徐容

(南通衛(wèi)生高等職業(yè)技術學校藥學醫(yī)技系，江蘇 南通 226000)

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高效液相色譜法和生物效價測定法在縮宮素注射劑質量控制中的對照研究

徐容

(南通衛(wèi)生高等職業(yè)技術學校藥學醫(yī)技系，江蘇 南通 226000)

目的 采用高效液相色譜法(HPLC)對縮宮素注射劑進行質量控制，同時與傳統(tǒng)的生物效價測定法進行比照，觀察兩種方法的優(yōu)劣。方法 選取8個企業(yè)生產的100個批次的縮宮素注射劑，分別采用HPLC法和生物效價法對樣本進行測定，并將結果進行比較，并進一步觀察樣品的長期穩(wěn)定性。結果 兩種方法檢測的縮宮素含量除兩家藥企外(P=0.027、P=0.011)，其他企業(yè)生產的縮宮素含量差異無統(tǒng)計學意義(P=0.556、0.637、0.614、0.559、0.315、0.429)；8家藥企的縮宮素注射劑含量在55.9%～126.1%之間，平均98.5%，其中有三個企業(yè)生產的縮宮素注射劑含量相對偏低；縮宮素注射劑儲存2年后其效價顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義(P=0.025)。結論 采用HPLC法對縮宮素注射劑測定，操作相對簡便，靈敏度和準確度高，有效避免了生物效價測定法因動物個體差異造成的誤差，同時也能將人為測定的誤差控制在較小的范圍內。另縮宮素注射劑最佳存貯期為2年，時間過長會導致藥劑中部分有效成分降解。

縮宮素；HPLC法；質量控制；穩(wěn)定性

縮宮素(oxytocin)注射劑是臨床產科常用藥物，主要用于催產、引產及產后因宮縮無力導致的子宮出血等癥狀[1]。它主要通過結合妊娠子宮平滑肌上相應的受體，刺激子宮節(jié)律性收縮，在產婦宮縮無力難產時，增加子宮收縮強度和頻率，使胎兒順利娩出，此外，它還可刺激乳腺平滑肌，促進乳汁分泌[2]。目前，國產縮宮素注射劑生產廠家繁多，質量控制是不可或缺的重要環(huán)節(jié)，國家藥典中對于縮宮素質量控制的主要方法還是生物效價測定法[3]，但該法由于用到動物實驗，可能會因動物個體差異產生一定的誤差，另外對研究人員的操作要求較高，后期在結果處理時人為因素干擾較大[4]。為建立一種更加客觀、簡便、準確的質控方法，筆者通過不斷改進，建立以HPLC法測定宮縮素質量的檢測方法，并與生物效價測定結果進行對照，現(xiàn)將結果報告如下。

1 儀器和試劑

主要實驗儀器包括美國Thermo公司TSQ Quantum Ultra三重四級桿液相色譜質譜聯(lián)用儀，美國Agilent公司HP1100高效液相色譜儀，傅里葉變換紅外光譜儀，紫外分光光度計，紫外燈，奧爾科特立體器官測定系統(tǒng)，乙腈等。標準品縮宮素由中國食品藥品檢定研究院提供(批號150529-200902)，去氨加壓素的標準品由GL Biochem公司生產(批號P100518-ZG061714)規(guī)格為每瓶5.7 mg，純度98.87%。本研究中用來分析的8個企業(yè)生產共100個批次的縮宮素注射劑規(guī)格均為10 IU·mL-1，另外取江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院2013年國家評價性抽驗縮宮素注射液留樣，在10～20 ℃，相對濕度30%～50%下儲存，作為藥物穩(wěn)定性的研究標本。

2 試驗方法

2.1 生物效價測定法測定縮宮素效價 本研究中的生物效價測定法采用的是大鼠離體子宮法，實驗前48 h于大鼠子宮兩側皮下注射乙烯雌酚，實驗當天取處死小鼠子宮置于離體器官恒溫水浴裝置中，用生物記錄儀張力傳感器連接，供試品和標準品分別用生理鹽水進行稀釋，分為高低不等的4個劑量，按照2010年版《中國藥典》[5]中縮宮素生物測定法標準執(zhí)行，借助藥典中量反應平行線法對得到的實驗結果進行可靠性檢驗，排除不可靠的實驗結果后，按照剩余結果計算效價。

2.2 高效液相色譜法(HPLC)測定縮宮素效價 縮宮素HPLC法測定中，填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠，取940 mL磷酸二氫鈉(0.1 mol·L-1)溶液，同時加入60 mL(0.1 mol·L-1)磷酸氫二鈉溶液混勻，通過磷酸溶液將pH值調至6.0，取上述緩沖液作為流動相A，將乙腈和水按照1∶1比例混勻，作為流動相B，按照以下標準進行梯度洗脫，洗脫時間0、5、35、35.1、45 min，對應流動相A百分率75%、75%、35%、75%、75%，對應流動相B百分率25%、25%、65%、25%、25%。取適量去氨加壓素和縮宮素標準品，配制系統(tǒng)適用性試驗溶液，其中每毫升溶液中含5 μg去氨加壓素和5 IU縮宮素，將試驗溶液分離度控制在5.0以上。取縮宮素標準品通過流動相A稀釋至10 IU·mL-1作為對照溶液，另取適量待檢的縮宮素注射液，通過流動相A進行稀釋，稀釋濃度為10 IU·mL-1，作為供試品溶液，取供試品溶液100 μL進樣，通過外標法計算峰面積從而最終得出待檢注射劑中縮宮素含量。

3 方法學考察

3.1 專屬性考察 首先，按照“2.2”項中的方法配制只含有輔料的空白樣品溶液進樣，色譜圖見圖1，通過圖1可以明確輔料對于樣品測定中的主峰無干擾。本研究中，我們通過多種破壞性試驗，使待檢樣本中產生出各種雜質，作為縮宮素雜質對照品，通過觀察主峰和雜質的分離情況，為縮宮素注射劑質量控制提供數(shù)據(jù)支持。其中，破壞性試驗取試驗樣品三份，加入1 mL濃度為1 mol·L-1鹽酸，1 mL濃度為1 mol·L-1氫氧化鈉溶液，沸水中加熱三種方法進行破壞，將破壞后的溶液pH調至7，按照“2.2”項中方法進樣，分析色譜圖(見圖2)，可以發(fā)現(xiàn)經過破壞性試驗產生的雜質對照品中各雜質與主峰分離度好，不干擾樣品測定。

圖1 空白輔料色譜圖

圖2 樣品與雜質對照品主峰分離度色譜圖

3.2 建立標準曲線 以流動相A將適量縮宮素標準品依次稀釋成23.04、11.52、5.76、2.88、1.44、0.72、0.36 IU·mL-1的六種溶液，各取6種溶液100 μL，依次通過HPLC色譜儀進行分析，將得到的色譜圖中縮宮素標準品的峰面積(A)和分別對應的濃度(C)進行線性回歸，從而建立標準曲線方程：Y=6.847×10-6X+0.432,r=0.998，同時也說明在此濃度范圍內，縮宮素的濃度與峰面存在良好的線性關系。

3.3 穩(wěn)定性試驗 將“2.2”項下方法制備的供試品溶液分別于0、12、18、24、35 h時間點進行進樣分析，計算上述時間點下測得的縮宮素峰值面積，未發(fā)現(xiàn)顯著性下降，證明供試品溶液的穩(wěn)定性較好。

3.4 檢驗限度和定量限度 通過流動相A稀釋縮宮素標準品，濃度0.01～1 IU·mL-1，按照“2.2”項下方法進樣，通過色譜圖觀察得出檢驗限度為0.15 IU，定量限度為0.51 IU。

3.5 重復性實驗 分別量取100 μL縮宮素注射劑樣品6份，按照“2.2”項方法進樣，觀察色譜圖，通過外標法計算得出各樣品含量平均值為98.4%，RSD<1.0%，證明該法具有良好的重復性。

3.6 回收率實驗 取縮宮素標準品溶液3份，將濃度調至2、10、30 IU·mL-1，分別取上不同濃度的縮宮素標準品溶液1 mL，同9份已知含量的縮宮素注射劑樣品混勻，通過液相色譜-二級質譜連用(LC-MS/MS)法測得從低到高三種濃度混合溶液的回收率分別為99.25%(RSD=0.72%)，99.41%(RSD=0.51%)，98.92%(RSD=0.78%)，平均回收率為99.27%。

3.7 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSS17.0進行分析，組內比較采用配對t檢驗，多組間比較采用方差分析，率比較采用χ2檢驗，進一步的組間比較采用LSD檢驗，相關性分析采用Pearson相關性分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

4 結果

4.1 縮宮素注射劑含量測定 以“2.2”項方法對8家企業(yè)生產的100個批次縮宮素注射劑樣品含量進行測定的色譜圖見圖3，通過計算各樣品含量在55.9%～126.1%之間，平均98.5%，其中有3個企業(yè)生產的縮宮素注射劑含量偏低。對各企業(yè)的縮宮素注射劑含量測定結果進行方差分析發(fā)現(xiàn)，其差異有統(tǒng)計學意義(F=3.724，P=0.031，P<0.05)，表明這些企業(yè)在生產縮宮素注射劑過程中投料量差異較大，造成這些差異主要屬于人為原因造成，不在系統(tǒng)誤差之列，另外個別企業(yè)不同批次的縮宮素注射劑含量之間也存在差異，離散度較大，說明該企業(yè)產品質量波動較大，應適當改進，見圖4。

圖3 各企業(yè)縮宮素注射劑色譜圖

圖4 各生產企業(yè)縮宮素注射劑含量

4.2 HPLC法和生物效價測定法測定縮宮素標準品的精密度比較 根據(jù)“2.1”項和“2.2”項方法對縮宮素標準品效價進行測定發(fā)現(xiàn)，生物效價測定法9次測量結果分別為9.73、9.91、9.56、9.95、10.02、9.68、9.86、10.14、10.32 IU·mL-1，測定值變動范圍9.56～10.32 IU·mL-1，相對標準偏差RSD=3.4%，平均效價9.91 IU·mL-1；HPLC法的9次測量結果分別為9.78、9.82、9.91、9.88、9.89、9.96、9.85、9.79、9.88 IU·mL-1，測定值變動范圍9.78～9.96 IU·mL-1，相對標準偏差RSD=0.65%平均效價9.86 IU·mL-1。提示HPLC法精密度要高于生物效價測定法。

4.3 HPLC法和生物效價測定法測定企業(yè)縮宮素樣品的效價比較 分別在“2.1”和“2.2”項方法下對本研究的8個企業(yè)100批次的試驗樣品進行測定后比較，結果顯示，兩種方法檢測的縮宮素含量除兩家藥企外，其他企業(yè)生產的縮宮素差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1，將兩者進行Pearson檢驗顯示，兩者差異有統(tǒng)計學意義(r=0.624，P<0.05)。

表1 兩種方法的含量測定結果比較

4.4 縮宮素注射劑長期穩(wěn)定性分析 將2013年和2014年國家評價性抽驗縮宮素注射液留樣通過“2.2”項方法進行檢測，同該企業(yè)最新生產的縮宮素注射劑含量水平進行比照發(fā)現(xiàn)，2013年生產的縮宮素注射劑有效成分含量明顯降低(P=0.025)，但2014年生產的制劑含量與2015年生產的制劑含量比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.419)，表明該制劑存在長期貯存效價降低的風險。

5 討論

《中國藥典》中現(xiàn)行的縮宮素注射劑含量測定標準中，以大鼠離體子宮收縮為實驗基礎，操作較復雜，且試驗周期長，人為因素造成的誤差較大，對操作人員的要求高，且重復性欠佳[5]。這些問題如果得不到有效解決，會對企業(yè)在藥物生產時出現(xiàn)投料偏差的問題，導致藥物整體質量和效果達不到臨床要求，造成患者治療的延誤[6-9]。隨著HPLC技術以及檢驗設備的不斷優(yōu)化，越來越多的政府藥檢機構及藥物生產企業(yè)開始使用該法來實現(xiàn)藥物的質量控制，由于該法操作簡單，靈敏度和專屬性強，只要操作人員嚴格按照操作流程執(zhí)行，其結果一般較為客觀準確，并且可重復性好[10]。

本研究顯示，HPLC法同藥典中傳統(tǒng)的生物效價測定法對本組宮縮素注射劑樣品的檢測結果差異不大，而結合該法的其他優(yōu)越性，有必要將藥典中的標準質量檢測方法更換。其次，通過HPLC法檢測8家藥企共100個批次的縮宮素注射劑質量發(fā)現(xiàn)，有2家企業(yè)通過這兩種方法測得的縮宮素質量差異較大，其余企業(yè)產品差異無統(tǒng)計學意義，這可能與用到的動物個體之間存在差異較大或者人為誤差等導致。另外，本研究對縮宮素注射劑貯存穩(wěn)定性進行檢測后發(fā)現(xiàn)，該藥物(10～20 ℃，相對濕度30%～50%)2年后其效價均不同程度較低，提醒臨床使用該藥物時，應注意生產日期，對于2年以上的該藥物，應盡量避免給患者使用。

綜上所述，應用HPLC法測定縮宮素注射劑，具有靈敏度高、專屬性強、靈敏度高、準確性好、操作簡單等優(yōu)點，本研究為宮縮素質量控制水平的提高具有一定的價值。

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A comparative study on the quality control of oxytocin injection by HPLC and BA

XU Rong

(DepartmentofPharmacyandMedicalTechniques,NantongHealthHigherOccupationTechnicalSchool,Nantong,Jiangsu226000,China)

Objective To compare the advantages and disadvantages of HPLC and BA which control the quality of oxytocin injection.Methods We selected 100 batches of oxytocin injection which were produced by 8 enterprises,chose HPLC and BA to measure the samples and compared the test results.Results Differences between the two methods for detecting the oxytocin levels in oxytocin injection produced by two companies were significant (P=0.027,P=0.011),while differences among other oxytocin injection manufacturers were not statistically significant (P=0.556,0.637,0.614,0.559,0.315,0.429).The oxytocin injection content of 8 pharmaceutical companies were within 55.9%～126.1%,averaged 98.5%.The contents of oxytocin injection produced by three enterpriseswere relatively low.After 2 years of storage,the titer of oxytocin injection was significantly decreased with statistically significant difference (P=0.025).Conclusions HPLC used to determine oxytocin injection is relatively simple,sensitive and accurate,which can not only effectively avoid the error due to individual differences of BA,but also control human error of determination within a small range.Besides,the best storage duration for oxytocin injection is 2 years.

Oxytocin;HPLC method;Quality control;Stability

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.10.014

2016-06-15，

2016-07-19)