董德剛，劉小雪，張秀英，王藝歡

(1.大連醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，遼寧 大連 116027；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院，遼寧 沈陽 110847)

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桑白皮多糖對呼吸道合胞病毒肺炎小鼠肺組織病理和外周血T細(xì)胞亞群的影響

董德剛1，劉小雪2，張秀英2，王藝歡2

(1.大連醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，遼寧 大連 116027；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院，遼寧 沈陽 110847)

目的 通過研究桑白皮多糖對呼吸道合胞病毒(RSV)肺炎BALB/c小鼠肺組織病理形態(tài)和外周血T細(xì)胞亞群的影響，探討桑白皮多糖對BALB/c小鼠RSV肺炎的干預(yù)機(jī)制。方法 BALB/c小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、高劑量組、中劑量組、低劑量組，每組10只；除正常組外，用RSV(long株)經(jīng)鼻腔接種，建立小鼠RSV肺炎模型。于感染當(dāng)天，高、中、低劑量組分別給予桑白皮多糖182、91、45.5 mg·kg-1·d-1灌胃，正常組與模型組給予等體積生理鹽水灌胃，每天1次，于感染第7天取外周血進(jìn)行T細(xì)胞亞群的檢測及肺組織進(jìn)行HE染色。結(jié)果 桑白皮多糖能有效地減少肺泡壁炎細(xì)胞的浸潤，改善肺組織的炎癥狀況。高、中、低劑量組與模型組比較，高劑量組CD3+T細(xì)胞百分率為(50.35±8.97)%、CD4+T/CD8+T為(3.52±0.79)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；中劑量組CD3+T細(xì)胞百分率為(55.05±5.94)%、 CD4+T細(xì)胞百分率為(20.39±5.56)%、CD4+T/CD8+T為(2.88±0.56)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05) ；低劑量組只有CD4+T/CD8+T為(3.49±0.45)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 桑白皮多糖可以改善肺炎小鼠肺組織病理變化，能夠調(diào)節(jié)機(jī)體細(xì)胞免疫。

桑白皮多糖；肺炎；呼吸道合胞病毒；小鼠；T細(xì)胞亞群

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)是導(dǎo)致嬰幼兒嚴(yán)重下呼吸道感染的重要的病毒病原之一[1-2]。但至今尚未有能夠用于預(yù)防人RSV感染的疫苗問世[3]，中藥單體和復(fù)方對于呼吸道合胞病毒防治研究取得了巨大的成果[4]。桑白皮為?？浦参锷orusalbaL.的干燥根皮，功效瀉肺平喘，利水消腫，用于肺熱咳喘，小便不利，面目浮腫等癥?！侗静菥V目》中云：“桑白皮專于利小水，乃實(shí)則瀉其子也，故肺中有水氣及肺火有余者，宜之”。為小兒呼吸道疾病常用中藥。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，桑白皮具有止咳祛痰平喘[5]、保護(hù)急性肺損傷[6]等作用，桑白皮多糖為其主要活性成分之一。本研究將通過觀察桑白皮多糖對RSV肺炎小鼠肺組織病理形態(tài)和外周血T細(xì)胞亞群的影響，探討其對RSV感染是否存在防治作用，以期為RSV感染的防治和桑白皮的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)BALB/c小鼠50只，體質(zhì)量12～14 g，雌雄各半，由遼寧長生生物有限公司提供，合格證號(hào)：SCXK(遼)2010-0001。

1.2 細(xì)胞 人喉癌上皮細(xì)胞(Hep-2細(xì)胞)由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院病毒實(shí)驗(yàn)室提供；采用含有10%高品質(zhì)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱里培養(yǎng)，以EDTA-胰酶按常規(guī)方法傳代培養(yǎng)。

1.3 病毒 呼吸道合胞病毒(RSV)(long株，購于中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒所毒種室)，保存在遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院病毒室液氮罐中。

1.4 藥品 桑白皮總多糖購自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)：ZL20140815C。

1.5 主要試劑 抗小鼠CD3 單克隆抗體(APC標(biāo)記，批號(hào)：100235)、抗小鼠CD4單克隆抗體(FITC標(biāo)記，批號(hào)：100509)、抗小鼠CD8單克隆抗體(PE標(biāo)記，批號(hào)：100707)均為Biolegend公司產(chǎn)品。

1.6 主要儀器 全自動(dòng)流式細(xì)胞儀(BD FAcscalibur，美國)；自動(dòng)組織脫水機(jī)(LEICA TP1020 ，德國)；自動(dòng)組織染色機(jī)(LEICA Autostainer XL ，德國)；石蠟包埋機(jī)(LEICA GE1150 ，德國)；切片機(jī)(LEICA RM2135 ，德國)；系統(tǒng)生物顯微鏡(OLYMPUS BX50F4，日本)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 RSV的擴(kuò)增及組織細(xì)胞半數(shù)感染量(TCID50)的測定 將復(fù)蘇成功的RSV(long)株接種處于半對數(shù)生長期的、長成單層70%以上的Hep-2細(xì)胞增值，對RSV進(jìn)行培養(yǎng)測定，應(yīng)用Reed-Muench公式計(jì)算RSV(Long株)TCID50為10-2/100 μL。

2.2 動(dòng)物模型的建立、藥物干預(yù) 將50只BALB/c小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、高劑量組、中劑量組、低劑量組，每組10只，在清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，除正常組外其余各組小鼠給予RSV病毒long株每只50 μL滴入鼻孔(正常組以50 μL生理鹽水滴鼻) 制備模型。滴鼻2 h后開始灌胃，高劑量組予桑白皮多糖182 mg·kg-1·d-1灌胃，中劑量組予桑白皮多糖91 mg·kg-1·d-1灌胃，低劑量組予桑白皮多糖45.5 mg·kg-1·d-1灌胃，正常組與模型組予等體積生理鹽水灌胃，每天1次。

2.3 取材及指標(biāo)檢測 于感染第7天摘眼球取血，肝素管抗凝，用于流式細(xì)胞儀檢測T細(xì)胞亞群；并處死小鼠取出肺組織，用4%的中性甲醛溶液固定，4 ℃保存，用于病理學(xué)觀察。

取小鼠外周新鮮全血20 μL，加抗小鼠單克隆抗體CD3+、CD4+、CD8+各3 μL混合，靜置15 min，加入紅細(xì)胞(RBC)裂解液300 μL，靜置10 min，流式細(xì)胞儀檢測各組小鼠T細(xì)胞亞群的變化。將小鼠肺組織按常規(guī)方法石蠟包埋，切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織切片的組織形態(tài)特征。

3 結(jié)果

3.1 桑白皮多糖對RSV肺炎小鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)的影響 正常組小鼠支氣管、肺組織結(jié)構(gòu)完整，未見明顯的炎性細(xì)胞浸潤，肺泡壁無增厚，管腔無分泌物。模型組小鼠可見肺泡壁上皮細(xì)胞受損，肺間質(zhì)可見大量淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞浸潤。高劑量組、中劑量組小鼠肺泡壁輕度增厚，肺間質(zhì)見少量淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞浸潤，低劑量組小鼠肺泡壁中度增厚，肺間質(zhì)見中量淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞浸潤詳見圖1。

3.2 桑白皮多糖對RSV肺炎小鼠外周血T細(xì)胞亞群的影響 模型組與正常組比較，模型組CD3+T細(xì)胞百分率、 CD4+T細(xì)胞百分率、CD8+T細(xì)胞百分率、CD4+T/CD8+T差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。高劑量組、中劑量組、低劑量組與模型組比較，高劑量組CD3+T細(xì)胞百分率、CD4+T/CD8+T差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；中劑量組CD3+T細(xì)胞百分率、 CD4+T細(xì)胞百分率、CD4+T/CD8+T差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05) ；低劑量組只有CD4+T/CD8+T差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見表1，圖2。

圖1 桑白皮多糖對各組RSV肺炎小鼠肺組織影響的病理圖

圖2 各組小鼠全血的T細(xì)胞亞群流式圖

組別CD3+/%CD4+/%CD8+/%CD4+/CD8+正常組49.80±5.08a21.60±4.06a8.24±1.83a2.65±0.26a模型組43.45±7.07b26.81±4.76b6.56±1.12b4.10±0.40b高劑量組50.35±8.97a24.74±5.567.34±2.113.52±0.79ab中劑量組55.05±5.94a20.39±5.56a7.15±1.732.88±0.56a低劑量組47.92±5.9423.52±6.096.79±1.853.49±0.45ab方差分析 F值3.932.281.3712.14 P值0.010.080.260.00

注：與模型組比較aP<0.05;與正常組比較bP<0.05。

4 討論

RSV主要是通過飛沫傳播，從口鼻而入，常導(dǎo)致毛細(xì)支氣管炎和支氣管肺炎。有研究顯示，小兒到了2歲，大多數(shù)都將會(huì)有RSV感染[7]，嬰兒期病毒感染率最高，在我國好發(fā)于冬、春季節(jié)[8-9]。中醫(yī)將小兒RSV肺炎歸屬于“肺炎喘嗽”的范疇。小兒肺常不足，臟腑嬌嫩，形氣未充，腠理稀疏，衛(wèi)外功能較弱，機(jī)體易被六淫邪氣所傷，產(chǎn)生各種肺系疾??；又因小兒“陽常有余”，不論外感、內(nèi)傷之邪，皆易從熱化，從火化。結(jié)合臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)和基礎(chǔ)研究，針對小兒肺炎的病因病機(jī)提出了“從肺毒熱論治小兒肺炎”[10]。故在小兒肺炎的治療上應(yīng)清泄肺中郁熱，《本經(jīng)逢原》中云：“桑根白皮，瀉肺氣之有余，止嗽而能利水，肺中有水氣，及肺火有余者宜之”。現(xiàn)代文獻(xiàn)分析發(fā)現(xiàn)，桑白皮在小兒肺炎風(fēng)熱閉肺證階段和痰熱閉肺證階段辨證用藥中單味藥使用頻次均較高[11]，尤其在小兒肺炎中期的痰熱閉肺證階段。有文獻(xiàn)報(bào)告[12]，桑白皮多糖可通過促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖而產(chǎn)生免疫調(diào)控作用。因此本實(shí)驗(yàn)研究了桑白皮多糖對RSV肺炎小鼠肺組織形態(tài)和T細(xì)胞亞群的影響，進(jìn)一步闡釋桑白皮多糖免疫調(diào)節(jié)作用。

本研究中采用RSV(long株)經(jīng)鼻腔接種BALB/c小鼠，建立小鼠RSV肺炎模型。模型組與正常組比較，模型組小鼠肺組織可見肺泡壁上皮細(xì)胞受損，肺泡壁重度增厚，肺間質(zhì)可見淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞等大量炎性細(xì)胞浸潤；小鼠外周血中CD3+T細(xì)胞百分率、 CD4+T細(xì)胞百分率、CD8+T細(xì)胞百分率及CD4+T/CD8+T比值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示RSV感染小鼠存在免疫平衡紊亂。T淋巴細(xì)胞按細(xì)胞表面抗原分為CD4+細(xì)胞和CD8+細(xì)胞等，CD4+分子多表達(dá)在T輔助細(xì)胞(Th) ，協(xié)助B細(xì)胞進(jìn)行分化和產(chǎn)生抗體；CD8+即T抑制細(xì)胞(Ts) ，則具有殺傷和抑制作用。CD4+/CD8+比值的相對平衡對維持機(jī)體免疫穩(wěn)定調(diào)控免疫應(yīng)答起著重要作用，是反映人體免疫系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要標(biāo)志之一[13]。

本實(shí)驗(yàn)中，桑白皮多糖高、中、低劑量組與模型組比較，高、中劑量組小鼠肺組織可見肺泡壁輕中度增厚，肺間質(zhì)可見淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞等小量炎性細(xì)胞浸潤，低劑量組小鼠肺組織可見肺泡壁中重度增厚，肺間質(zhì)可見淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞等中小量炎性細(xì)胞浸潤；高、中、低劑量的桑白皮多糖均可顯著下調(diào) RSV感染小鼠CD4+/CD8+比值，使其CD4+/CD8+比值趨于正常組小鼠的平衡狀態(tài)，但高、中劑量的桑白皮多糖可顯著上調(diào) RSV感染小鼠CD3+T細(xì)胞百分率，中劑量的桑白皮多糖可顯著下調(diào) RSV感染小鼠CD4+T細(xì)胞百分率，這些結(jié)果表明：桑白皮多糖能夠減輕RSV感染導(dǎo)致的機(jī)體肺組織炎癥及調(diào)節(jié)T細(xì)胞亞群的平衡狀態(tài)，且高、中劑量桑白皮多糖的治療效果優(yōu)于低劑量的桑白皮多糖。桑白皮多糖可能在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮雙重效應(yīng)，一方面激活免疫系統(tǒng)增加清除病毒的能力，同時(shí)也調(diào)節(jié)免疫失衡狀態(tài)來減輕肺組織的炎性損傷，使受病毒感染機(jī)體的快速康復(fù)，正氣得復(fù)。今后將進(jìn)一步從桑白皮多糖在免疫調(diào)節(jié)及在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面做深入研究，闡明其抗RSV的機(jī)制，為桑白皮的合理開發(fā)和利用提供更多的理論依據(jù)。

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Effects ofMorusalbaL.polysaccharide on lung tissue and T lymphocyte subtype in mice infected by respiratory syncytial virus

DONG Degang1,LIU Xiaoxue2,ZHANG Xiuying2,et al

(1.DalianMedicalUniversity,Dalian,Liaoning116027,China；2.LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shenyang,Liaoning110847,China)

Objective To investigate the effects ofMorusalbaL.polysaccharide on lung tissue and T lymphocyte subtype in BALB/c mice infected by respiratory syncytial virus.Methods Fifty young BALB/c mice were randomized into normal group,model group,high dosage group,middle dosage group and low dosage group.Except for the normal group,RSV was intranasally inoculated to mice.Aqueous solution of high,medium and low doses ofMorusalbaL.polysaccharide (182,91,45.5 mg·kg-1·d-1) were applied for the high,middle,low dosage group by gavage,and 0.9% sodium chloride solution for the normal group and model group by gavage,for a total of seven days.And then,pathological change and T lymphocyte subtype were detected.Results Morus alba L.polysaccharide could reduce the infiltration of inflammatory cells in the alveolar wall.Compared with the model group,the percentage of CD3+T(50.35±8.97)% ,CD4+T/CD8+T(3.52±0.79)in high dosage group were significantly different (P<0.05),the percentage of CD3+T(55.05±5.94)%,CD4+T(20.39±5.56)%,CD4+T/CD8+T(2.88±0.56) in middle dosage group were significantly different (P<0.05),and CD4+T/CD8+T(3.49±0.45)in low dosage group were significantly different (P<0.05).Conclusion Morus alba L.polysaccharide can improve the pathological change of lung tissue and promote cell immune adjustment in the infected mice．

MorusalbaL.polysaccharide;Pneumonia;RSV;Mice;T cell subtype

遼寧省科技廳攻關(guān)課題(2013225002)

董德剛，男，主任醫(yī)師，研究方向：中醫(yī)藥防治病毒性疾病,E-mail：731939056@qq.com

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.10.007

2016-04-05，

2016-06-14)