付振芳，汪小福，徐俊鋒，李玥瑩

（1.沈陽師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 沈陽 110034；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江 杭州 310021）

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增終端產(chǎn)物檢測(cè)及結(jié)果判斷的研究進(jìn)展

付振芳1，2，汪小福2，徐俊鋒2，李玥瑩1*

（1.沈陽師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 沈陽 110034；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江 杭州 310021）

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增 （LAMP）技術(shù)在2000年被日本學(xué)者Notomi等提出，并用瓊脂糖凝膠電泳及SYBRGreenⅠ熒光定量的方法對(duì)其產(chǎn)物、擴(kuò)增靈敏度進(jìn)行了分析。為了使LAMP終產(chǎn)物檢測(cè)更加簡單、直觀、省時(shí)，國內(nèi)外科學(xué)家進(jìn)行了大量的研究，先后提出濁度分析法、HNB指示劑、蠟丸染料等簡便易操作的LAMP終產(chǎn)物檢測(cè)及結(jié)果判斷方法，目前應(yīng)用較多的是瓊脂糖凝膠電泳、濁度分析法、HNB指示劑法與SYBRGreenⅠ指示劑法。本文就近年來LAMP終產(chǎn)物檢測(cè)及結(jié)果判斷進(jìn)行了綜述，匯總了近年來LAMP終產(chǎn)物檢測(cè)方法，以期為未來LAMP終產(chǎn)物檢測(cè)方法的發(fā)展提供新的思路。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增 （LAMP）；產(chǎn)物檢測(cè)；結(jié)果判斷

2000年，日本學(xué)者Notomi等在《Nucleic AcidsResearch》上提出用于核酸擴(kuò)增的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediatedisothermalamplification，LAMP）技術(shù)，該技術(shù)運(yùn)用的2組引物—上/下游外引物（F3/B3）、上/下游內(nèi)引物（FIP/BIP）能夠特異性識(shí)別靶基因上6個(gè)位點(diǎn)，在65℃恒溫條件下首次成功完成對(duì)M13mp18、HBV、前列腺特異性抗原mRNA的擴(kuò)增，擴(kuò)增靈敏度為6個(gè)DNA拷貝［1］。

靶基因在BstDNA聚合酶的作用下，60～65℃等溫?cái)U(kuò)增40～60min即可完成對(duì)靶基因的高效擴(kuò)增。擴(kuò)增過程可大致分為2個(gè)步驟： （1）形成LAMP的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)。F3首先結(jié)合到靶基因的3’端擴(kuò)增出靶基因的互補(bǔ)序列，接著B3結(jié)合到該互補(bǔ)序列擴(kuò)增出靶基因，該靶基因兩端的F3/B3可自身成環(huán)，LAMP基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)形成；（2）擴(kuò)增循環(huán)。FIP/BIP依次結(jié)合到LAMP基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)的兩端，把基因不斷擴(kuò)增延伸，最終形成靶基因與其互補(bǔ)序列交替出現(xiàn)、不同片段長度的擴(kuò)增產(chǎn)物，該產(chǎn)物呈花椰菜狀。隨著反應(yīng)進(jìn)行，大量焦磷酸根從 dNTPs上脫落，游離焦磷酸根與體系中的Mg2+結(jié)合，形成穩(wěn)定的白色沉淀。

LAMP核酸擴(kuò)增技術(shù)自提出以來，對(duì)LAMP的改良優(yōu)化大多集中在實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化，如Nagamine等［2］發(fā)現(xiàn)環(huán)引物FLP/BLP的加入能進(jìn)一步提高LAMP的擴(kuò)增效率，其他還有針對(duì)不同靶基因進(jìn)行的反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、反應(yīng)體系中各組分的濃度 （如Mg2+、甜菜堿等）等的優(yōu)化探究。而LAMP終產(chǎn)物檢測(cè)方面使用最多的方法主要是凝膠電泳、濁度檢測(cè)、SYBRGreenⅠ熒光檢測(cè)。

與其他核酸擴(kuò)增技術(shù)相比，LAMP擴(kuò)增時(shí)間短、靈敏度高、特異性好、儀器設(shè)備要求低，為實(shí)驗(yàn)條件有限的基層實(shí)驗(yàn)室或者現(xiàn)場(chǎng)的快速檢測(cè)提供了可能，主要用于致病性微生物，如細(xì)菌［3-7］、病毒［8-13］、 真菌［14］、 支原體［15］、 衣原體［16］， 致病性寄生蟲［17］， 轉(zhuǎn)基因成分［18-19］， 腫瘤［20］， 胚胎性別鑒定［21］、 安全用藥［22］、 食品過敏原［23］， 純度檢測(cè)［24］等領(lǐng)域的核酸擴(kuò)增。但由于LAMP靈敏度高、擴(kuò)增效率高的特點(diǎn)，如果依舊使用從傳統(tǒng)的凝膠電泳方法檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，極易造成實(shí)驗(yàn)室污染或者小面積氣溶膠污染，影響下次實(shí)驗(yàn)的可靠性或直接導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗；而裸眼濁度觀察雖然大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，但具有一定的主觀性。所以研究不開蓋即完成對(duì)LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)對(duì)LAMP技術(shù)的進(jìn)一步廣泛使用有著重要意義。

1 LAMP產(chǎn)物檢測(cè)技術(shù)

LAMP核酸擴(kuò)增技術(shù)具有的擴(kuò)增時(shí)間短、靈敏度高、特異性高、擴(kuò)增效率高等優(yōu)點(diǎn)使其自問世以來便得到廣泛的關(guān)注。截至目前，國內(nèi)外科學(xué)家已經(jīng)成功將該技術(shù)用于致病性微生物、致病性寄生蟲、轉(zhuǎn)基因成分、腫瘤、胚胎性別鑒定、安全用藥、食品過敏原、純度檢測(cè)等領(lǐng)域的核酸擴(kuò)增。但相較于LAMP擴(kuò)增廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域，LAMP技術(shù)的產(chǎn)物檢測(cè)方法用得較多的有瓊脂糖凝膠電泳、濁度分析、SYBRGreenⅠ熒光檢測(cè)技術(shù)。

1.1 電泳

LAMP電泳方法、原理與普通PCR電泳相同，即將擴(kuò)增產(chǎn)物按一定比例與DNA染料混合，加樣、電泳，最終通過凝膠電泳顯像系統(tǒng)成像后觀察條帶位置。所不同的是，LAMP的擴(kuò)增產(chǎn)物呈特異的梯狀條帶。LAMP的電泳方法有瓊脂糖凝膠電泳、毛細(xì)管電泳［25］，瓊脂糖凝膠電泳是較常用的方法，也可以用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ對(duì)LAMP產(chǎn)物進(jìn)行酶切，產(chǎn)生與理論片段大小相符的產(chǎn)物片段。

1.2 熒光染料法

熒光染料與雙鏈DNA雙螺旋小溝區(qū)域結(jié)合后熒光大大增強(qiáng)，因此可以利用熒光信號(hào)強(qiáng)度定性指示雙鏈DNA的數(shù)量。熒光染料法用到的染料主要有SYBRGreenⅠ、GoldView以及PMA。其中SYBRGreenⅠ的應(yīng)用最為廣泛。

SYBRGreenI-LAMP。SYBRGreenⅠ是一種綠色激發(fā)波長染料，在游離狀態(tài)下發(fā)出微弱的熒光，與雙鏈DNA結(jié)合后熒光大大增強(qiáng)。在LAMP產(chǎn)物中加入SYBRGreenⅠ溶液，陰性結(jié)果為橙色，陽性為熒光黃或紫外燈下發(fā)出熒光。因此，SYBR GreenI可以用來指示LAMP擴(kuò)增。根據(jù)SYBR GreenⅠ加入的方式，SYBRGreenI-LAMP主要有普通指示法、管壁法、染料蠟丸［26-27］等方法。普通指示法，反應(yīng)結(jié)束后開蓋直接加入SYBRGreenⅠ溶液；管壁法，反應(yīng)前將SYBRGreenⅠ加在管蓋內(nèi)壁上，反應(yīng)結(jié)束后離心或顛倒混勻離心管，使蓋內(nèi)壁的SYBRGreenⅠ與反應(yīng)液混合，最后觀察離心管中反應(yīng)液顏色，該方法雖避免了開蓋，但SYBRGreenⅠ會(huì)在一定程度上抑制LAMP擴(kuò)增，所以蓋管蓋時(shí)要防止管蓋上的指示劑溶液與反應(yīng)液混合；染料蠟丸，將SYBRGreenⅠ染料包裹于蠟丸中，反應(yīng)前體系中加入一粒，擴(kuò)增結(jié)束后95℃處理5min，使蠟丸融化釋放SYBRGreenⅠ染料，染料與擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合釋放大量熒光，冷卻后蠟丸凝固并把反應(yīng)終產(chǎn)物封于反應(yīng)管底部，這樣在很大程度上降低了污染。以上方法只能在擴(kuò)增終點(diǎn)定性地判斷LAMP是否擴(kuò)增。為了實(shí)現(xiàn)對(duì)擴(kuò)增過程的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，以普通PCR熒光定量法為參考衍生出實(shí)時(shí)熒光法。

另外2種熒光染料是GoldView與PMA。GoldView是一種新型核酸染料，與核酸結(jié)合后能產(chǎn)生很強(qiáng)的熒光信號(hào)，擴(kuò)增結(jié)束后將GoldView加入反應(yīng)管中混勻離心，紫外線燈下觀察陽性反應(yīng)管呈綠色，陰性呈橘紅色［28］。PMA，疊氮溴化丙啶（propidiummonozaide），是一款具有高親和力的光敏反應(yīng)DNA結(jié)合染料，傾向于結(jié)合dsDNA。PMA上的光敏性疊氮基團(tuán)生成高反應(yīng)性的氮賓基團(tuán)，它與羥基化合物共價(jià)結(jié)合，形成不可逆的DNA修飾。PMA完全不能通過細(xì)胞膜，因此它只能選擇性地修飾死細(xì)胞 “暴露”的DNA。這一特性使得它可以和LAMP聯(lián)合使用，選擇性地?cái)U(kuò)增活細(xì)菌DNA，而不擴(kuò)增被PMA修飾的死細(xì)菌DNA，所以用PMA-LAMP可避免死細(xì)胞DNA擴(kuò)增帶來的活菌計(jì)數(shù)錯(cuò)誤或非特異擴(kuò)增造成的假陽性結(jié)果［29］。

1.3 基于鎂離子、焦磷酸根的檢測(cè)技術(shù)

LAMP反應(yīng)過程中會(huì)有大量焦磷酸根（P2O4-7）從dNTPs上脫落，游離焦磷酸根與體系中的 Mg2+結(jié)合，形成穩(wěn)定的白色焦磷酸鎂（Mg4P2O7）沉淀。所以隨著擴(kuò)增的進(jìn)行，體系中焦磷酸鎂沉淀逐漸增多，Mg2+逐漸減少。焦磷酸鎂的積累會(huì)使體系變渾濁，基于此產(chǎn)生LAMP濁度法。擴(kuò)增結(jié)束后，用肉眼觀察體系是否變渾濁或離心后底部是否有白色沉淀即可判斷是否有擴(kuò)增。還可使用濁度儀對(duì)體系進(jìn)行終點(diǎn)濁度檢測(cè)或者實(shí)時(shí)濁度檢測(cè)。濁觀察節(jié)省了時(shí)間，也避免了開蓋污染，但肉眼觀察判斷是否有渾濁有一定的主觀性，不符合客觀、科學(xué)的研究要求。故不少學(xué)者開發(fā)出基于體系中Mg2+離子變化的指示劑法。

指示劑法是指根據(jù)指示劑的物理化學(xué)特性，在擴(kuò)增前后加入指示劑，隨著體系中 Mg2+濃度的變化，指示劑因得到或失去Mg2+進(jìn)而顏色發(fā)生變化的一種方法。常用的指示劑有鈣黃綠素、HNB、MUA-AuNPs、鉻黑T或其衍生物、PAR鈉鹽等，其中鈣黃綠素、HNB最為常用。

鈣黃綠素 （calcein，3，3′-雙 （甲胺二乙酸）熒光素），亮黃色粉末，溶于乙醇和堿，微溶于水；絡(luò)合指示劑、熒光指示劑，與鎂離子結(jié)合而成的復(fù)合物可產(chǎn)生強(qiáng)烈熒光。反應(yīng)前加入鈣黃綠素，此時(shí)鈣黃綠素與錳離子結(jié)合為淬滅態(tài)，即無熒光產(chǎn)生。隨著反應(yīng)進(jìn)行，大量產(chǎn)生的焦磷酸根與錳離子形成穩(wěn)定的焦磷酸錳沉淀，此時(shí)鎂離子取代錳離子與鈣黃綠素結(jié)合，產(chǎn)生熒光［30］。AuNPs，納米金（goldnanoparticles），可見光下AuNPs粒子發(fā)生表面等離子體共振，根據(jù)粒子直徑大小顏色從紅色變至紫色。MUA-AuNPs，是納米金與巰基十一烷酸形成的復(fù)合物。實(shí)驗(yàn)時(shí)提前加入指示劑 MUAAuNPs，在體系中的Mg2+的作用下MUA-AuNPs之間相互螯合，直徑變大，此時(shí)體系為紫羅蘭色；擴(kuò)增完成后，Mg2+與P2O4-7形成穩(wěn)定的白色沉淀，此時(shí)失去Mg2+的MUA-AuNPs使得體系變成紅色，因此可根據(jù)體系顏色變化來判斷擴(kuò)增反應(yīng)的結(jié)果［31］。HNB，羥基萘酚藍(lán)（hydroxynaphtholblue），金屬離子指示劑，深紫色粉末，易溶于水和乙醇；其水溶液在pH為7～12時(shí)呈藍(lán)色，pH＞13時(shí)呈紅色。LAMP體系中提前加入HNB水溶液，起初鎂離子與HNB結(jié)合使得反應(yīng)體系為紫羅蘭色；隨著反應(yīng)的進(jìn)行，Mg2+與析出的 P2O4-7反應(yīng)生成Mg2P2O7沉淀，HNB失去Mg2+使得體系顏色變?yōu)樘焖{(lán)色，而未反應(yīng)的體系則仍保持著紫羅蘭色［32］。鉻黑T，1-（1-羥基-2-萘偶氮）-6-硝基-2-萘酚-4-磺酸鈉（eriochromeblackT），又名依來鉻黑T；棕黑色粉末，溶于水，6.3＜pH＜11.6為藍(lán)色；絡(luò)合指示劑，絡(luò)合物為紅色。將指示劑溶液提前加入擴(kuò)增體系中，反應(yīng)開始時(shí)，鉻黑T或其衍生物與鎂離子結(jié)合成為紅色，隨著反應(yīng)進(jìn)行副產(chǎn)物焦磷酸根與鎂離子形成沉淀，鉻黑T或其衍生物失去鎂離子后，由紅色變?yōu)樗{(lán)色。PAR鈉鹽，吡啶-（2-偶氮-4）間苯二酚一鈉鹽或4-（2-吡啶偶氮）間苯二酚單鈉鹽一水物（4-（2-pyridylazo）resorcinol monosodiumsalt），橙棕色至棕色結(jié)晶粉末，易溶于水和乙醇，水溶液呈黃色，絡(luò)合指示劑，原理與鉻黑T相同，PAR鈉鹽與鎂離子結(jié)合形成橘紅色絡(luò)合物，失去鎂離子后橘紅色變?yōu)辄S色［33］。

1.4 與其他技術(shù)結(jié)合的檢測(cè)技術(shù)

LAMP單管擴(kuò)增時(shí)間短、效率高、靈敏度好，但由于LAMP引物的復(fù)雜性，單管多重LAMP擴(kuò)增在實(shí)現(xiàn)上有一定的難度。所以LAMP與其他技術(shù)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)廣義上的多重?cái)U(kuò)增為解決多重LAMP擴(kuò)增提供了新的思路。

LFD法。橫向流動(dòng)試紙條檢測(cè)技術(shù)（lateral flowdipstick，LFD），該方法基于LAMP擴(kuò)增原理，上游內(nèi)引物由生物素 （biotin）標(biāo)記，同時(shí)在內(nèi)引物擴(kuò)增的有效區(qū)段內(nèi)設(shè)計(jì)1條異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的DNA探針，由FITC標(biāo)記的探針與生物素標(biāo)記的LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物特異性雜交，若結(jié)果為陽性則檢測(cè)線、質(zhì)控線處均出現(xiàn)條帶，陰性結(jié)果只出現(xiàn)質(zhì)控線一條帶［34-35］。

微流控LAMP芯片系統(tǒng)。LAMP與微流控技術(shù)的結(jié)合在廣義上解決了LAMP無法進(jìn)行多重?cái)U(kuò)增以及更加快速的sample-to-answer的問題，主要有單重定性/定量LAMP芯片、多重定性/定量LAMP芯片及單重/多重集成LAMP芯片。單重定性/定量LAMP芯片擴(kuò)增場(chǎng)所由傳統(tǒng)的EP管改為5μL體積反應(yīng)槽，一個(gè)芯片可承載多個(gè)獨(dú)立反應(yīng)槽，反應(yīng)結(jié)束后可根據(jù)反應(yīng)槽中是否有白色沉淀直接判斷有無擴(kuò)增 （單重定性），也可以使用可見吸光光度法實(shí)時(shí)檢測(cè)LAMP反應(yīng)液的混濁程度可以定量樣品中的目的基因 （單重定量）。多重定性/定量LAMP芯片，芯片上設(shè)計(jì)有輻射狀凹槽，凹槽端點(diǎn)為擴(kuò)增池（可根據(jù)需要在擴(kuò)增池中加入終點(diǎn)指示劑），交叉點(diǎn)為加樣孔。加樣后，樣品通過此孔在毛細(xì)管拉力的作用下均勻分布到各擴(kuò)增池進(jìn)行LAMP擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)反應(yīng)槽中是否有白色沉淀或相應(yīng)的指示劑有無陽性反應(yīng)直接判斷有無擴(kuò)增 （多重定性），或使用微型反射式光纖傳感器測(cè)定每個(gè)樣品的動(dòng)力學(xué)曲線閥值來定量樣品中原始目標(biāo)基因的含量 （多重定量）。單重/多重集成LAMP芯片，芯片由DNA提取室，毛細(xì)管通道和LAMP擴(kuò)增室三部分組成，多重集成LAMP芯片模板擁有多個(gè)LAMP擴(kuò)增室，其數(shù)量與重?cái)?shù)相同。DNA提取完成后打開螺絲微閥使DNA進(jìn)入擴(kuò)增室，加入反應(yīng)液，完成擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)果通過濁度判斷或加入終點(diǎn)指示劑［36-37］。

2 問題及展望

LAMP技術(shù)的提出打破傳統(tǒng)核酸擴(kuò)增技術(shù)需要溫度循環(huán)的常規(guī)，縮短了擴(kuò)增時(shí)間、提高了擴(kuò)增效率，并且其靈敏度高、特異性好、不需要嚴(yán)苛的實(shí)驗(yàn)條件以及大型儀器設(shè)備、擴(kuò)增結(jié)果可直接裸眼觀察或者通過指示劑法直接觀察的優(yōu)點(diǎn)，為核酸擴(kuò)增技術(shù)普及、條件不足的基層實(shí)驗(yàn)室開展實(shí)驗(yàn)以及現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)提供了可能?？v觀15年來的發(fā)展，LAMP產(chǎn)物檢測(cè)技術(shù)不斷優(yōu)化：從傳統(tǒng)的瓊脂糖凝膠電泳到濁度觀察、指示劑顏色變化等終點(diǎn)判斷方法，再到與其他技術(shù)相結(jié)合，縮短了檢測(cè)周期的同時(shí)也克服了開蓋污染以及無法多重?cái)U(kuò)增的問題。但是相比于LAMP應(yīng)用領(lǐng)域的遍地開花，LAMP檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展相形見絀，而且已有的方法依舊存在易污染等問題。電泳、濁度分析、SYBRGreenⅠ等檢測(cè)方法應(yīng)用較為廣泛，但開蓋電泳極易造成實(shí)驗(yàn)室污染。濁度分析不能避免肉眼觀察的主觀性；實(shí)時(shí)濁度分析結(jié)果雖更加客觀，但依舊依賴昂貴的實(shí)驗(yàn)儀器，不利于LAMP方法的基層普及或現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。SYBRGreenⅠ提前加入會(huì)抑制LAMP擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后加入又極易造成污染；染料蠟丸法的提出為指示劑的發(fā)展提供了新的思路，克服了前2個(gè)問題，但蠟丸的制作在某種程度上增加了檢測(cè)成本以及時(shí)間。而指示劑 HNB、鈣黃綠素等既不抑制LAMP擴(kuò)增又簡單易操作的方法可以為LAMP檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展提供參考。LFD法因?yàn)橐_蓋將試紙條放入終產(chǎn)物中，所以也不能避免開蓋污染，而且試紙條造價(jià)較高，該方法適于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等開放環(huán)境中。芯片法從廣義上解決了LAMP多重?cái)U(kuò)增的問題，但每個(gè)芯片各實(shí)驗(yàn)組之間容易交叉污染的問題并沒有解決。綜上所述，發(fā)展能夠?qū)崿F(xiàn)多重?cái)U(kuò)增、低污染率、簡便易操作、低成本的檢測(cè)方法依舊是未來LAMP終產(chǎn)物檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展方向。

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（責(zé)任編輯：張 韻）

Q78

A

0528-9017（2016）05-0725-05

2016-02-02

浙江省公益性項(xiàng)目 （2014C22001，2015C32063）；浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目 （LY15C200011）

付振芳 （1990—），女，河北邯鄲人，碩士研究生，研究方向?yàn)檗D(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)，E-mail：frace7@sina.com。

李玥瑩 （1966—），女，遼寧大連人，教授，博士，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向?yàn)榉肿舆M(jìn)化與分子生物學(xué)，E-mail：yueyinglicn@yahoo.com.cn。

文獻(xiàn)著錄格式：付振芳，汪小福，徐俊鋒，等.環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增終端產(chǎn)物檢測(cè)及結(jié)果判斷的研究進(jìn)展 ［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，57（5）：725-729.

10.16178/j.issn.0528-9017.20160535