芶 琳,鐘昱陽,陽 藝,王西瑤*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,四川成都611130)

老鷹茶乙醇提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用

芶 琳1,鐘昱陽2,陽 藝2,王西瑤2*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,四川成都611130)

為探討老鷹茶乙醇提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用,以老鷹茶為材料,經(jīng)乙醇浸提得乙醇提取物,并通過高效液相色譜法對(duì)乙醇提取物主要成分進(jìn)行分析,進(jìn)而測定其對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的影響.結(jié)果表明,老鷹茶乙醇提取物主要活性成分為黃酮類物質(zhì),該提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性有較強(qiáng)的抑制作用,其半抑制質(zhì)量濃度(IC50)為0.12 mg/m L.進(jìn)一步的酶動(dòng)力學(xué)研究表明其抑制機(jī)理為可逆混合型抑制,對(duì)游離酶的抑制常數(shù)(KI)為0.058 mg/m L,而對(duì)酶-底物絡(luò)合物的抑制常數(shù)(KIS)為0.178 mg/m L.由此可知,老鷹茶乙醇提取物能有效抑制α-葡萄糖苷酶的活性.該結(jié)果揭示老鷹茶有望成為抑制α-葡萄糖苷酶活性的保健或醫(yī)療產(chǎn)品原料,具有值得深入研究和開發(fā)應(yīng)用的潛在價(jià)值.

老鷹茶;α-葡萄糖苷酶;抑制作用;乙醇提取物

α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)對(duì)糖的分解代謝具有重要作用,是能從低聚糖的非還原末端催化α-1,4糖苷鍵水解釋放出葡萄糖的一類酶,主要有麥芽糖酶、蔗糖酶、異構(gòu)麥芽糖酶、乳糖酶等[1].已有的研究結(jié)果顯示,糖尿病、肥胖癥和高血脂等很多代謝性疾病都與α-葡萄糖苷酶有關(guān)[2].對(duì)于糖尿病患者而言,抑制α-葡萄糖苷酶的活性可有效地降低餐后血糖的水平,有利于控制糖尿病的發(fā)展及預(yù)防并發(fā)癥的發(fā)生.因此,尋找有效的α-葡萄糖苷酶抑制劑便成為了糖尿病治療藥物研發(fā)的一個(gè)重要途徑.植物中存在著多種生物活性成分,大都具有重要的生物學(xué)功能.李春英等[3]在研究中發(fā)現(xiàn)辣椒葉的乙醇提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶具有抑制作用.

老鷹茶通常是指由植物毛豹皮樟(Litsea coreana var.lanuginosa)的葉加工制成的茶品,毛豹皮樟為樟科木姜子屬植物[4],在我國的四川、貴州和云南等地分布較廣,民間常將毛豹皮樟的葉經(jīng)干燥處理后作為茶飲,具有生津止渴、清熱解毒的功效.有研究表明老鷹茶中含有多糖[5]、多酚[6]和黃酮[7]等多種生物活性成分.Jia等[8]還報(bào)道了從老鷹茶中分離得到的多糖具有抗氧化作用.

本課題組在α-葡萄糖苷酶抑制劑篩選的研究中發(fā)現(xiàn)老鷹茶乙醇提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的活性具有抑制作用,但相關(guān)的酶學(xué)研究鮮見報(bào)道.本研究中試圖從酶學(xué)角度了解老鷹茶乙醇提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的影響,探討其對(duì)酶作用的機(jī)理,以期為老鷹茶作為相關(guān)天然藥物的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1材 料

老鷹茶來自于四川省雅安市老鷹茶開發(fā)繁殖場,由當(dāng)年生長的毛豹皮樟嫩葉制成.

主要試劑:α-葡萄糖苷酶(G0660-750UN)、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG,N1377-1G)購自美國Sigma-Aldrich公司,四氫呋喃(色譜純)購自德國Merck公司,甲醇(色譜純)購自美國Fisher公司,蘆丁對(duì)照品購自中國生物制品檢定研究院,磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉等試劑為國產(chǎn)分析純.

主要儀器:高速萬能粉碎機(jī)(FW80型)購自北京市永光明醫(yī)療儀器廠,三孔電熱恒溫水槽(DK-8D型)購自上海齊欣科學(xué)儀器有限公司,電子分析天平(BS210S型)購自Sartorins公司,紫外可見分光光度計(jì)(UV-1240型)購自日本島津公司,高效液相色譜(HPLC)儀(Agilent1260型)購自安捷倫科技有限公司.

1.2方 法

1.2.1老鷹茶乙醇提取物的制備

老鷹茶原材料經(jīng)60℃烘干,粉碎,過篩備用.稱取1.0 g老鷹茶干粉,置于100 m L三角瓶中,加入60% (體積分?jǐn)?shù),下同)乙醇30 m L,60℃恒溫浸提2 h, 8 000 r/min離心10 min,收集上清液.余下的殘?jiān)砑?0 m L 60%乙醇,60℃恒溫浸提1 h,8 000 r/min離心10 min,收集上清液.合并2次上清液并定容至100 m L,即得老鷹茶乙醇提取液,質(zhì)量濃度為10 mg/m L.

1.2.2主要成分的HPLC分析

參照文獻(xiàn)[9]對(duì)老鷹茶乙醇提取物進(jìn)行檢測分析,以蘆丁作為標(biāo)示物質(zhì).色譜條件:色譜柱Lichrospher C8,250 mm×4.0 mm×5μm;柱溫30℃;檢測波長280 nm;流速1.0 m L/min;進(jìn)樣量20 μL.流動(dòng)相A(體積比為1∶19的四氫呋喃/磷酸二氫鈉溶液(15.6 g/L,p H 3.0)),流動(dòng)相B(體積比為2∶3的四氫呋喃/磷酸二氫鈉溶液(15.6 g/L,p H 3.0)),梯度洗脫.

供試品溶液:取老鷹茶乙醇提取液1 m L,置于10 m L容量瓶中,用流動(dòng)相B稀釋至刻度,搖勻,即得.

蘆丁對(duì)照品溶液:取10.05 mg蘆丁對(duì)照品用2.0 m L甲醇溶解,再用流動(dòng)相B定容至10 m L,從中精密量取1.0 m L,置于50 m L容量瓶中,用流動(dòng)相B稀釋至刻度,搖勻,即得.

1.2.3對(duì)α-葡萄糖苷酶活性影響的測定

[10]的方法,測活體系總體積為800 μL,含100 mmol/L p H 6.8磷酸鹽緩沖液,2 mmol/L PNPG(作為底物),加入15μL 125μg/m Lα-葡萄糖苷酶溶液,立即混勻,于37℃恒溫條件下,測定400 nm處吸光度隨時(shí)間的變化值,由直線的斜率求酶活性,即用每分鐘吸光度的變化值(ΔOD)表示其酶活性大小.

分析老鷹茶乙醇提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的影響,以PNPG為底物,加入不同濃度的老鷹茶乙醇提取物,其他條件與上述α-葡萄糖苷酶活性測定相同,測定不同濃度老鷹茶乙醇提取物處理下α-葡萄糖苷酶的活性.老鷹茶乙醇提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的相對(duì)剩余活性按下式計(jì)算:

式中A0為不含提取物時(shí)的酶活性(ΔOD0),AI為含提取物時(shí)的酶活性(ΔODI).

1.2.4對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制動(dòng)力學(xué)分析

在上述測活體系中,改變酶濃度,保持PNPG濃度不變,測定不同濃度老鷹茶乙醇提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的影響.以酶促反應(yīng)速度對(duì)酶濃度作圖,判斷老鷹茶乙醇提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用機(jī)理.

進(jìn)而在測活體系中,通過固定α-葡萄糖苷酶的濃度,改變PNPG濃度,測定不同濃度老鷹茶乙醇提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的影響.經(jīng)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖,確定老鷹茶乙醇提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制類型.并以斜率和截距對(duì)老鷹茶乙醇提取物濃度二次作圖,求抑制常數(shù).

2 結(jié)果與分析

2.1老鷹茶乙醇提取物的主要成分分析

利用HPLC對(duì)老鷹茶乙醇提取物進(jìn)行主要成分定性分析,以蘆丁作為標(biāo)示物質(zhì),得蘆丁對(duì)照品的譜圖(圖1(a))和老鷹茶醇提取物的譜圖(圖1(b)).由圖1(b)可知,老鷹茶醇提取物經(jīng)色譜分析獲得18個(gè)峰,箭頭所示峰與圖1(a)中蘆丁對(duì)照品色譜圖中蘆丁極為相似,可初步定性為黃酮類物質(zhì)蘆丁,且測得該峰面積約占49.66%.由此可知,老鷹茶醇提物以黃酮類物質(zhì)為主.

2.2老鷹茶乙醇提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

研究老鷹茶乙醇提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的影響,在不同濃度老鷹茶醇提取物處理下測定α-葡萄糖苷酶的活性,以不加老鷹茶醇提取物為對(duì)照,獲得各濃度下α-葡萄糖苷酶的相對(duì)剩余活性.結(jié)果如圖2所示:老鷹茶乙醇提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的活性具有較明顯的抑制作用,隨提取物濃度增大,酶的相對(duì)剩余活性下降;提取物質(zhì)量濃度在0.03～0.25 mg/m L范圍內(nèi),酶的相對(duì)剩余活性下降較明顯,導(dǎo)致酶的相對(duì)剩余活性下降至50%的提取物濃度,即半抑制質(zhì)量濃度(IC50)為0.12 mg/m L.

2.3老鷹茶乙醇提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制動(dòng)力學(xué)

在測活體系中,以2 mmol/L PNPG為底物,改變?chǔ)?葡萄糖苷酶的用量,測定不同濃度老鷹茶醇提取物處理下α-葡萄糖苷酶的活性.以酶活性對(duì)酶量作圖,得一組經(jīng)過原點(diǎn)的直線(圖3).由圖可知,隨著老鷹茶乙醇提取物濃度增加,直線斜率下降,表明老鷹茶乙醇提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用為可逆抑制[11],即酶活性的下降,是由老鷹茶乙醇提取物的濃度增加所致,而不是因酶量的減少造成.

圖1　蘆丁(a)及老鷹茶醇提取物(b)的HPLC譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of rutin(a)and ethanol extract from Hawk tea(b)

圖2　老鷹茶乙醇提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用Fig.2 The inhibition on the activity ofα-glucosidase by ethanol extract from Hawk tea

老鷹茶乙醇提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制類型判定,則在測活體系中通過固定酶濃度而改變PNPG的濃度,測得不同濃度老鷹茶乙醇提取物處理下α-葡萄糖苷酶的活性.經(jīng)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖,得一組相交于第二象限的直線,隨著老鷹茶乙醇提取物濃度的改變,圖中直線的斜率和截距都發(fā)生變化(圖4 (a)).米氏常數(shù)(Km,游離酶的Km值為4.84 mmol/L)隨老鷹茶乙醇提取物濃度的增大而增大,最大反應(yīng)速度(Vm)則隨著提取物濃度的增大而下降,結(jié)果表明老鷹茶乙醇提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制類型為混合型抑制[12].再以雙倒數(shù)圖直線的斜率和縱軸截距分別對(duì)老鷹茶乙醇提取物濃度二次作圖(圖4(b)和(c)),即可求得抑制劑對(duì)游離酶的抑制常數(shù)(KI)為0.058 mg/m L,對(duì)酶-底物絡(luò)合物的抑制常數(shù)(KIS)為0.178 mg/m L.

圖3　老鷹茶乙醇提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制機(jī)理Fig.3 The inhibition mechanism of ethanol extract from Hawk tea on the activity ofα-glucosidase

3 討 論

α-葡萄糖苷酶抑制劑在許多疾病的治療中得到應(yīng)用,尤其是在糖尿病的預(yù)防和治療中,現(xiàn)階段治療糖尿病的常用藥物阿卡波糖[13]便是典型的α-葡萄糖苷酶抑制劑.目前,盡管阿卡波糖在糖尿病的治療中得到了廣泛使用,但存在一定的副作用,并不是理想的糖尿病治療藥物.人們更希望能找到特異、高效和安全的α-葡萄糖苷酶抑制劑,用于開發(fā)出治療糖尿病以及其他相關(guān)疾病的有效藥物.一些天然植物便具有這樣的潛在特質(zhì).近年來,國內(nèi)外學(xué)者對(duì)天然植物提取物生物學(xué)功能的研究越來越重視.因此從天然植物提取物中尋找有效的α-葡萄糖苷酶抑制劑具有重要意義.

已有研究表明某些植物中存在的生物活性物質(zhì)對(duì)α-葡萄糖苷酶具有抑制作用[14].Kim等[15]從鴨跖草(Commelina communis)中提取的幾種生物活性成分對(duì)α-葡萄糖苷酶均具有抑制作用.Yoshikawa等[16]從巴西一種傳統(tǒng)藥物Salacia reticulata葉中提取到的黃酮類物質(zhì)對(duì)α-葡萄糖苷酶也有抑制作用.除此之外,竺琴等[17]還發(fā)現(xiàn)西藏綠蘿花(Scindapsas aureus)提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶具有抑制效果.本實(shí)驗(yàn)室在篩選α-葡萄糖苷酶抑制劑過程中,發(fā)現(xiàn)老鷹茶乙醇提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶有較強(qiáng)的抑制作用.本研究結(jié)果表明,老鷹茶乙醇提取物主要含黃酮類生物活性成分,且該老鷹茶乙醇提取物能有效地抑制α-葡萄糖苷酶的活性,IC50為0.012 mg/m L,說明老鷹茶中含有對(duì)α-葡萄糖苷酶活性起到抑制作用的天然生物活性物質(zhì).進(jìn)一步的動(dòng)力學(xué)研究則表明,老鷹茶乙醇提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制機(jī)理為可逆混合型抑制,即老鷹茶乙醇提取物可與酶分子通過可逆結(jié)合來抑制α-葡萄糖苷酶的活性.

綜上所述,本研究從理論上闡述了老鷹茶乙醇提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用,并通過實(shí)驗(yàn)獲知該提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制表現(xiàn)為可逆混合型抑制,拓展了老鷹茶的生物活性功效,為老鷹茶作為天然α-葡萄糖苷酶抑制劑的開發(fā)應(yīng)用提供了理論依據(jù).

圖4　老鷹茶乙醇提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制類型判斷和抑制常數(shù)測定Fig.4 Determination of the inhibition type and inhibition constants of ethanol extract from Hawk tea on the activity ofα-glucosidase

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Inhibitory Effect of Ethanol Extract from Hawk Tea onα-Glucosidase

GOU Lin1,ZHONG Yuyang2,YANG Yi2,WANG Xiyao2*

(1.College of Biology and Science,Sichuan Agriculture University, 2.College of Agronomy,Sichuan Agriculture University,Chengdu 611130,China)

In this study,we explored the inhibitory effect of ethanol extract from Hawk tea onα-glucosidase.We used Hawk tea as the raw material and obtained ethanol extract through ethanol extraction,and then analyzed the main ingredient of the ethanol extract using high performance liquid chromatography.Data showed that the main active substance of ethanol extract from Hawk tea was flavonoid constituent,which showed a strong inhibitory effect on the activity ofα-glucosidase.The half maximal inhibitory concentration (IC50)was 0.12 mg/m L.Furthermore,enzyme kinetics analysis demonstrated a reversible mixed inhibition mechanism,where the inhibition constant for resolvase(KI)was 0.058 mg/m L,while the inhibition constant for enzyme-substrate complexes(KIS)was 0.178 mg/m L.In summary,the ethanol extract from Hawk tea contained bioactive compounds againstα-glucosidase,which could effectively inhibit the activity ofα-glucosidase.This result reveals that Hawk tea is a potential raw material for the development of α-glucosidase-inhibition relevant health care and medical products.

Hawk tea;α-glucosidase;inhibition;ethanol extract

Q 356.1

A

0438-0479(2016)06-0842-05

10.6043/j.issn.0438-0479.201510025

2015-10-31 錄用日期:2016-02-23

國家自然科學(xué)基金(31071433)

wxyrtl@163.com

芶琳,鐘昱陽,陽藝,等.老鷹茶乙醇提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用[J].廈門大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2016,55 (6):842-846.

GOU L,ZHONG Y Y,YANG Y,et al.Inhibitory effect of ethanol extract from Hawk tea onα-glucosidase[J].Journal of Xiamen University(Natural Science),2016,55(6):842-846.(in Chinese)