林輝煌,劉春鳳,尹鳳紅,丁玉梅,陳清西*

(1.廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,福建廈門361102;2.廈門特寶生物工程股份有限公司,福建廈門361028)

重組人白細(xì)胞介素-13在大腸桿菌中的表達(dá)純化及鑒定

林輝煌1,2,劉春鳳2,尹鳳紅2,丁玉梅1,陳清西1*

(1.廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,福建廈門361102;2.廈門特寶生物工程股份有限公司,福建廈門361028)

采用大腸桿菌(Escherichia coli)作為宿主,通過(guò)300 L發(fā)酵罐進(jìn)行中試發(fā)酵表達(dá)重組人白細(xì)胞介素-13(rhIL-13)融合蛋白;經(jīng)異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo),離心發(fā)酵液收集菌體,菌體經(jīng)溶解、變性、稀釋復(fù)性及親和層析捕獲,獲得融合蛋白;融合蛋白經(jīng)腸激酶酶切后,再經(jīng)親和層析分離和分子篩精細(xì)純化等步驟,獲得高純度rhIL-13原液.每升發(fā)酵液可獲得高純度的rhIL-13原液約30 mg.通過(guò)本純化工藝獲得的rhIL-13原液經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)法檢測(cè),純度大于98.75%;經(jīng)高效液相色譜分子排阻(HPLC-SEC)法檢測(cè),純度為100%;質(zhì)譜(MS)法測(cè)定rhIL-13分子質(zhì)量為12 348 u,與理論值基本一致;采用噻唑藍(lán)(MTT)法進(jìn)行比活性檢測(cè),比活大于8.0×106IU/mg;采用HPLC-SEC法和MS法對(duì)rhIL-13二硫鍵數(shù)目和位置進(jìn)行分析,結(jié)果顯示二硫鍵數(shù)目和位置與理論一致.此操作方法可獲得高純度、高活性的rhIL-13原液,并且操作簡(jiǎn)單,易于放大,可實(shí)現(xiàn)工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn).

重組人白細(xì)胞介素-13(rhIL-13);表達(dá);純化;鑒定

白細(xì)胞介素-13(IL-13)是一種多功能細(xì)胞因子,主要由T細(xì)胞、嗜堿粒細(xì)胞、漿細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞等,尤其是Ⅱ型輔助性T細(xì)胞(Th2)在活化狀態(tài)下分泌產(chǎn)生[1].IL-13的主要功能包括:誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化,增強(qiáng)主要組織相容性復(fù)合體(MHC)Ⅱ類分子的表達(dá)[2];抑制脂多糖誘導(dǎo)的單核因子分泌,控制炎癥反應(yīng)[3];誘導(dǎo)B細(xì)胞增殖及合成IgE類抗體,增強(qiáng)B細(xì)胞表面MHCⅡ類分子、CD23及CD72的表達(dá)[4];協(xié)同IL-2刺激自然殺傷細(xì)胞產(chǎn)生干擾素,從而促進(jìn)單核-巨噬細(xì)胞活化和Th1的免疫反應(yīng)[3].此外,IL-13還能抑制Ⅰ型人類免疫缺陷病素(HIV-1)在巨噬細(xì)胞內(nèi)復(fù)制,誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞中IL-1RA基因表達(dá)和蛋白質(zhì)合成[5].重組人IL-13(rhIL-13)為1條非糖基化的單鏈多肽,含112個(gè)氨基酸殘基,2對(duì)二硫鍵,分子質(zhì)量約為12.3 ku[6].

目前rhIL-13基本上采用基因工程方法獲得,通過(guò)對(duì)其cDNA加入特定標(biāo)簽和引物后進(jìn)行PCR擴(kuò)增,插入到質(zhì)粒中經(jīng)DNA重組后篩選陽(yáng)性克隆,轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行發(fā)酵表達(dá)獲得融合蛋白,再通過(guò)對(duì)融合蛋白酶切和下游純化獲得rhIL-13蛋白[7-9].在操作過(guò)程中,工程菌的選擇、融合蛋白的復(fù)性和純化工藝等對(duì)rhIL-13產(chǎn)率和生物學(xué)活性影響較大[7].本研究中采用基因工程技術(shù)獲得高效表達(dá)rhIL-13融合蛋白的表達(dá)菌株,進(jìn)行300 L發(fā)酵制備融合蛋白,經(jīng)變性、復(fù)性以及親和層析、分子篩層析等分離純化后獲得高純度、高活性的rhIL-13原液.

1 主要材料

大腸桿菌(Escherichia coli)BL21/p ColdⅡ-IL-13基因工程菌株由廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院酶學(xué)實(shí)驗(yàn)室和廈門特寶生物工程股份有限公司構(gòu)建并保存;酵母提取物和蛋白胨為Oxoid公司產(chǎn)品,丙烯酰胺為Promega公司產(chǎn)品;Chelating Sepharose Fast Flow (CS)、Superdex 75(S-75)填料為GE公司產(chǎn)品;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.

主要儀器:30和300 L全自動(dòng)發(fā)酵罐,B.Braun Biotech公司;全溫振蕩器,哈爾濱東明醫(yī)療器械廠;離心機(jī),Beckman公司;P2B005A01超濾膜,Millipore公司;Basic 100蛋白純化儀,GE公司;LC1200高效液相色譜(HPLC)儀,Agilent公司;AutoflexⅢTOF/ TOF串聯(lián)質(zhì)譜儀,Bruker公司;DU800紫外-可見光分光光度計(jì),Beckman公司.

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1rhIL-13融合蛋白的發(fā)酵表達(dá)

取rhIL-13工程菌株BL21/pColdⅡ-IL-13,按體積比1∶400接種至100 m L LB培養(yǎng)基,1 L三角瓶, p H 6.0、37℃、200～250 r/min培養(yǎng)至菌液在600 nm處吸光度(OD600)約為1,作為一級(jí)種;一級(jí)種按體積比1∶200接種至20 L LB培養(yǎng)基,30 L發(fā)酵罐,p H 6.0、37℃、200～250 r/min培養(yǎng)至OD600約為10,為二級(jí)種.二級(jí)種按體積比1∶6接種至120 L LB培養(yǎng)基, 300 L發(fā)酵罐,p H 7.0、37℃、溶氧(DO)70%(飽和度)培養(yǎng)至菌液OD600約為5.0;將發(fā)酵溫度降至15℃,用含40 mmol/L異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的氮源補(bǔ)料液1.5 L,1 h內(nèi)流加誘導(dǎo),過(guò)程中補(bǔ)加碳源或2 mol/L NaOH以維持p H 7.0,誘導(dǎo)總時(shí)長(zhǎng)約24 h.發(fā)酵完畢后離心收集菌體.

2.2融合蛋白變性與捕獲

取發(fā)酵獲得的菌體50 g,按1 g菌體對(duì)應(yīng)10 m L溶液的比例重懸于500 m L 100 mmol/L Tris-HCl、6 mol/L鹽酸胍、30 mmol/Lβ-巰基乙醇(β-ME)、p H 8.0的緩沖液中,冰水浴維持30 min;用高速冷凍離心機(jī)10℃、10 000 r/min離心20 min得上清.

CS層析柱用50 mmol/L Tris-HCl、6 mol/L鹽酸胍、3 mmol/Lβ-ME、p H 8.0的緩沖液平衡4個(gè)柱床體積,再將離心上清液上樣;然后用50 mmol/L Tris-HCl、6 mol/L鹽酸胍、3 mmol/Lβ-ME、20 mmol/L咪唑、p H 8.0的緩沖液和50 mmol/L Tris-HCl、6 mol/L鹽酸胍、3 mmol/Lβ-ME、300 mmol/L咪唑、p H 8.0的緩沖液進(jìn)行分步洗脫,收集目的樣.

2.3融合蛋白復(fù)性

捕獲的變性蛋白洗脫液按體積比1∶19加入到100 mmol/L Tris-HCl、0.8 mol/L鹽酸胍、0.5 mmol/L氧化型谷胱甘肽(GSSG)、0.5 mmol/L還原型谷胱甘肽(GSH)、p H 8.0的緩沖液中.10℃左右緩慢攪拌復(fù)性48 h后,超濾至小體積,再用p H 8.0的磷酸鹽緩沖液(PBS)超濾置換以去除鹽酸胍、GSH和GSSG,最后收集目的樣.

2.4融合蛋白酶切與純化

將腸激酶(EK)以摩爾比1∶120加入到超濾脫鹽后的樣品中,混勻后10℃酶切約14 h.

CS層析柱用30 mmol/L Tris-HCl、30 mmol/L NaCl、p H 8.0的緩沖液平衡5個(gè)柱床體積,酶切后樣品上樣,依次用30 mmol/L Tris-HCl、30 mmol/L NaCl、50 mmol/L咪唑、p H 8.0的緩沖液,30 mmol/L Tris-HCl、30 mmol/L NaCl、100 mmol/L咪唑、p H 8.0的緩沖液和30 mmol/L Tris-HCl、30 mmol/L NaCl、300 mmol/L咪唑、p H 8.0的緩沖液進(jìn)行洗脫,并收集各洗脫峰樣品.

2.5S-75層析柱精純

S-75層析柱用p H 7.4的PBS平衡3個(gè)柱床體積,取上一步中由30 mmol/L Tris-HCl、30 mmol/L NaCl、50 mmol/L咪唑、p H 8.0的緩沖液洗脫所得目的樣上樣,再用p H 7.4的PBS洗脫收集目標(biāo)蛋白. 0.22μm濾膜過(guò)濾除菌,分裝即為rhIL-13原液,-65℃以下凍存.

2.6rhIL-13的純度檢測(cè)

高效液相色譜分子排阻(HPLC-SEC)純度檢測(cè):色譜柱為TSK GEL 2000 SWxl排阻柱,規(guī)格為直徑7.8 mm,柱高300 mm,粒徑5μm,孔徑12.5 nm,球蛋白分子質(zhì)量分離范圍5～150 ku;樣品稀釋到0.2 mg/m L,取50μL上樣,以0.1 mol/L PBS(p H 7.0)-0.1 mol/L NaCl溶液為流動(dòng)相,流速0.7 m L/min,柱溫為室溫,檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm.按面積歸一化法[10]計(jì)算目標(biāo)峰面積占總峰面積的百分?jǐn)?shù),得出rhIL-13的HPLC-SEC純度.

十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)純度檢測(cè):取純化后的蛋白溶液,按質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.25%(250 ng)、2.5%(500 ng)、5%(1μg)、100% (20μg)的上樣量進(jìn)行SDS-PAGE分析.分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)16%,電壓80～100 V,考馬斯亮藍(lán)G250染色.還原型方法步驟同上述非還原型方法,但使用2×還原型上樣緩沖液(取1 mol/L二硫蘇糖醇(DTT)與2.5 ×非還原型上樣緩沖液按體積比1∶4混合).

2.7rhIL-13的理化性質(zhì)分析

采用Bruker公司REFLEXTMⅢ型基質(zhì)輔助激光解吸電離/飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)儀,測(cè)定rhIL-13分子質(zhì)量;基質(zhì)為α-氰基-4-羥基肉桂酸,蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品采用Bruker公司的Protein Calibration StandardⅡ,分析軟件為flex Analysis ver.3.0.54.0.

利用人紅白血病細(xì)胞系(TF-1)對(duì)rhIL-13具有依賴生長(zhǎng)的特性,采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法對(duì)rhIL-13進(jìn)行比活性測(cè)定.標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自R&D公司,比活為7.8×105IU/mg.

采用LC1200 HPLC儀和AutoflexⅢTOF/ TOF串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行二硫鍵分析.先用胰蛋白酶酶切后HPLC收集二硫鍵連接的肽段,再用α-糜蛋白酶酶切分析二硫鍵連接方式.

3 表達(dá)純化結(jié)果分析

3.1rhIL-13融合蛋白的發(fā)酵表達(dá)

對(duì)發(fā)酵過(guò)程中不同誘導(dǎo)時(shí)間的發(fā)酵液進(jìn)行取樣,取相同OD600的菌體,高溫破碎,SDS-PAGE檢測(cè),結(jié)果見圖1:rhIL-13融合蛋白表觀分子質(zhì)量約為17 ku (圖1中箭頭所示),隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng),發(fā)酵的目的產(chǎn)物逐漸增加,獲得更多的生物量積累.300 L發(fā)酵罐最終獲得發(fā)酵液約120 L,離心獲得約2 kg菌體.

圖1　rhIL-13融合蛋白發(fā)酵表達(dá)過(guò)程菌體裂解液的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of lysates of rhIL-13 expressing strain during fermentation

3.2rhIL-13融合蛋白變性與捕獲

菌體經(jīng)裂解和融合蛋白包涵體溶解后,蛋白處于變性狀態(tài).發(fā)酵表達(dá)的融合蛋白N末端帶有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽,可特異性與CS層析填料結(jié)合.純化洗脫圖譜見圖2(a),圖中I號(hào)峰為未掛柱的雜蛋白,Ⅱ號(hào)峰為上樣后預(yù)沖洗下來(lái)的雜質(zhì),Ⅲ號(hào)峰為目標(biāo)蛋白,共250 m L,檢測(cè)蛋白質(zhì)量濃度為1.88 mg/m L.Ⅲ號(hào)峰對(duì)應(yīng)收集樣品的電泳結(jié)果見圖3中泳道1.

圖3　SDS-PAGE法分析純化過(guò)程的rhIL-13樣品Fig.3 SDS-PAGE analysis of the samples of rhIL-13 during purification process

圖2　rhIL-13的捕獲與分離純化的層析譜圖Fig.2 Chromatogram of rhIL-13 during capture and purification process

3.3變性蛋白復(fù)性與超濾

Ⅲ號(hào)峰經(jīng)稀釋后復(fù)性48 h,超濾去除鹽酸胍、GSH和GSSG等,同時(shí)進(jìn)行緩沖液替換,最后超濾收樣200 m L,檢測(cè)蛋白質(zhì)量濃度為1.1 mg/m L,樣品電泳結(jié)果見圖3中泳道2.

3.4融合蛋白的酶切與純化

按摩爾比120∶1向超濾后樣品中加入EK,10℃酶切14 h,酶切后樣品電泳見圖3中泳道3.

CS層析柱純化過(guò)程如圖2(b)所示,3種洗脫液洗脫所得樣品(Ⅳ,Ⅴ,Ⅵ)分別收集,Ⅳ號(hào)樣品(40 m L,檢測(cè)蛋白質(zhì)量濃度為3.1 mg/mL)用于下一步純化;3個(gè)樣品分別進(jìn)行電泳檢測(cè),結(jié)果見圖3中泳道4,5和6.

CS層析柱分離后的Ⅳ號(hào)樣用S-75層析柱純化和緩沖液置換,收集目的樣,見圖2(c),共收集2個(gè)峰(Ⅶ和Ⅷ).圖3中,泳道7對(duì)應(yīng)Ⅷ號(hào)峰樣品,泳道8和9均對(duì)應(yīng)Ⅶ號(hào)峰樣品,其中泳道9樣品中添加了DTT.樣品用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌,分裝即為rhIL-13原液,-65℃以下凍存.

3.5純化過(guò)程各樣品電泳與收率分析

從圖3中泳道1可以看出,經(jīng)變性捕獲后,菌體相關(guān)蛋白雜質(zhì)已基本去除,融合蛋白純度較高;從泳道2可以看出超濾操作對(duì)樣品電泳純度基本上沒有影響;從泳道3可以看出,融合蛋白酶切較完全;從泳道4,5和6可以看出,酶切后產(chǎn)物被有效分離,主要目的蛋白在Ⅳ號(hào)洗脫樣中,Ⅴ號(hào)和Ⅵ號(hào)洗脫樣品主要為雜質(zhì);從泳道7可以看出,樣品經(jīng)S-75柱純化后,純度較高,雜質(zhì)進(jìn)一步得到去除;從泳道8和9可以看出,雜質(zhì)主要是二聚體雜質(zhì).

純化過(guò)程各步蛋白收率見表1,由于菌體溶解后樣品中含大量菌體蛋白,定量不準(zhǔn),因此未獲得數(shù)據(jù).從表1可以看出,捕獲后到原液總收率為22.6%.

表1　純化中各步收率Tab.1 The recovery rate of each operation step during purification

4 原液檢測(cè)分析

4.1rhIL-13原液活性測(cè)定

采用TF-1/MTT比色的方法測(cè)定rhIL-13的比活性.rhIL-13能促進(jìn)TF-1細(xì)胞增殖,且TF-1細(xì)胞的增殖數(shù)量與培養(yǎng)體系中rhIL-13含量呈劑量依賴性;MTT在活細(xì)胞的線粒體中可以定量地被還原為藍(lán)色的甲臜,通過(guò)比色法測(cè)定甲臜的量可以直接表示TF-1細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài).標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自R&D,進(jìn)行3組平行實(shí)驗(yàn),3次測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)小于10%.平均比活為9.8×106IU/mg,遠(yuǎn)大于標(biāo)準(zhǔn)品(7.8×105IU/mg).

4.2SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果

用非還原型和還原型SDS-PAGE法檢測(cè)純度.分別上樣1.25%(250 ng),2.5%(500 ng),5%(1μg)和100%(20μg),電泳結(jié)果見圖4:1.25%的目的蛋白條帶亮于雜質(zhì)帶,表明rhIL-13的雜質(zhì)含量低于1.25%,即rhIL-13的電泳純度大于98.75%.

圖4　SDS-PAGE法測(cè)定rhIL-13純度Fig.4 Determination of purity of rhIL-13 by SDS-PAGE

4.3HPLC檢測(cè)結(jié)果

rhIL-13的HPLC-SEC檢測(cè)結(jié)果見圖5,從圖中可以得知,按面積歸一化法計(jì)算,檢測(cè)樣品中rhIL-13的峰面積占總面積的100%,即rhIL-13原液的HPLC-SEC純度為100%.

圖5　HPLC-SEC法測(cè)定rhIL-13純度Fig.5 Determination of purity of rhIL-13 by HPLC-SEC

4.4MS檢測(cè)分子質(zhì)量

MALDI-TOF MS測(cè)定rhIL-13的分子質(zhì)量,結(jié)果顯示rhIL-13的分子質(zhì)量為12 348 u(見圖6),與理論分子質(zhì)量(12 312 u)基本一致.

圖6　MALDI-TOF MS法測(cè)定rhIL-13分子質(zhì)量Fig.6 Determination of mass spectrum of rhIL-13 by MALDI-TOF MS

4.5rhIL-13的二硫鍵分析

rhIL-13分子中含4個(gè)半胱氨酸,理論上其第28位的半胱氨酸和第56位的半胱氨酸形成二硫鍵,第44位的半胱氨酸和第70位的半胱氨酸形成二硫鍵.

取2份樣品(其中1份加DTT處理)分別用胰蛋白酶酶切后,進(jìn)行肽圖比較分析,可得50.7 min樣品為含二硫鍵肽段.將這些肽段用α-糜蛋白酶酶切后肽圖得36.2,38.8和43.8 min 3個(gè)樣品;對(duì)MS譜圖中這3個(gè)峰進(jìn)行二次解析,在分子質(zhì)量1 522 u(36.2 min)和2 395 u(43.8 min)的二次圖譜中發(fā)現(xiàn)二硫鍵的特征譜圖;再分別取36.2和43.8 min的樣品進(jìn)行MS分析,同時(shí)與加DTT處理過(guò)的樣品進(jìn)行對(duì)比,除了分子質(zhì)量為506 u的肽段較小且得質(zhì)子能力較弱而未出現(xiàn)在譜圖中,其他3個(gè)肽段(分子質(zhì)量分別為1 019,1 077,1 320 u)均出現(xiàn)在譜圖中.rhIL-13原液二硫鍵的連接情況為C28-C56和C44-C70,與理論位置一致,如圖7.

圖7　rhIL-13的二硫鍵示意圖Fig.7 Diagram of disulfide bonds in rhIL-13

5 討 論

rhIL-13目前主要通過(guò)基因工程方法進(jìn)行制備,而表達(dá)載體和表達(dá)菌株各有不同,如:王文等[7]構(gòu)建了大腸桿菌表達(dá)菌株rhIL-13-p GEX-4 T-2/TG1進(jìn)行GST-IL-13融合蛋白表達(dá),但由于復(fù)性時(shí)大量目的蛋白的沉淀丟失及殘留鹽酸胍和原核多肽GST的影響,測(cè)得的生物活性并不高;江陽(yáng)等[8]構(gòu)建了畢赤酵母(Pichia pastoris)表達(dá)菌株p PICZαA-IL-13/GS115表達(dá)制備IL-13非融合蛋白,其生物學(xué)活性達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)品的要求.

本研究采用大腸桿菌BL21/p ColdⅡ-IL-13表達(dá)菌株進(jìn)行rhIL-13融合蛋白的表達(dá),在15℃低溫環(huán)境下進(jìn)行誘導(dǎo),而低溫環(huán)境下蛋白質(zhì)折疊速度影響較小,轉(zhuǎn)錄和翻譯速度被充分降低,為蛋白質(zhì)折疊、產(chǎn)生有活性的蛋白和避免非活性蛋白聚合體形成提供了充足的時(shí)間,有利于目的蛋白的產(chǎn)生.表達(dá)產(chǎn)物融合蛋白攜帶組氨酸標(biāo)簽和EK酶切位點(diǎn),可通過(guò)親和層析高效獲得高純度目的蛋白,簡(jiǎn)化了下游純化工作.

本純化方法主要分為3個(gè)步驟:1)采用CS親和層析,捕獲帶有純化標(biāo)簽的目標(biāo)蛋白,快速地與細(xì)胞破碎后釋放的酶、核酸、菌體蛋白、內(nèi)毒素以及色素分離,有利于融合蛋白的穩(wěn)定;2)EK酶切后蛋白用CS親和層析純化,利用不同蛋白質(zhì)氨基酸序列中組氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巰基和色氨酸的吲哚基與固定化金屬離子結(jié)合能力不同,用不同濃度的咪唑進(jìn)行蛋白分離,獲得高純度的目標(biāo)蛋白;3)最后用S-75分子篩進(jìn)行精細(xì)分離,去除少量多聚體雜質(zhì),并替換緩沖體系,即得rhIL-13純品.

采用TF-1細(xì)胞增殖法測(cè)定rhIL-13活性,比活超過(guò)8.0×106IU/mg;SDS-PAGE結(jié)果表明,rhIL-13電泳純度超過(guò)98.75%;HPLC-SEC純度為100%.MS檢測(cè)rhIL-13分子質(zhì)量為12 348 u,與理論分子質(zhì)量12 312 u基本相符;rhIL-13二硫鍵位置與理論一致,為C28-C56和C44-C702對(duì)二硫鍵.

綜上,本研究利用BL 21/p ColdⅡ-IL-13菌株實(shí)現(xiàn)了rhIL-13融合蛋白的高效表達(dá),并通過(guò)3步層析獲得了高純度、高活性的rhIL-13原液,操作過(guò)程簡(jiǎn)單,易于放大生產(chǎn),為采用基因工程技術(shù)工業(yè)化生產(chǎn)rhIL-13提供了可靠的技術(shù)支持.

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Expression,Purification and Identification of Recombinant Human Interleukin-13 in Escherichia coli

LIN Huihuang1,2,LIU Chunfeng2,YIN Fenghong2,DING yumei1,CHEN Qingxi1*

(1.School of Life Sciences,Xiamen University,Xiamen 361102,China; 2.Amoytop Biotechnique Company of Xiamen,Xiamen 361028,China)

The recombinant human interleukin-13(rhIL-13)fusion protein was expressed in Escherichia coli,and conducted in the 300 L fermentation and induced by isopropylβ-D-thiogalactoside(IPTG),then bacteria were harvested by centrifugation.The bacteria pellet was dissolved,denaturalized,renatured and affinity chromatography was performed to obtain the fusion protein;after proteolysis by enterokinase(EK),affinity chromatography and exclusion chromatography,about 30 mg high purity rhIL-13 was obtained per liter of fermentation liquid.Subsequently,the purity of rhIL-13 was determined by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE),showing the purity of more than 98.75%,and the result of size-exclusion of high performance liquid chromatography(HPLC-SEC)analysis was 100%.The molecular weight by mass spectrometry(MS)analysis was 12 348 u, the same as the theoretic value.In addition,3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)colorimetric method was performed to determine the specific activity of protein,and the result was more than 8.0×106IU/mg.The number and position of disulfide bond were also analyzed by HPCL and MS,and data showed that the disulfide bond number and position were consistent with the theoretic values.The high purity and activity of rhIL-13 was obtained by this process,which is simple and well suited for large scale production.

recombinant human interleukin-13(rhIL-13);expression;purification;identification

Q 356.1

A

0438-0479(2016)06-0836-06

10.6043/j.issn.0438-0479.201601013

2016-01-11 錄用日期:2016-03-08

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863)項(xiàng)目(2007AA021604)

chenqx@xmu.edu.cn

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