謝小波，孫崇波，宋仙水

（1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝研究所，浙江 杭州 310021；2.浙江鐵楓堂科技股份有限公司，浙江 樂(lè)清 325616）

鐵皮石斛γ射線誘變及后代變異研究

謝小波1，孫崇波1，宋仙水2

（1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝研究所，浙江 杭州 310021；2.浙江鐵楓堂科技股份有限公司，浙江 樂(lè)清 325616）

為獲得鐵皮石斛原球莖γ射線輻照的合適劑量，以鐵皮石斛品種仙斛1號(hào)為材料，對(duì)它的原球莖進(jìn)行了137Cs-γ射線的輻照研究，并對(duì)其后代變異作了分析。結(jié)果表明：在1.0Gy·min-1輻照劑量率下，3個(gè)月后，50，70，90，110和120Gy輻照劑量的原球莖存活率分別為100%，89.6%，35.2%，13.1%和0，曲線擬合半致死劑量為86.4Gy；經(jīng)6個(gè)多月的培養(yǎng)后，以沒(méi)有輻照的材料作為對(duì)照，分子標(biāo)記SSR和ISSR分析表明，70，90和110Gy輻照后差異條帶比率分別為1.01%，1.52%和2.53%；組培10個(gè)月后測(cè)定幼苗莖中的石斛多糖含量，輻照前后比較差異均不顯著。研究認(rèn)為，1.0Gy·min-1的劑量率下，半致死劑量86.4Gy附近的劑量可用于鐵皮石斛原球莖的輻照誘變處理。

鐵皮石斛；原球莖；137Cs-γ射線輻照；分子標(biāo)記；遺傳變異；石斛多糖

鐵皮石斛（DendrobiumofficinaleKimuraet Migo）為蘭科石斛屬植物，性味甘、微寒，具有益胃生津、滋陰清熱功效，是名貴中藥材之一，在中醫(yī)養(yǎng)生、保健方面有顯著作用，并作為單味中藥飲片被收錄于 《中國(guó)藥典》 （2010版）［1］。鐵皮石斛良好的功效也曾引發(fā)了人們對(duì)其野生資源的過(guò)度采集，造成了自然鐵皮石斛種質(zhì)資源的瀕臨滅絕，引發(fā)了人們對(duì)鐵皮石斛野生資源保護(hù)的思考和研究［2］。同時(shí)在旺盛的市場(chǎng)需求促動(dòng)下，鐵皮石斛人工栽培及其加工產(chǎn)業(yè)獲得了快速發(fā)展［3-4］，成就了今天年產(chǎn)值超幾十億的單味藥材市場(chǎng)規(guī)模［5］。近幾年來(lái)隨著產(chǎn)業(yè)規(guī)模的擴(kuò)展，鐵皮石斛的育種、遺傳等研究也取得了進(jìn)步，新品種在不斷推出，如天斛1號(hào)、仙斛1號(hào)、仙斛2號(hào)、森山1號(hào)等［6-8］。在鐵皮石斛育種研究中，野生資源馴化篩選、組培等手段在前期得到了大力應(yīng)用，在積累了一定育種材料之后，目前雜交、輻照等育種技術(shù)也開(kāi)始應(yīng)用［9-10］。γ射線輻照可以創(chuàng)造突變體，如水稻、玉米、中藥材等［11-13］，但在鐵皮石斛上應(yīng)用尚缺少經(jīng)驗(yàn)。本研究開(kāi)展了不同輻照劑量的比較試驗(yàn)，以期獲得以鐵皮石斛原球莖為對(duì)象的適合的γ射線輻照劑量，并分析后代輻照群體的變異情況，以便從中篩選理想的遺傳和育種研究材料。

1 材料與方法

1.1 材料

以鐵皮石斛品種仙斛1號(hào)的原球莖為材料，該品種具有鐵皮石斛典型的黑節(jié)、鐵銹色等特征，綜合性狀優(yōu)良［11］。原球莖增殖培養(yǎng)基為：MS+ 0.5mg·L-16-BA+0.8mg·L-12，4-D+2.0g· L-1活性炭 （AC）。原球莖通過(guò)增殖培養(yǎng)鋪滿培養(yǎng)基表面，然后進(jìn)行137Cs-γ射線的輻照處理。輻照后的原球莖立即轉(zhuǎn)接到新的增殖培養(yǎng)基，并在培養(yǎng)2個(gè)月和3個(gè)月時(shí)分別統(tǒng)計(jì)原球莖死亡率，3個(gè)月后原球莖的死亡情況已基本穩(wěn)定。未死亡原球莖轉(zhuǎn)接到幼苗分化生長(zhǎng)培養(yǎng)基：MS+1.2mg·L-16-BA+0.2mg·L-1IBA+2.0g·L-1AC，促使幼苗分化和伸長(zhǎng)生長(zhǎng)。再經(jīng)6個(gè)月采葉片進(jìn)行分子標(biāo)記檢測(cè)，10個(gè)月后取瓶?jī)?nèi)小苗的莖進(jìn)行粗多糖含量測(cè)定。以未經(jīng)輻照處理的仙斛1號(hào)原球莖為對(duì)照，培養(yǎng)條件與輻照材料相同。

1.2 輻照方法

輻照材料采用45d培養(yǎng)并生長(zhǎng)旺盛的原球莖，連同培養(yǎng)瓶一起送到輻射源室內(nèi)進(jìn)行137Cs-γ射線輻照 （在浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院輻照中心進(jìn)行），輻射劑量率為1.0Gy·min-1，輻射劑量分別設(shè)為50，70，90，110，120和 140Gy，每個(gè)劑量輻照原球莖1瓶，每瓶均有大量原球莖，但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)確切數(shù)量。輻照以后，每個(gè)劑量處理的原球莖立即轉(zhuǎn)接到4～8瓶新的增殖培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng)。

注：本研究得到浙江鐵楓堂科技股份有限公司、溫州市政府和樂(lè)清市政府的資助，是陳劍平院士樂(lè)清鐵皮石斛工作站研究?jī)?nèi)容之一，整個(gè)過(guò)程得到陳劍平院士的指導(dǎo)。在此一并表示衷心的感謝！

1.3 DNA提取和分子標(biāo)記分析

DNA提取采用Qiagen試劑盒，并按照試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行提取。DNA提取所用樣品均為混合采樣，一個(gè)群體采集30株小苗的葉片進(jìn)行混合提取。

分子標(biāo)記分析采用SSR和ISSR2種標(biāo)記類型，SSR分子標(biāo)記采用已發(fā)表的標(biāo)記［14-17］，ISSR主要為UBC系列 （哥倫比亞大學(xué)開(kāi)發(fā)）。SSR和ISSR的反應(yīng)體系相同，均為：反應(yīng)總體積25μL，其中模板 DNA1.0μL（25ng），隨機(jī)引物 （濃度10μmol·L-1）1.0μL，10×PCRBuffer2.5μL，MgCl22.0μL，dNTPs2.0μL，Taq酶1U，加ddH2O至25μL。反應(yīng)所用試劑均購(gòu)自上海生物工程有限公司。

SSR的PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4.0min，然后94℃40s，50～60℃45s，72℃1.5min，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5.0min。ISSR的反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5.0min，然后94℃1.0min，50～60℃1.0min，72℃2.0min，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7.0min。SSR的PCR產(chǎn)物用聚丙烯酰胺非變性凝膠或高分辨率瓊脂糖凝膠電泳，ISSR的PCR產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳。

1.4 石斛多糖測(cè)定

石斛多糖測(cè)定也采用混合采樣的方法，即在同一個(gè)群體中采集30株小苗的莖段混合后進(jìn)行測(cè)定。石斛多糖提取按照 《中國(guó)藥典》 （2010年版）中描述的方法進(jìn)行［1］，并略有修改。標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法：配制無(wú)水葡萄糖溶液，每 1mL含90μg，取溶液 0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL，分別置10mL具塞試管中，各加水補(bǔ)至1.0mL，精密加入5%苯酚溶液1mL（臨用配制），搖勻，再加硫酸5mL，搖勻，置沸水浴中加熱20min，取出，置冰浴中冷卻5min，以相應(yīng)試劑為空白，照紫外—可見(jiàn)分光光度計(jì)488nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品制備方法：稱取新鮮樣品1.0g，加水200mL，加熱回流2h，放冷，轉(zhuǎn)移至250mL量瓶中，用少量水分次洗滌容器，洗液并入同一量瓶中，加水至刻度，搖勻，過(guò)濾，精密量取濾液2 mL，置15mL離心管中，精密加入無(wú)水乙醇10mL，搖勻，冷藏1h，取出，4000r·min-1離心20min，棄去上清液，沉淀加80%乙醇洗滌2次，每次8mL，離心，棄去上清液，沉淀加熱水溶解，轉(zhuǎn)移至25mL量瓶中，放冷，加水至刻度，搖勻備用。量取供試品溶液1mL，同標(biāo)準(zhǔn)樣品制備方法，488nm測(cè)定吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同輻照劑量對(duì)鐵皮石斛原球莖生長(zhǎng)的影響

采用 7種137Cs-γ射線輻照劑量：0，50，70，90，110，120和140Gy對(duì)仙斛1號(hào)的原球莖進(jìn)行輻照，然后進(jìn)行繼代培養(yǎng)。在開(kāi)始培養(yǎng)的3個(gè)月中，除去少量污染的以外，每種處理劑量最后均保存了3瓶以上原球莖，從中各取3瓶統(tǒng)計(jì)并比較存活率差異。結(jié)果表明：輻照后的原球莖經(jīng)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，原球莖逐漸死亡，且輻照劑量越大死亡越快。3個(gè)月后，不再有新的原球莖死亡發(fā)生。統(tǒng)計(jì)存活率表明，50Gy輻照的原球莖幾乎沒(méi)有死亡，70，90和110 Gy輻照的原球莖存活率分別為89.6%，35.2%和13.1%，而大于120Gy的原球莖則完全死亡，除0和50Gy沒(méi)有原球莖死亡發(fā)生外，其余各處理間經(jīng)t檢驗(yàn)均為極顯著差異；原球莖增殖倍數(shù)比較表明，各劑量處理之間均存在極顯著差異 （表1）。在1.0Gy·min-1的輻照劑量率下，對(duì)輻照劑量和原球莖存活率進(jìn)行了曲線擬合，得到原球莖存活率與輻照劑量的關(guān)系方程為：y=-1.5409x+183.18（y為存活率，%；x為輻照劑量，Gy），其中R2=0.959 2，計(jì)算獲得半致死劑量LD50值為86.4Gy。

表1 不同137Cs-γ射線輻照劑量對(duì)鐵皮石斛原球莖的存活和生長(zhǎng)影響

2.2 輻照對(duì)鐵皮石斛遺傳變異的影響

對(duì)未輻照和輻照后的原球莖進(jìn)行了繼代繁殖和伸長(zhǎng)、生根培養(yǎng)，在0，50，70，90和110Gy等5份材料中，在形成小苗后，分別剪取30株苗的少許葉片并混合提取DNA，用于分子標(biāo)記分析。從公開(kāi)發(fā)表的 SSR文庫(kù)中篩選了擴(kuò)增良好的標(biāo)記，主要包括Gu等［14］的DO系列11個(gè)，Yue等［15］OA系列 10個(gè)，謝明璐等［16］XML系列 13個(gè)和 Lu等［17］DOeSSR系列96個(gè)，合計(jì)130個(gè)位點(diǎn)。另外采用ISSR標(biāo)記17個(gè)，其中UBC系列10個(gè)，ISSR系列7個(gè)，共擴(kuò)增獲得68個(gè)位點(diǎn)。2種分子標(biāo)記一共獲得198個(gè)位點(diǎn)的擴(kuò)增條帶。測(cè)定結(jié)果表明，2種分子標(biāo)記中，少數(shù)標(biāo)記在樣品間表現(xiàn)出差異條帶，如SSR標(biāo)記XML6、ISSR標(biāo)記UBC825（圖1）。最終，與未輻照的親本比較，50Gy輻照的群體沒(méi)有檢測(cè)到差異條帶，70，90和110Gy測(cè)得差異條帶比率分別為1.01%，1.52%和2.53%，表明原球莖部分發(fā)生了DNA水平變異，且變異發(fā)生程度與輻射劑量存在一定正相關(guān)。

圖1 分子標(biāo)記在鐵皮石斛輻照群體中的差異擴(kuò)增

2.3 輻照對(duì)石斛多糖含量的影響

石斛多糖含量常被用來(lái)衡量鐵皮石斛品質(zhì)優(yōu)劣的一個(gè)重要指標(biāo)，因此，我們也對(duì)輻照前后的鐵皮石斛進(jìn)行了石斛多糖的測(cè)定。輻照前后的原球莖同時(shí)經(jīng)過(guò)3次繼代培養(yǎng)，10個(gè)月以后形成了約10cm高的小苗，分別在每個(gè)群體中取30個(gè)小苗的莖段進(jìn)行石斛多糖含量測(cè)定。結(jié)果表明，輻照前后的鐵皮石斛多糖含量沒(méi)有檢測(cè)到顯著差異 （表2）。

表2 輻照對(duì)鐵皮石斛多糖含量的影響

3 討論

在1.0Gy·min-1的輻照劑量率下，通過(guò)曲線擬合獲得鐵皮石斛原球莖γ射線輻照半致死劑量為86.4Gy，這對(duì)我們開(kāi)展鐵皮石斛原球莖輻照誘變研究有較好參考意義，但在不同的材料中是否有類似效果仍需要實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。這一結(jié)果與詹忠根等［10］67.23Gy半致死劑量有差異，可能原因是2項(xiàng)研究采用的劑量率不同，詹忠根等使用的劑量率為5.0Gy·min-1。輻射劑量率與半致死劑量在動(dòng)物和醫(yī)學(xué)上有研究，通常兩者有反比關(guān)系［18］，但在植物上少有報(bào)道。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，我們認(rèn)為在1.0Gy·min-1的劑量率下，采用80～100Gy誘變鐵皮石斛原球莖是比較適合的輻射劑量。

分子標(biāo)記可以用于突變性狀的連鎖檢測(cè)和基因的定位分析，從而為育種輔助選擇提供幫助，分子標(biāo)記技術(shù)已成熟應(yīng)用于各類物種的育種、遺傳等方面研究［18-19］。本項(xiàng)目采用SSR和ISSR分子標(biāo)記檢測(cè)后代遺傳變異情況，從一個(gè)側(cè)面真實(shí)反映了輻照后的材料在DNA水平發(fā)生了某些序列變化。但此類分子標(biāo)記在擴(kuò)增的片段中對(duì)某些情況的堿基替換、倒位等情況不能做出確切判斷。因此，所檢測(cè)的結(jié)果可以作為參考，部分反映輻照材料后代發(fā)生變異的情況。在后續(xù)的研究中，需要進(jìn)行單株測(cè)定，包括在農(nóng)藝性狀、生理指標(biāo)等方面進(jìn)行多角度比較分析。像石斛多糖含量指標(biāo)的分析，只有在較大的群體中進(jìn)行單株篩選才有可能獲得石斛多糖積累發(fā)生了突變的植株。

石斛多糖是鐵皮石斛中含量最多的生理活性物質(zhì)，并常被用來(lái)衡量鐵皮石斛的品質(zhì)［20-22］。因此，我們也著重對(duì)輻照前后石斛多糖含量進(jìn)行了比較。分析結(jié)果表明，該多糖含量在輻照前后并沒(méi)有達(dá)到顯著差異，這說(shuō)明在混合采收的樣品中，產(chǎn)生的變異可能并不足以影響輻照群體石斛多糖含量的水平，也表示突變的概率可能比較低，這與其他作物獲得的結(jié)果具有相似之處。因此，在實(shí)踐應(yīng)用中，我們要在保證部分材料存活的前提下盡可能提高突變發(fā)生的概率，同時(shí)還要增加群體量和采用單株選擇的方法，提高篩選效率。

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（責(zé)任編輯：張 韻）

S567

A

0528-9017（2016）05-0687-04

2015-12-31

院士工作站項(xiàng)目；浙江創(chuàng)意農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心 （2013E10037）；院地科技合作項(xiàng)目 （WZ20130006）

謝小波（1968—），男，副研究員，博士，研究方向?yàn)橹兴幉倪z傳育種研究工作，E-mail：xiaoboxie@yahoo.com。

文獻(xiàn)著錄格式：謝小波，孫崇波，宋仙水.鐵皮石斛γ射線誘變及后代變異研究 ［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，57（5）：687-690.

10.16178/j.issn.0528-9017.20160523