dòng)相，采用梯度洗脫模式，梯度洗脫條件見表1。流速0.3 mL/min，進(jìn)樣體積2 μL。分析時(shí)間與色譜柱平衡時(shí)間為13 min。

表1 梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions

1.3.3.2 MS條件

電離方式：電噴霧離子源；離子傳輸管溫度333 ℃；掃描模式：正離子模式；噴霧電壓3 500 V；鞘氣壓力40 arb；輔助氣壓力12 arb；霧化器溫度317 ℃。本實(shí)驗(yàn)采用選擇反應(yīng)監(jiān)測模式，具體MS參數(shù)見表2。

表2 監(jiān)測離子對及MS參數(shù)Table 2 Monitored ion pairs and mass spectral parameters

2 結(jié)果與分析

2.1 MS條件的優(yōu)化

采用針泵注射的方式進(jìn)行MS條件的優(yōu)化，50.0 μg/mL的萬古霉素、去甲萬古霉素和替考拉寧標(biāo)準(zhǔn)溶液在正離子模式下掃描，通過一級掃描找到分析物的母離子，通過二級MS掃描找到母離子對應(yīng)的碎片離子。萬古霉素、去甲萬古霉素和替考拉寧分子質(zhì)量大，進(jìn)入一級MS后很容易與H+結(jié)合，產(chǎn)生雙電荷的離子。3 種化合物均選擇[M+H]2+作為母離子，通過優(yōu)化碰撞能找到相應(yīng)的子離子。3 種分析物的MS條件見表2。

2.2 HPLC條件的優(yōu)化

萬古霉素和去甲萬古霉素的結(jié)構(gòu)十分類似，簡單的等度洗脫無法將二者分開，因此采用梯度洗脫模式。正離子模式下，流動(dòng)相中加入少量甲酸能提高離子化效率，改善峰型，但甲酸含量高時(shí)會抑制離子化，本實(shí)驗(yàn)選擇0.1%甲酸溶液為流動(dòng)相。有機(jī)相考察甲醇、乙腈，結(jié)果表明選用乙腈時(shí)分析物峰形的對稱性更好。因此選擇乙腈-0.1%甲酸溶液為流動(dòng)相，具體梯度洗脫條件見表1。

在該條件下萬古霉素、去甲萬古霉素和替考拉寧的保留時(shí)間分別為1.65、1.48 min和5.08 min，如圖1所示。

圖1 3 種分析物的HPLC-MS/MS圖Fig. 1 Chromatography-mass spectrometry profi les of three analytes

2.3 前處理方法的優(yōu)化

已有文獻(xiàn)[1,5,15]報(bào)道的前處理過程大都為液液提取、固相萃取柱凈化，而固相萃取柱集中在陽離子交換柱、HLB柱和C18柱等。用去離子水配制100 ng/mL的萬古霉素、去甲萬古霉素、替考拉寧的混合標(biāo)液，采用標(biāo)準(zhǔn)溶液直接過固相萃取柱凈化的方式考察不同固相萃取柱的影響。結(jié)果表明，陽離子交換柱（3 mL、60 mg）凈化和HLB柱（6mL、500 mg）時(shí)，萬古霉素和去甲萬古霉素的回收率在75%左右，而替考拉寧的回收率只有20%左右；用C18柱（3 mL、100 mg）凈化時(shí)，替考拉寧的回收率80%左右，但萬古霉素和去甲萬古霉素的回收率低于10%。因此，萬古霉素、去甲萬古霉素采用陽離子交換柱凈化，替考拉寧采用C18柱凈化。

液液提取步驟考察了0.1%甲酸溶液、0.1%甲酸-乙腈（90∶10，V/V）溶液、0.1%甲酸-乙腈（85∶15，V/V）溶液、0.1%甲酸-乙腈（70∶320，V/V）溶液的影響。以0.1%甲酸溶液提取時(shí)，所得凈化液不夠澄清，分析物的出峰拖尾嚴(yán)重；隨著乙腈相比例的提高，分析物峰形有所改善，但乙腈相比例超過20%時(shí)影響替考拉寧的回收率。最后選擇0.1%甲酸-乙腈（85∶15，V/V）溶液作為提取液。

豬肉樣品經(jīng)0.1%甲酸-乙腈（85∶15，V/V）溶液超聲提取、離心后，增加了正己烷除脂步驟，取10 mL上清液加入等體積的正己烷，渦旋混勻1 min后離心，可以看到正己烷層明顯有油脂析出，說明正己烷除脂效果比較明顯。

2.4 方法驗(yàn)證

2.4.1 方法的線性范圍、檢出限和定量限

采用外標(biāo)法定量，萬古霉素、去甲萬古霉素和替考拉寧基質(zhì)匹配標(biāo)液的峰面積為縱坐標(biāo)y，以其質(zhì)量濃

度（ng/mL）為橫坐標(biāo)x做標(biāo)準(zhǔn)曲線。萬古霉素的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y= 1.37×104x-186.8，線性范圍為10～100 ng/mL，線性相關(guān)系數(shù)為0.999 5；去甲萬古霉素的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為y=8.41×103x-26.7，線性范圍為10～100 ng/mL，線性相關(guān)系數(shù)為0.999 3；替考拉寧基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為y=2.23×104x+ 9.82×103，線性范圍為20～100 μg/mL，線性相關(guān)系數(shù)為0.999 1。以分析物信噪比為3時(shí)添加水平為檢出限，以分析物信噪比為10時(shí)添加水平為定量限，萬古霉素、去甲萬古霉素的檢出限、定量限分別為2 μg/kg和4 μg/kg，替考拉寧的檢出限、定量限分別為4 μg/kg和8 μg/kg。

2.4.2 方法的準(zhǔn)確度與精密度

用回收率來判定方法的準(zhǔn)確度，分別作10、20 μg/kg和50 μg/kg 3 個(gè)水平添加，每個(gè)水平設(shè)5 個(gè)重復(fù)。方法的精密度用該5 次平行實(shí)驗(yàn)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）表示。萬古霉素、去甲萬古霉素和替考拉寧在3 個(gè)水平的回收率范圍為75.3%～83.3%，RSD小于9%，具體數(shù)據(jù)見表3。

表3 方法的回收率與精密度Table 3 Recoveries and precision of the method

2.4.3 方法的基質(zhì)效應(yīng)評價(jià)

基質(zhì)是指除分析物之外的組分，在質(zhì)譜的測定過程中與分析物共流出的樣品基質(zhì)會干擾分析物的離子化過程，造成離子化受到抑制或得到增強(qiáng)，這種現(xiàn)象稱為基質(zhì)效應(yīng)[22-23]。Paul等[24]于1993年研究電噴霧原理時(shí)發(fā)現(xiàn)了基質(zhì)效應(yīng)的存在。本實(shí)驗(yàn)用萬古霉素、去甲萬古霉素和替考拉寧基質(zhì)匹配標(biāo)線的斜率與純?nèi)軇┲袠?biāo)曲斜率的比來評價(jià)基質(zhì)效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)中基質(zhì)效應(yīng)以下式表示：

式中：ME為基質(zhì)效應(yīng)；Slopematrix和Slopeslovent分別表示基質(zhì)匹配標(biāo)曲的斜率和純?nèi)軇ㄈルx子水）標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。

ME大于100%時(shí)代表存在離子增強(qiáng)效應(yīng)，ME小于100%時(shí)代表存在離子抑制效應(yīng)。萬古霉素、去甲萬古霉素和替考拉寧的ME分別為75.7%、82.5%和90.2%，表示3 種分析物都存在離子化抑制效應(yīng)，并且萬古霉素和去甲萬古霉素的基質(zhì)效應(yīng)比較嚴(yán)重。

2.5 實(shí)際樣品的測定

采用本方法，對當(dāng)?shù)爻匈徺I的20 份豬肉樣品進(jìn)行測定，結(jié)果均未檢出。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立豬肉樣品中萬古霉素、去甲萬古霉素和替考拉寧的HPLC-MS/MS測定方法，采用選擇反應(yīng)監(jiān)測方式，外標(biāo)法定量。5.0 g豬肉樣品，加入20 mL 0.1%甲酸-乙腈（85∶15，V/V）溶液，經(jīng)渦旋混勻、超聲提取、離心后，提取液經(jīng)正己烷脫脂后，萬古霉素和去甲萬古霉素經(jīng)陽離子交換柱凈化、替考拉寧經(jīng)C18固相萃取柱凈化后用HPLC-MS/MS測定。添加水平10、20 μg/kg和50 μg/kg時(shí)，方法回收率范圍為75.3%～83.3%，RSD小于9%。豬肉中萬古霉素、去甲萬古霉素的檢出限、定量限分別為2 μg/kg和4 μg/kg，替考拉寧的檢出限、定量限分別為4 μg/kg和8 μg/kg。

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Determination of Vancomycin, Norvancomycin and Teicoplanin in Pork by High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

LU Jian1, FAN Sufang2,3, LI Qiang2,3, XIA Jing2,3, LI Hui2,3, ZHANG Yan2,3,*
(1. Jiangsu Provincial Supervising and Testing Research Institute for Products Quality, Nanjing 210029, China; 2. Hebei Food Inspection and Research Institute, Shijiazhuang 050091, China; 3. Heibei Food Safety Key Laboratory, Shijiazhuang 050091, China)

A high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method was developed for the determination of vancomycin, norvancomycin and teicoplanin in pork samples. The selective reaction monitoring mode was applied in the experiment and an external standard method was used for quantifi cation. Pork samples were weighed, extracted with deionized water containing 0.1% formic acid-acetonitrile (85:15, V/V). Hexane was added to decrease fatty acid. Vancomycin and norvancomycin were cleaned on a cation exchange column, while teicoplanin was cleaned up on an SPE C18cartridge. Acetonitrile-water containing 0.1% formic acid was used as mobile phase and gradient elution was used in the experiment. The analytes were separated on a C18column and then detected by mass spectrometry. The average recoveries of the method were in range of 75.3%□83.3% at spike levels of 10, 20 and 50 μg/kg, with relative standard deviations (RSDs) lower than 9%. The Limit of detection (LOD) and the limit of quantitation (LOQ) were 2 and 4 μg/kg for vancomycin, and 4 and 8 μg/kg for norvancomycin, respectively. The method could be used for the qualitative and quantitative detection of vancomycin, norvancomycin and teicoplanin in pork samples.

pork; vancomycin; norvancomycin; teicoplanin; high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS)

10.7506/spkx1002-6630-201610033

TS207.3

A

1002-6630（2016）10-0193-05

盧劍, 范素芳, 李強(qiáng), 等. 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定豬肉中萬古霉素、去甲萬古霉素和替考拉寧[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(10): 193-197. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201610033. http://www.spkx.net.cn

LU Jian, FAN Sufang, LI Qiang, et al. Determination of vancomycin, norvancomycin and teicoplanin in pork by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Food Science, 2016, 37(10): 193-197. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201610033. http://www.spkx.net.cn

2016-02-29

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31401584）；河北省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（C2015321005）

盧劍（1978—），男，高級工程師，碩士，研究方向?yàn)槭称钒踩夹g(shù)。E-mail：lujian_hzp@163.com

*通信作者：張巖（1979—），男，教授級高級工程師，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩-mail：snowwinglv@126.com