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        水酶法水解液中大豆多肽的吸附純化及其氨基酸組成分析

        2016-12-06 09:11:05張巧智馬文君隋曉楠江連洲
        食品科學(xué) 2016年22期
        關(guān)鍵詞:酶法大孔多肽

        張巧智,畢 爽,馬文君,李 楊,隋曉楠,江連洲*

        (東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150030)

        水酶法水解液中大豆多肽的吸附純化及其氨基酸組成分析

        張巧智,畢 爽,馬文君,李 楊,隋曉楠,江連洲*

        (東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150030)

        考察大孔吸附樹脂對(duì)水酶法水解液中大豆多肽的吸附性能和純化效果,通過(guò)靜態(tài)吸附和解吸實(shí)驗(yàn)對(duì)8種樹脂進(jìn)行了初步篩選,并進(jìn)一步研究了上樣體積、上樣流速、解吸劑體積分?jǐn)?shù)等條件對(duì)大孔吸附樹脂純化能力的影響。結(jié)果表明:DA201-C大孔吸附樹脂對(duì)水酶法大豆多肽的吸附性能優(yōu)于其他7 種樹脂,其最佳動(dòng)態(tài)吸附工藝為:上樣體積140 mL、上樣流速1.5 mL/min、水洗體積350 mL,體積分?jǐn)?shù)25%、50%、75%、100%乙醇溶液分級(jí)洗脫,每次80 mL,流速2 mL/min。經(jīng)純化后各大豆多肽組分純度均在80%以上,總回收率為95.65%,樹脂吸附量為13.32 mg/g,糖類及鹽類雜質(zhì)分別降低51%及90%以上;乙醇分級(jí)洗脫可分離4 個(gè)大豆多肽組分,其中75%體積分?jǐn)?shù)組分SP-DA75氧自由基清除能力最強(qiáng),肽段的抗氧化性與其疏水性氨基酸含量及酸性氨基酸含量具有一定相關(guān)性。

        水酶法;大豆多肽;大孔吸附樹脂;純化;氨基酸組成

        傳統(tǒng)的大豆油制取方法主要有壓榨法和浸出法,這些方法雖然可制得95%以上的油脂,但易導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性,難以進(jìn)一步利用,造成蛋白質(zhì)資源的巨大浪費(fèi),而且存在設(shè)備復(fù)雜、有害溶劑殘留、生產(chǎn)安全性差等問(wèn)題[1-2]。水酶法作為一種新興的綠色提油技術(shù),它以機(jī)械破碎和酶解為手段,萃取條件溫和,所制油品質(zhì)高,同時(shí)分離得到的蛋白可進(jìn)行深加工,進(jìn)一步應(yīng)用于多種食品體系[3-5]。與此同時(shí),提油過(guò)程中酶的作用會(huì)伴隨大豆蛋白的有限水解,釋放短鏈多肽,大豆多肽已被證明具有調(diào)節(jié)免疫、抗病毒、抗氧化、降低血壓、降低膽固醇等多種生理功能[6-7],雖活性稍低,但來(lái)源廣泛,廉價(jià)易得,食用安全性高,前景十分廣闊。水酶法工藝中低分子大豆多肽主要存在于酶解離心后的水相——水解液中,水解液中同時(shí)還存在著不完全水解的大分子蛋白、可溶性低聚糖及少量細(xì)小油滴[8-9],此外,為中和酶解過(guò)程中肽鍵斷裂產(chǎn)生的H+維持體系pH值而持續(xù)加入的堿液,也增加了酶解物中的鹽分含量[7,10],這些物質(zhì)的存在影響了產(chǎn)品感官特性以及后續(xù)生物活性肽的效用發(fā)揮,也極大地限制了其在食品等領(lǐng)域的應(yīng)用,因此,對(duì)水解液中雜質(zhì)的去除以及潛在功能性大豆多肽的分離純化研究對(duì)水酶法副產(chǎn)物增值及產(chǎn)業(yè)化推廣具有重要意義。

        大孔吸附樹脂作為一類新型的非離子型吸附劑,是由苯乙烯、二乙烯苯、二甲丙烯酸酯等聚合而成的具有網(wǎng)狀孔穴結(jié)構(gòu)的高聚物,兼具吸附和分子篩功能,可根據(jù)分離物分子大小及極性差異進(jìn)行分離。同時(shí)由于樹脂與分離物之間為物理吸附作用,被吸附物解吸容易,理化性質(zhì)影響小,且具有成本低廉、操作簡(jiǎn)單、選擇性好、再生容易等優(yōu)點(diǎn)[11-12],已逐漸在生物活性物質(zhì)純化領(lǐng)域得到應(yīng)用。如馬寒冰等[12]研究發(fā)現(xiàn)DA201-C型大孔吸附樹脂對(duì)大豆多肽的吸附和脫鹽效果最佳;Zhu Kexue等[13]利用大孔吸附樹脂對(duì)麥芽蛋白水解物中的鋅螯合肽進(jìn)行純化處理,脫鹽率和肽回收率均較理想。氧自由基清除能力(oxygen radical absorbance capacity,ORAC)是目前國(guó)內(nèi)外應(yīng)用較廣的體外抗氧化活性判定方法,具有靈敏度高、穩(wěn)定性好、與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)相關(guān)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),被最新推薦為抗氧化能力測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)方法之一[7,14]。

        本研究以大豆水酶法提油后的水解液為原料,通過(guò)靜態(tài)及動(dòng)態(tài)吸附、解吸實(shí)驗(yàn),確定純化大豆多肽的最佳吸附條件,進(jìn)一步利用不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液對(duì)大豆多肽分級(jí)洗脫,以O(shè)RAC值為指標(biāo)評(píng)價(jià)不同洗脫組分的抗氧化能力,并與氨基酸組成相聯(lián)系,探討不同的氨基酸種類對(duì)其抗氧化活性的貢獻(xiàn),為后續(xù)水酶法大豆多肽的富集純化、活性研究以及工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        東北大豆(水分含量9.83%,脂肪含量21.54%,蛋白含量39.12%,灰分含量4.20%) 黑龍江紅興隆農(nóng)墾沃野有機(jī)食品有限公司;堿性蛋白酶Protex 6L(580 000 DU/g,適宜溫度25~70 ℃,適宜pH 7.0~10.0)杰能科(中國(guó))生物工程有限公司;D101、DA201-C、X-5、D3520、AB-8、DM130、NKA-Ⅱ、S-8大孔吸附樹脂 天津浩聚樹脂科技有限公司;氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品、熒光素鈉、自由基產(chǎn)生劑2,2’-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽鹽酸(2,2’-azobis-2-amidinopropanedihydrochloride,AAPH)、抗氧化標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)Trolox 美國(guó)Sigma-Aldrich公司;氫氧化鈉、氯化鈉、無(wú)水乙醇、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、石油醚等均為分析純。

        1.2 儀器與設(shè)備

        T20型雙螺桿擠壓機(jī) 法國(guó)Clextral公司;HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司;PHS-25數(shù)顯臺(tái)式酸度計(jì)、DDS-11A數(shù)顯電導(dǎo)率儀 上海雷磁儀器廠;10 kD平板聚醚砜超濾膜、MSC300杯式超濾器 上海摩速科學(xué)器材有限公司;GL-21M高速冷凍離心機(jī) 湘儀離心機(jī)儀器有限公司;RE-52CS-1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;FD5冷凍干燥機(jī) 美國(guó)西盟國(guó)際集團(tuán);K-436快速消解儀、K-370自動(dòng)凱氏定氮儀 瑞士步琦有限公司;SX2-4-10箱式電阻爐 上海嘉展儀器設(shè)備有限公司;大孔吸附樹脂層析柱(2.6 cm×30 cm) 鹽城普瑞奇實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;BS-1E恒溫振蕩培養(yǎng)箱 金壇市科析儀器有限公司;BT300-2J精密蠕動(dòng)泵 保定蘭格恒流泵有限公司;DBS-160電腦自動(dòng)部分收集器 上海滬西分析儀器廠;JK-UVS-752N紫外分光光度計(jì) 上海精學(xué)科學(xué)儀器有限公司;L-8900全自動(dòng)氨基酸分析儀 日本日立公司;Synergy多動(dòng)能酶標(biāo)儀 美國(guó)Bio-Tek公司。

        1.3 方法

        1.3.1 化學(xué)組成測(cè)定

        水分含量依據(jù)GB/T 5497—1985《糧食、油料檢驗(yàn)水分測(cè)定法》進(jìn)行測(cè)定;粗脂肪含量依據(jù)GB/T 5512—2008《糧油檢驗(yàn):糧食中粗脂肪含量測(cè)定》進(jìn)行測(cè)定;粗蛋白含量依據(jù)GB/T 6432—1994《飼料中粗蛋白測(cè)定方法》進(jìn)行測(cè)定;灰分含量依據(jù)GB/T 5508—2008《糧油檢驗(yàn):灰分測(cè)定法》進(jìn)行測(cè)定;總糖含量采用苯酚-硫酸法[12]進(jìn)行測(cè)定;大豆多肽含量依據(jù)李艷等[11]的方法進(jìn)行測(cè)定。

        1.3.2 水酶法大豆粗肽的制備

        水解液作為大豆水酶法提油的副產(chǎn)物,本研究采用的酶解條件為已有研究[15-16]優(yōu)化的兼顧油脂和蛋白提取的最佳工藝,由于水解液中含有的少量油滴會(huì)影響后續(xù)對(duì)大豆多肽的超濾回收,因此對(duì)水解液進(jìn)行脫脂處理,其主要流程如下:

        大豆原料→粉碎→調(diào)節(jié)水分含量為18%→擠壓膨化(70 ℃,300 r/min)→粉碎過(guò)60 目篩→調(diào)節(jié)固液比為1∶6(mg/mL)→調(diào)節(jié)溫度為50 ℃,pH 9→酶解3 h(加酶量為1.85 mL/100 g)→滅酶(100 ℃,10 min)→離心分離(10 000 r/min,20 min)→收集水解液和乳狀液于分液漏斗中,4 ℃保存10 h→水解液→冷凍干燥→脫脂(石油醚,正己烷以固液比1∶10(g/mL)各脫脂2 次,每次1 h)→低溫脫溶→大豆酶解蛋白

        生物活性肽分子質(zhì)量一般較低,為避免未完全水解的大分子蛋白對(duì)后續(xù)純化的影響,利用10 000 D超濾膜對(duì)上述酶解蛋白復(fù)溶液(10%干物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù))在室溫條件下,壓力0.22 MPa超濾3 h,收集濾液,濃縮后冷凍干燥得到大豆粗肽。

        1.3.3 大孔吸附樹脂的預(yù)處理

        將樹脂用無(wú)水乙醇浸泡24 h,使其充分溶脹,然后用無(wú)水乙醇充分洗滌以除去上層漂浮的固體雜質(zhì)及破碎樹脂,再用去離子水洗至無(wú)乙醇味,然后分別用5% HCl溶液和2% NaOH溶液洗滌,最后用去離子水洗至中性,抽濾備用[10-11]。

        1.3.4 大孔吸附樹脂對(duì)水酶法大豆多肽的靜態(tài)吸附

        1.3.4.1 最佳吸附樹脂的篩選

        不同型號(hào)的樹脂適用于分離物質(zhì)的特性不同,為篩選出吸附水酶法大豆多肽的最佳樹脂,本實(shí)驗(yàn)選取了極性和孔徑各異的8 種樹脂,分別為:D101、DA201-C、X-5、D3520、AB-8、DM130、NKA-II、S-8,其各項(xiàng)參數(shù)列于表1。稱取上述已處理好的樹脂各2 g于250 mL具塞錐形瓶中,分別加入大豆粗肽液30 mL (10 mg/mL),將錐形瓶封好后放入恒溫?fù)u床中振蕩24 h(25 ℃,150 r/min),使樹脂與粗肽液充分接觸,振蕩結(jié)束后抽濾分離出液體,測(cè)定吸附前后粗肽液中的多肽質(zhì)量濃度,計(jì)算并比較不同型號(hào)大孔吸附樹脂對(duì)水酶法得到大豆多肽的吸附率和吸附量,計(jì)算如式(1)、(2)所示[11-12]:

        式中:C0為原溶液多肽質(zhì)量濃度/(mg/mL);C1為吸附后溶液多肽質(zhì)量濃度/(mg/mL);V0為原溶液體積/mL;M1為濕樹脂質(zhì)量/g。

        1.3.4.2 靜態(tài)吸附曲線的繪制

        向250 mL錐形瓶中加入2 g處理好的樹脂,向其中加入30 mL質(zhì)量濃度為10 mg/mL超濾后的大豆粗肽液,用塞子封好后放入恒溫?fù)u床中振蕩12 h(25 ℃,150 r/min),每隔1 h取液,測(cè)定吸附后溶液中的多肽質(zhì)量濃度、總糖含量及電導(dǎo)率值,并按公式(1)、(2)計(jì)算大豆多肽的吸附率和吸附量,繪制靜態(tài)吸附曲線。

        1.3.5 水酶法水解液中大豆多肽的動(dòng)態(tài)吸附及乙醇分級(jí)洗脫

        采用濕法裝柱將100 g處理后的大孔吸附樹脂裝入2.6 cm×30 cm層析柱中,距柱口約3~4 cm。用去離子水平衡柱子至流出液電導(dǎo)率保持不變時(shí),將質(zhì)量濃度為20 mg/mL的大豆粗肽液分別以0.5、1.5、2.5 mL/min流速上柱,并檢測(cè)流出液的多肽質(zhì)量濃度,以吸附曲線偏離基線為透過(guò)點(diǎn),確定最佳上樣體積及上樣質(zhì)量。

        上樣液被吸附后,先用去離子水洗滌層析柱,流速為2 mL/min,流出液每10 mL收集一管,測(cè)定其電導(dǎo)率值及糖含量,當(dāng)二者趨于平緩時(shí),依次用25%、50%、75%和100%體積分?jǐn)?shù)乙醇各80 mL進(jìn)行分級(jí)洗脫(流速2 mL/min),洗脫液每10 mL收集一管,測(cè)定其多肽質(zhì)量濃度,繪制動(dòng)態(tài)解吸曲線,收集各自洗脫液,濃縮冷凍干燥即得純化后的水酶法水解液中大豆多肽,并按式(3)計(jì)算多肽回收率[7,17]:

        式中:C0為原溶液中多肽質(zhì)量濃度/(mg/mL);C2為洗脫液中多肽質(zhì)量濃度/(mg/mL);V1為上樣液體積/mL;V2為洗脫液體積/mL。

        1.3.6 大豆多肽乙醇分級(jí)洗脫組分的氨基酸組成測(cè)定

        按照GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的測(cè)定》方法,利用氨基酸分析儀測(cè)定脫脂大豆粉、水酶法水解液以及各分級(jí)洗脫大豆多肽組分的氨基酸組成。

        1.3.7 ORAC值測(cè)定

        對(duì)大豆多肽的ORAC值測(cè)定參照文獻(xiàn)[18-19]的方法,并做適當(dāng)調(diào)整:在96 孔酶標(biāo)板中依次加入各大豆多肽樣品20 μL(質(zhì)量濃度為1 mg/mL,用75 mmol/L磷酸鹽緩沖液配制),同時(shí)加入不同濃度Trolox作為對(duì)照,再

        用多道移液器在每孔中加入20 μL 70 nmol/L熒光素鈉,37 ℃反應(yīng)15 min后,迅速加入140 μL 12.5 mmol/L AAPH誘發(fā)反應(yīng),并將微孔板置于酶標(biāo)儀中在37 ℃、激發(fā)波長(zhǎng)485 nm、發(fā)射波長(zhǎng)535 nm條件下進(jìn)行測(cè)定,每1 min測(cè)定一次各孔熒光強(qiáng)度,連續(xù)測(cè)定80 min。繪制各樣品熒光強(qiáng)度-時(shí)間曲線即熒光衰減曲線,采用積分法計(jì)算曲線下面積(AUC樣品)。將樣品保護(hù)面積(AUC樣品-AUC空白)與不同濃度標(biāo)準(zhǔn)物Trolox保護(hù)面積(AUCTrolox-AUC空白)相較得到ORAC值,即Trolox當(dāng)量(μmol/L)。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 水酶法水解液的化學(xué)組成

        表1 水酶法大豆水解液的主要化學(xué)組成(占干物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù))Table1 Major chemical components of soybean protein hydrolysate from aqueous enzymatic extraction of soybean oil (on a dry matter basis) %

        由表1可知,水解液中約含有11.4%干物質(zhì),其中有58.98%蛋白質(zhì)(17.34%為大豆多肽)、6.7%脂肪、26.42%碳水化合物以及7.89%灰分。這一結(jié)論與已有研究[8,20]報(bào)道的以類似工藝制得的水解液組分相似。若以1 kg大豆原料產(chǎn)生4.5 kg水解液計(jì)[20],水解液中將含有大豆中約77%的蛋白質(zhì)、16%的脂肪以及54%的糖類。經(jīng)脫脂和超濾處理后,水解液中的油脂及部分大分子蛋白被除去,蛋白質(zhì)含量有所下降但多肽含量增加近3 倍,此外,由于水解液中的可溶性碳水化合物(主要為低聚糖)和鹽類物質(zhì)可透過(guò)超濾膜,因此含量均有所增加,這些物質(zhì)的存在極大地限制了肽類產(chǎn)品在食品及保健品領(lǐng)域的應(yīng)用,需進(jìn)行進(jìn)一步純化。

        2.2 水酶法水解液中大豆多肽的靜態(tài)吸附

        2.2.1 最佳大孔吸附樹脂的篩選

        表2 不同大孔吸附樹脂對(duì)水酶法水解液中大豆多肽的吸附能力Table2 Adsorption capacities of different MARs for soybean peptides

        不同型號(hào)的樹脂對(duì)目標(biāo)物的選擇吸附性不同,本研究首先考察了8 種極性、孔徑和比表面積各異的樹脂對(duì)水酶法水解液中大豆多肽的吸附性能,結(jié)果見表2。

        由表2可知,樹脂對(duì)大豆多肽的吸附能力與其極性有關(guān),極性樹脂的吸附效果較差,如S-8吸附率僅為36.57%,而弱極性和非極性樹脂的吸附率較高,其中DA201-C的吸附率和吸附量均高于其他樹脂,分別為84.15%和62.76 mg/g,D101和D3520的吸附能力與DA201-C較接近,其次是X-5。在水酶法提油工藝中,隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng),大豆蛋白被逐漸水解,致使更多的疏水集團(tuán)暴露,它們可通過(guò)疏水相互作用吸附在樹脂的表面及孔徑中[17]。當(dāng)樹脂極性相同時(shí),樹脂的吸附能力與其比表面積密切相關(guān),如表2所示,弱極性樹脂DM130 (500~550 m2/g)的吸附率和吸附量均高于同極性的AB-8(480~520 m2/g)。因樹脂的表面張力隨比表面積增加而增大且超濾后水酶法大豆多肽分子質(zhì)量多集中于10 kD以下,因此較大比表面積的樹脂吸附效果較好,本研究中DA201-C的比表面積約是其他非極性樹脂的2 倍以上,對(duì)小分子大豆多肽有更強(qiáng)的物理吸附力,因此選擇DA201-C作為水酶法大豆多肽后續(xù)純化所用樹脂,這一結(jié)果與林利美[21]、Lu Rongrong[22]等的研究一致。

        2.2.2 靜態(tài)吸附曲線的繪制

        圖1 DA201-C大孔吸附樹脂對(duì)水酶法大豆多肽的靜態(tài)吸附曲線Fig.1 Static adsorption curves of DA201-C resin for soybean peptides

        由圖1可知,DA201-C大孔吸附樹脂對(duì)多肽的吸附屬于快速平衡型,即在最初的2 h內(nèi),吸附率迅速上升,2 h時(shí)吸附率已接近80%,而3 h之后增幅明顯趨緩,直至5 h后基本保持不變,此時(shí)樹脂對(duì)多肽的吸附已達(dá)平衡狀態(tài),吸附率和吸附量分別為84.15%和62.76 mg/g。同時(shí),從流出液中總糖含量的變化曲線可以看出,樹脂對(duì)多肽粗液中的糖有少量吸附,但遠(yuǎn)低于對(duì)多肽的吸附能力,吸附平衡時(shí),剩余溶液中仍含有原溶液60%以上的糖類物質(zhì),利用DA201-C樹脂對(duì)水酶法大豆多肽和糖類具有不同吸附能力,且對(duì)鹽類幾乎不吸附的特點(diǎn)(吸附液電導(dǎo)率幾乎不變),可以達(dá)到除去雜質(zhì)、富集大豆多肽的目的。

        2.3 水酶法水解液中大豆多肽的動(dòng)態(tài)吸附及分級(jí)洗脫

        2.3.1 大孔吸附樹脂對(duì)水酶法水解液中大豆多肽的動(dòng)態(tài)吸附

        圖2 不同流速對(duì)DA201-C大孔吸附樹脂吸附性能的影響Fig.2 Effects of sample loading volume on the adsorption capacity of DA201-C resin for soybean peptides

        樣品質(zhì)量濃度20 mg/mL,上樣流速分別為0.5、1.5、2.5 mL/min時(shí)大豆多肽的吸附透過(guò)曲線見圖2。上樣流速對(duì)樹脂的吸附性能有決定性作用,其原理主要是影響了被吸附物質(zhì)向樹脂的擴(kuò)散程度。當(dāng)樣品流速較快時(shí),被吸附物質(zhì)來(lái)不及擴(kuò)散到樹脂孔隙中就被迫流下,造成吸附量下降;而當(dāng)樣品流速較低時(shí),雖然樣品與樹脂可充分接觸,但吸附時(shí)間就會(huì)延長(zhǎng),吸附效率隨之降低[16,22-25]。因此,需綜合考慮樹脂的吸附能力和吸附效率確定最佳的上樣流速。由圖2可知,當(dāng)流速?gòu)?.5 mL/min增加到2.5 mL/min,吸附曲線斜率明顯增大,穿透點(diǎn)體積從140 mL下降到120 mL,而當(dāng)流速?gòu)?.5 mL/min增加到1.5 mL/min,穿透點(diǎn)略有下降而吸附曲線斜率幾乎保持不變,此時(shí)加快流速可縮短生產(chǎn)周期,因此選擇1.5 mL/min為最佳上樣流速,此時(shí)上樣體積和上樣質(zhì)量分別為140 mL和2 800 mg。

        2.3.2 大孔吸附樹脂對(duì)水酶法大豆多肽的分級(jí)洗脫

        粗肽液經(jīng)吸附平衡后,先用去離子水洗滌層析柱以洗去與樹脂結(jié)合較弱的無(wú)機(jī)鹽和糖類物質(zhì),當(dāng)流出液電導(dǎo)率近似于初始數(shù)值時(shí),依次用體積分?jǐn)?shù)為25%、50%、75%和100%的乙醇溶液各80 mL進(jìn)行洗脫(流速2 mL/min)。圖3為DA201-C大孔吸附樹脂對(duì)水酶法大豆多肽的動(dòng)態(tài)解吸過(guò)程中洗脫液電導(dǎo)率、糖含量和多肽質(zhì)量濃度隨洗脫體積的變化曲線。

        圖3 DA201-C大孔吸附樹脂對(duì)水酶法大豆多肽的動(dòng)態(tài)解吸曲線Fig.3 Dynamic desorption curves of DA201-C resin for soybean peptides

        由圖3可知,最初流出液的電導(dǎo)率和糖含量隨著水洗的進(jìn)行而逐漸增大,約在30 mL和50 mL體積處達(dá)到峰值,當(dāng)水洗體積超過(guò)350 mL后二者趨于穩(wěn)定,說(shuō)明此時(shí)層析柱中可被脫除的鹽類和糖類物質(zhì)已基本流出,因此可確定水洗體積為350 mL。然后換做不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液對(duì)大豆多肽進(jìn)行分級(jí)洗脫,可被分離成SP-DA25、SP-DA50、SP-DA75、SP-DA100共4 個(gè)組分,各組分多肽回收率分別為14.14%、20.81%、39.20%和21.50%(表3),大豆多肽總回收率為95.65%,樹脂吸附量為13.32 mg/g。因動(dòng)態(tài)吸附時(shí)多肽粗液與樹脂的接觸時(shí)間較短,因此此時(shí)吸附量也低于靜態(tài)吸附時(shí)的吸附量。

        2.4 水酶法大豆多肽純化效果分析

        根據(jù)上述純化實(shí)驗(yàn)結(jié)果,確定水酶法大豆多肽的純化工藝條件為:上樣體積140 mL(上樣質(zhì)量2 800 mg)、流速1.5 mL/min、水洗體積350 mL,25%、50%、75%、100%乙醇溶液依次洗脫,每次80 mL,流速為2 mL/min。在該條件下對(duì)大豆粗肽液進(jìn)行吸附,分別收集洗脫液經(jīng)真空旋蒸濃縮和冷凍干燥后得到水酶法大豆多肽組分,其化學(xué)組成見表3。

        表3 DA201-C大孔吸附樹脂對(duì)水酶法大豆多肽的純化效果Table3 Purification of soybean peptides using DA201-C resin

        大孔吸附樹脂與被吸附物質(zhì)間主要為疏水相互作用且作用力較弱,解吸劑乙醇的加入可改變體系的親水-疏水平衡,引起多肽或雜質(zhì)組分的吸附或解吸[21,26-27],因此可根據(jù)乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)大豆多肽進(jìn)行分級(jí)洗脫。由表3可知,隨著解吸劑乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加,大豆多肽組分的純度隨之上升,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%時(shí),純化效果最優(yōu),其多肽含量增加了36.31%,糖含量和灰分含量分別降低了65.81%和98.21%,這一結(jié)果與李華等[7]的研究報(bào)道一致。且不論在哪一種洗脫劑體積分?jǐn)?shù)條件下,多肽組分純度均在80%以上,脫鹽率和脫糖率分別在90%和51%以上,說(shuō)明采用DA201-C大孔吸附樹脂對(duì)樣品中的鹽類、糖類等雜質(zhì)成分有顯著的去除效果,可有效達(dá)到富集純化的目的。

        2.5 大豆多肽組分的ORAC值

        圖4 Trolox(a)及大豆多肽洗脫組分(b)的熒光衰變曲線Fig.4 Fluorescence decay curves of Trolox at different concentrations and soybean peptide fractions

        由圖4a可知,隨著Trolox濃度的增加,達(dá)到熒光衰變曲線的時(shí)間從0 μmol/L的35 min增加至80 μmol/L的73 min,且熒光衰變曲線下的面積隨著Trolox濃度的增加而增大,Trolox濃度與熒光衰變曲線下的保護(hù)面積間的關(guān)系可用線性方程:y=5 360x+17 933(R2=0.993 0)表示。由圖4b可知,不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫組分的抗氧化活性有所不同,其中SP-DA25及SP-DA50組分ORAC值較低,分別為51.05 μmol/L和58.58 μmol/L,其次是SP-DA100組分為63.96 μmol/L,75%乙醇溶液洗脫組分SP-DA75的ORAC值最高,為72.81μmol/L,較純化前提高了200%,說(shuō)明經(jīng)大孔吸附樹脂純化后大豆多肽的抗氧化性有顯著提升。

        2.6 水酶法水解液中大豆多肽的氨基酸組成分析

        根據(jù)上述純化工藝,對(duì)所得的大豆多肽組分進(jìn)行氨基酸組成分析,并與水酶法水解液的氨基酸組成進(jìn)行對(duì)比,結(jié)果見表4。

        表4 水酶法大豆多肽組分的氨基酸組成Table4 Amino acid composition and ORAC of soybean peptide fractions

        氨基酸組成是評(píng)定蛋白及多肽營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)之一[24],尤其對(duì)于肽類物質(zhì)而言,其氨基酸的組成、數(shù)量及序列直接決定了其特有的生物活性[25]。由表4可知,水酶法水解液中氨基酸的分布與大豆原料相似,除甲硫氨酸(大豆的第一限制氨基酸)含量稍低外,含有其余8 種必需及半必需氨基酸(色氨酸除外)。Latif等[24]研究發(fā)現(xiàn)水酶法花生水解液中必需氨基酸的含量較溶劑提取和冷榨后粕中必需氨基酸的含量高,說(shuō)明酶解的溫和作用,對(duì)大豆蛋白的破壞較少。經(jīng)過(guò)大孔吸附樹脂的純化作用,水酶法大豆多肽中各氨基酸百分含量普遍有所提升,且隨著洗脫乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加,大豆多肽組分中疏水性氨基酸的含量呈顯著上升趨勢(shì),75%乙醇溶液洗脫時(shí)含量最高,說(shuō)明DA201-C大孔吸附樹脂可通過(guò)疏水性強(qiáng)弱利用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇對(duì)大豆多肽進(jìn)行分離。張曉梅等[25]通過(guò)乙醇體積分?jǐn)?shù)變化分離大豆降膽固醇肽,結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)各分離組分具有疏水性差異且75%體積分?jǐn)?shù)組分疏水性最高。

        比較圖4b可知,隨著大豆多肽組分疏水性的增加,對(duì)氧自由基的淬滅能力呈上升趨勢(shì),75%體積分?jǐn)?shù)時(shí)達(dá)到最高,說(shuō)明肽鏈中疏水性組分的存在與其抗氧化活性有一定關(guān)聯(lián);李華等[7]在對(duì)黑豆肽抗氧化性與其氨基酸組成的關(guān)系研究中也發(fā)現(xiàn)隨著組分疏水性的增加,其自由基清除能力總體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。與此同時(shí),75%及100%洗脫組分中含有較多的谷氨酸(16.48%、16.19%)和天冬氨酸(9.35%、9.16%),該兩種為酸性氨基酸,可作為質(zhì)子供體發(fā)揮抗氧化作用,如Jiang[26]、Najafian[27]、Plundrich[28]、程云輝[29]等均報(bào)道了含有酸性氨基酸的抗氧化肽。以上是從氨基酸組成出發(fā)探討不同種類的氨基酸對(duì)水酶法大豆多肽抗氧化活性的貢獻(xiàn),肽的活性同樣與其氨基酸序列、電荷性質(zhì)、分子結(jié)構(gòu)密切相關(guān),這些均需要進(jìn)一步分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定以及體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

        3 結(jié) 論

        水解液作為水酶法工藝的主要副產(chǎn)物之一,含有大豆中絕大多數(shù)的可溶性成分,僅作為廢棄物會(huì)造成大豆蛋白資源的巨大浪費(fèi),尤其是其中含有的低分子肽類,可作為功能性食品添加劑、保健食品的原料來(lái)源,具有可觀的開發(fā)前景。本研究采用大孔吸附樹脂對(duì)水酶法水解液中的大豆多肽進(jìn)行吸附純化處理:通過(guò)靜態(tài)吸附試驗(yàn)確定DA201-C大孔吸附樹脂對(duì)大豆多肽的吸附能力優(yōu)于其他7種樹脂,其吸附率和吸附量分別為84.15%和62.76 mg/g;通過(guò)動(dòng)態(tài)吸附及分級(jí)洗脫實(shí)驗(yàn),確定純化最佳工藝為:上樣體積140 mL(上樣質(zhì)量2 800 mg)、上樣流速1.5 mL/min、水洗體積350 mL,25%、50%、75%、100%乙醇溶液各80 mL分級(jí)洗脫,流速2 mL/min。經(jīng)純化后各大豆多肽組分純度均在80%以上,總回收率

        為95.65%,樹脂吸附量為13.32 mg/g,糖類及鹽類雜質(zhì)顯著減少;乙醇分級(jí)洗脫可分離4 個(gè)大豆多肽組分,其中75%體積分?jǐn)?shù)組分SP-DA75的ORAC值最強(qiáng),肽段的抗氧化性與其疏水性氨基酸含量及酸性氨基酸含量有一定關(guān)聯(lián)。DA201-C大孔吸附樹脂綜合性能較好,能有效脫除大豆多肽中的鹽分等雜質(zhì)成分,可作為一種純化水酶法大豆多肽的有效方法,為后續(xù)進(jìn)一步分離純化、活性鑒定及工業(yè)化生產(chǎn)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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        Purification and Amino Acid Composition of Peptides from Soybean Byproduct Protein Hydrolysate from Aqueous Enzymatic Extraction of Soybean Oil

        ZHANG Qiaozhi, BI Shuang, MA Wenjun, LI Yang, SUI Xiaonan, JIANG Lianzhou*
        (School of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

        In this paper, the adsorption performances and purification efficiencies of 8 macroporous adsorption resins (MARs) for peptides from soybean byproduct protein hydrolysate from aqueous enzymatic extraction of soybean oil were comparatively evaluated by static adsorption and desorption experiments in order to find the best one among these MARs. Further, the effects of feeding volume, feeding rate and desorbent concentration on the purification efficiency of MARs were investigated. Results showed that DA201-C resin had the highest adsorption capability for soybean peptides among 8 resins tested. The optimum dynamic adsorption conditions of DA201-C resin were determined as follows: sample loading volume, 140 mL; feeding flow rate, 1.5 mL/min; 350 mL of water as washing solvent; and fractional elution with 25%, 50%, 75% and 100% using 80 mL of each concentration gradient at 2 mL/min flow rate. Under these conditions, the purity of the purified soybean peptides reached above 80% with a total recovery of 95.65% and a removal rate of more than 90% and 51% for salt and sugar impurities, respectively, and the adsorption capacity of DA201-C resin was 13.32 mg/g. Four soybean peptide fractions were separated by fractional elution with ethanol. A fraction eluted with 75% ethanol, SP-DA75, showed the highest oxygen radical adsorption capacity (ORAC) among the four fractions. Moreover, there was a correlation between antioxidant activities of peptide fragments and their contents of hydrophobic amino acids and acidic amino acids. In conclusion, DA201-C resin exhibited excellent adsorption performance and could be applied as an effective method to purify soybean peptides.

        aqueous enzymatic extraction; soybean peptide; macroporous adsorption resin; purification; amino acid composition

        10.7506/spkx1002-6630-201622016

        TS229

        A

        1002-6630(2016)22-0112-07

        張巧智, 畢爽, 馬文君, 等. 水酶法水解液中大豆多肽的吸附純化及其氨基酸組成分析[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(22): 112-118. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201622016. http://www.spkx.net.cn

        ZHANG Qiaozhi, BI Shuang, MA Wenjun, et al. Purification and amino acid composition of peptides from soybean byproduct protein hydrolysate from aqueous enzymatic extraction of soybean oil[J]. Food Science, 2016, 37(22): 112-118. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201622016. http://www.spkx.net.cn

        2016-02-29

        “十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2014BAD22B00);國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)項(xiàng)目(2013AA102101);黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(ZD201302);高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金項(xiàng)目(20132325110013)

        張巧智(1990—),女,博士研究生,研究方向?yàn)榧Z食、油脂及植物蛋白工程。E-mail:miumiulovelife@163.com

        *通信作者:江連洲(1960—),男,教授,博士,研究方向?yàn)榧Z食、油脂及植物蛋白工程。E-mail:jlzname@163.com

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