湯花梅，魏婷，張超，劉玉倩，汪艷，張曉華，袁麗，戴和平,*

1.中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所 淡水生態(tài)和生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430072

2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

應(yīng)用超敏感酵母HUG1-yEGFP生物傳感器篩選基因毒性化合物

湯花梅1,2，魏婷1,2，張超1,2，劉玉倩1,2，汪艷1，張曉華1，袁麗1，戴和平1,*

1.中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所 淡水生態(tài)和生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430072

2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

為了擴(kuò)展本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的響應(yīng)于DNA損傷信號(hào)的超敏感酵母HUG1-yEGFP生物傳感器的檢測(cè)范圍并積累參考數(shù)據(jù),為實(shí)際應(yīng)用打下實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),本研究對(duì)26種與環(huán)境及人類生活息息相關(guān)的化合物的基因毒性進(jìn)行了檢測(cè),篩選出8種具有基因毒性的化合物,并將其結(jié)果與現(xiàn)有微生物檢測(cè)系統(tǒng)的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了對(duì)比。結(jié)果顯示,超敏感酵母HUG1-yEGFP生物傳感器的檢測(cè)結(jié)果與以細(xì)菌為宿主細(xì)胞的Ames試驗(yàn)或SOS顯色法的檢測(cè)結(jié)果的吻合度高于50%,與以酵母為宿主細(xì)胞的GSA檢測(cè)系統(tǒng)的檢測(cè)結(jié)果的吻合度高于85%。以真核生物酵母為宿主的檢測(cè)系統(tǒng)與以原核生物細(xì)胞為宿主的檢測(cè)系統(tǒng)的結(jié)果的差異反映了它們抗脅迫機(jī)制的不同。本研究應(yīng)用超敏感酵母HUG1-yEGFP生物傳感器特異性檢測(cè)出3種化合物為基因毒性陽性,這3種化合物是代森錳鋅、孔雀石綠及丙烯酰胺,均被報(bào)道具有潛在致癌性。本研究結(jié)果表明,超敏感酵母HUG1-yEGFP生物傳感器可以有效地對(duì)環(huán)境污染有關(guān)的基因毒性化合物進(jìn)行檢測(cè),可以作為其他現(xiàn)有檢測(cè)系統(tǒng)的補(bǔ)充,應(yīng)用于環(huán)境化學(xué)污染的健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)。

環(huán)境污染；酵母；生物傳感器；基因毒性；健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)

癌癥已成為世界范圍的頭號(hào)殺手,中國(guó)的癌癥發(fā)生情況也不容樂觀。癌癥的發(fā)生在不同地域、年齡及性別之間的分布表明癌癥的發(fā)生與生活方式及環(huán)境因素具有密切的關(guān)系[1-3]。作用于有機(jī)體,直接或間接地造成DNA損傷,進(jìn)而導(dǎo)致基因突變,促進(jìn)腫瘤的發(fā)展,并造成毒性作用的環(huán)境化學(xué)因子稱為基因毒性化合物[4]。大部分基因毒性化合物都有可能引起DNA損傷的發(fā)生,因此以DNA損傷響應(yīng)為生物標(biāo)志物可以有效地檢測(cè)和鑒定環(huán)境中的基因毒性化合物,不僅能對(duì)環(huán)境中毒性化合物進(jìn)行定性及定量分析,更能反映出不同毒性化合物在分子水平對(duì)生物造成的毒性效應(yīng)[5],對(duì)人類健康-環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估具有重要意義。

現(xiàn)有的基因毒性化合物微生物檢測(cè)手段有鼠傷寒沙門氏菌致突變型實(shí)驗(yàn)(Ames test)[6],大腸桿菌SOS顯色法[7]及已商業(yè)化使用的酵母RAD54-GFP遺傳毒性檢測(cè)系統(tǒng)GreenScreen Assay(GSA)[8]。對(duì)比細(xì)菌,以酵母為模式生物的檢測(cè)系統(tǒng)更具有優(yōu)勢(shì),因?yàn)榻湍缸鳛橐环N簡(jiǎn)單的單細(xì)胞真核微生物,不僅易于培養(yǎng)、生長(zhǎng)迅速,操作簡(jiǎn)便,在基因水平上易于改造,同時(shí),作為第一種完成全基因組測(cè)序的真核生物,釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中6 000多個(gè)基因序列信息中,約有23%與人類基因具有同源性[9]。

圖1 HUG1-yEGFP生物傳感器檢測(cè)基因毒性化合物原理示意圖[11]注:在正常情況下,酵母中HUG1的表達(dá)水平較低,主要受結(jié)合在HUG1基因啟動(dòng)子上的負(fù)調(diào)控因子Crt1的阻遏,當(dāng)暴露于基因毒性化合物時(shí),Crt1被磷酸化,然后被蛋白酶水解,HUG1啟動(dòng)子去阻遏,使與之融合的報(bào)告基因yEGFP得以表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物的熒光信號(hào)可以用熒光定量酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。Fig.1 The principle ofHUG1-yEGFPBiosensor for detecting genetic toxicity of compound[11]Note:Under normal condition,the negative regulatory factor Crt1 bounds to the promoter ofHUG1and leads to low-level expression of HUG1 in yeast.When exposed to genotoxic compounds,the Crt1 would be phosphorylated and then hydrolyzed by protease with the derepression of the HUG1 promoter and expression of the infused yEGFP.The fluorescence intensity of the expressed yEGFP will be detected by Multiscan spectrum or flow cytometer.

我們實(shí)驗(yàn)室將響應(yīng)于DNA損傷信號(hào)的HUG1-yEGFP生物傳感器元件轉(zhuǎn)入七基因缺失酵母突變株內(nèi),并將該元件同源重組到酵母基因組上,建立了穩(wěn)定的超敏感酵母HUG1-yEGFP生物傳感器[10],檢測(cè)原理如圖1。HUG1基因由復(fù)制阻滯及DNA損傷試劑誘導(dǎo)高表達(dá)[11],Meurisse等[12]發(fā)現(xiàn)HUG1能結(jié)合Rnr2亞基,并推測(cè)其參與負(fù)反饋調(diào)節(jié)核糖核苷酸還原酶(RNR)活性?；蚨拘曰衔锟梢哉T導(dǎo)HUG1-yEGFP元件中的報(bào)告基因綠色熒光蛋白的表達(dá),其劑量效應(yīng)可通過熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀對(duì)酵母細(xì)胞的熒光強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)定。與現(xiàn)有的檢測(cè)方法相比較,超敏感HUG1-yEGFP檢測(cè)系統(tǒng)不僅能定性并定量檢測(cè)基因毒性化合物,且對(duì)多種化合物,尤其是在對(duì)氧化試劑,如叔丁基過氧化氫(t-BHP)一類的化合物的DNA損傷效應(yīng)的檢測(cè)更靈敏。在提高靈敏度的同時(shí),該檢測(cè)系統(tǒng)的特異性更強(qiáng),如在GSA試驗(yàn)中表現(xiàn)為假陽性的氯霉素,對(duì)超敏感酵母HUG1-yEGFP生物傳感器并無誘導(dǎo)作用[10]。

由于本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的超敏感酵母HUG1-yEGFP生物傳感器是一種新型檢測(cè)系統(tǒng),需要擴(kuò)大其對(duì)化合物的種類和范圍的檢測(cè),也需要積累檢測(cè)數(shù)據(jù)作為進(jìn)一步優(yōu)化的參考,為其實(shí)際應(yīng)用和推廣建立實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。因此,本研究利用超敏感酵母HUG1-yEGFP生物傳感器,在原來已檢測(cè)的典型基因毒性化合物的基礎(chǔ)上,又檢測(cè)了26種在生產(chǎn)生活中被人類大量使用的化合物,包括4種農(nóng)藥、5種工業(yè)原料殺菌劑、2種實(shí)驗(yàn)室試劑、2種涉及食品安全的試劑、12種重金屬鹽及1種抗癌藥物,其中8種化合物檢測(cè)為基因毒性陽性化合物。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 菌株

超敏感酵母HUG1-yEGFP生物傳感器菌株WXY30095-genome-HUG1-yEGFP由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建[10],是將HUG1-yEGFP報(bào)告元件整合到七基因缺失酵母突變株:WXY30095(snq2△::KanMX,pdr5△::LEU2,cwp1△::hisG,cwp2△::HIS3,yap1△:: hisG,rad1△::hisG,mag1△::hisG)。

1.2 培養(yǎng)基和溶液

YPD培養(yǎng)基:1%酵母提取物,2%蛋白胨,2%葡萄糖；固體培養(yǎng)基另加2%瓊脂。

SD-Ura培養(yǎng)基(每升含量):酵母膽堿(無氨基酸)1.7 g,硫酸銨5 g,葡萄糖20 g,腺嘌呤20mg,甲硫氨酸20mg,色氨酸20mg,組氨酸20mg,亮氨酸30mg,賴氨酸30mg,纈氨酸30mg。

10×PBS緩沖液 ∶氯化鈉80 g,氯化鉀1 g,十二水合磷酸氫二鈉36.8 g,磷酸二氫鉀2.4 g,溶于雙蒸水中,用NaOH調(diào)節(jié)pH值為7.4,定容至1 L,使用時(shí)用雙蒸水稀釋成1×PBS且需高壓滅菌。

1.3 化學(xué)試劑

代森錳鋅、樂果、馬來酰肼、2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)、2-氨基-4-硝基苯酚、8-羥基喹啉、兒茶酚、DEHP (太酸二丁酯)、EB(溴化乙啶)均購(gòu)自Sigma-Aldrich公司,均為優(yōu)級(jí)純。丙烯酰胺(acrylamide)購(gòu)自生工生物工程有限公司,NaAsO3、Pb(CH3COO)2、Pb(NO3)2購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,亞硝酸鈉購(gòu)自湖北大學(xué)化工廠,孔雀石綠購(gòu)自上海標(biāo)本模型廠,MnCl2購(gòu)自金山縣興塔化工廠,ZnSO4購(gòu)自北京化工廠,BaCl2購(gòu)自成都化學(xué)試劑廠,V2O5購(gòu)自上海試劑總廠第三分廠, CuSO4購(gòu)自武漢市東方紅化工廠,CdCl2購(gòu)自重慶東方試劑廠,CoCl2購(gòu)自廣東臺(tái)山化工廠,K2Cr2O7購(gòu)自上海浦江化工廠,NiCl2購(gòu)自北碚化學(xué)試劑廠,環(huán)磷酰胺購(gòu)自百特國(guó)際有限公司,以上試劑均為化學(xué)純。蓬灰購(gòu)自甘肅力司食品科技有限公司。

1.4 酵母菌株復(fù)蘇和培養(yǎng)

取-70℃保存的酵母菌株WXY30095-genome-HUG1-yEGFP接種在YPD固體培養(yǎng)基平皿上,于30℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2 d。

1.5 DNA損傷試劑暴露實(shí)驗(yàn)

用新鮮的酵母培養(yǎng)基將過夜培養(yǎng)酵母細(xì)胞稀釋至OD600nm為0.1,將稀釋后的酵母菌液轉(zhuǎn)移至24孔板中,每孔1 mL菌液。按設(shè)置的藥物濃度梯度加藥后,置于恒溫?fù)u床中30℃、200 r·min-1暴露8 h或12 h。然后吸取每孔中的1 mL菌液經(jīng)6 000 r·min-1離心2 min后去上清,加無菌的PBS磷酸緩沖液重懸菌液,再經(jīng)6 000 r·min-1離心去上清后重懸于1 mL無菌的PBS磷酸緩沖液中。每孔200μL分裝菌液至96孔板透明底黑色孔板內(nèi)。若用于流式細(xì)胞儀檢測(cè),則加入PI染色30 min,以區(qū)分活細(xì)胞與死細(xì)胞。

1.6 熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀檢測(cè)綠色熒光蛋白GFP的表達(dá)

按照劉玉倩等[13]和Wei等[10]的方法,用熒光酶標(biāo)儀和流式細(xì)胞儀檢測(cè)綠色熒光蛋白的表達(dá)量。熒光酶標(biāo)儀用SpectraMax M5多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)酵母細(xì)胞濃度OD600nm值和相對(duì)熒光強(qiáng)度值(激發(fā)光波長(zhǎng)488 nm、發(fā)射波長(zhǎng)520 nm)。

Becton Dickinson FACS Aria TMⅢ高速分選型流式細(xì)胞儀檢測(cè)活細(xì)胞yEGFP綠色熒光蛋白相對(duì)表達(dá)量。PI信號(hào)由PE-A(激發(fā)光波長(zhǎng)488 nm、發(fā)射光波長(zhǎng)575 nm),yEGFP信號(hào)由FITC通道收集(激發(fā)光波長(zhǎng)488 nm、發(fā)射光波長(zhǎng)525 nm)。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

1.7.1 酶標(biāo)儀檢測(cè)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

Microsoft Excel 2007軟件統(tǒng)計(jì)并計(jì)算熒光強(qiáng)度平均值來定量yEGFP的表達(dá),并取3次平行實(shí)驗(yàn)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。相對(duì)熒光強(qiáng)度AU為任意單位(arbitrary unit),AU/OD600nm為每單位酵母細(xì)胞的平均相對(duì)熒光強(qiáng)度。

1.7.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

流式細(xì)胞儀收集樣品10 000個(gè)細(xì)胞熒光表達(dá)量,FlowJo軟件計(jì)算樣品中PI陰性細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度。熒光誘導(dǎo)倍數(shù)(fold induction)=暴露組單位酵母細(xì)胞相對(duì)熒光強(qiáng)度平均值/對(duì)照組相對(duì)熒光強(qiáng)度平均值,酶標(biāo)儀檢測(cè)數(shù)據(jù)設(shè)定遺傳毒性閾值為1.6倍,流式細(xì)胞儀檢測(cè)數(shù)據(jù)設(shè)定遺傳毒性閾值為2倍(細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度增加了60%或100%),即當(dāng)檢測(cè)系統(tǒng)暴露于某一濃度的遺傳毒性化合物中時(shí),產(chǎn)生的yEGFP單位酵母細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度值與對(duì)照組結(jié)果相比,熒光誘導(dǎo)倍數(shù)＞1.6或2則可認(rèn)為是陽性遺傳毒性效應(yīng),利用graphpad軟件作圖。

2 結(jié)果(Results)

2.1 基因毒性化合物對(duì)超敏感酵母HUG1-yEGFP生物傳感器細(xì)胞毒性的檢測(cè)

應(yīng)用超敏感酵母HUG1-yEGFP生物傳感器對(duì)26種化合物的基因毒性進(jìn)行檢測(cè),經(jīng)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,共有8種化合物具有基因毒性,即暴露后,酵母細(xì)胞表達(dá)yEGFP熒光強(qiáng)度為酶標(biāo)儀檢測(cè)的陰性對(duì)照組的1.6倍以上或流式細(xì)胞儀檢測(cè)的陰性對(duì)照組的2倍以上。這8種化合物分別為:代森錳鋅、2-氨基-4硝基苯酚、8-羥基喹啉、兒茶酚、EB、丙烯酰胺、孔雀石綠、NiCl2。為了了解各種基因毒性化合物在致酵母 DNA損傷時(shí),都會(huì)對(duì)含有超敏感酵母HUG1-yEGFP生物傳感器元件的酵母細(xì)胞產(chǎn)生不同程度的細(xì)胞毒性,我們通過對(duì)酵母細(xì)胞生長(zhǎng)速度的檢測(cè),了解各種基因毒性化合物的細(xì)胞毒性。圖2是對(duì)酵母菌液生長(zhǎng)情況的統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果顯示各化合物在不同暴露濃度時(shí)對(duì)酵母細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制,反映了各種化合物濃度對(duì)酵母的細(xì)胞毒性效應(yīng)。

2.2 基因毒性化合物誘導(dǎo)超敏感酵母HUG1-yEGFP生物傳感器熒光蛋白表達(dá)的劑效關(guān)系檢測(cè)

將這8種化合物誘導(dǎo)超敏感HUG1-EGFP生物傳感器的熒光蛋白表達(dá)的劑效關(guān)系進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果如圖3所示,勻表現(xiàn)出良好的劑效關(guān)系。其中,兒茶酚暴露劑量為400μg·mL-1時(shí),熒光蛋白表達(dá)量誘導(dǎo)倍數(shù)最高,為10.07倍。最大熒光誘導(dǎo)倍數(shù)最低的藥品為EB,誘導(dǎo)倍數(shù)為2倍。對(duì)比圖2的相關(guān)細(xì)胞毒性的數(shù)據(jù),我們發(fā)現(xiàn),致DNA損傷的有效誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)的最低暴露劑量所對(duì)應(yīng)的細(xì)胞毒性均小于半致死量。

圖2 基因毒性化合物對(duì)超敏感酵母HUG1-yEGFP生物傳感器細(xì)胞毒性的劑效關(guān)系注:不同填充圖案的條柱代表不同的藥物組處理。每一藥物組處理濃度從左至右依次增加,各處理組藥物濃度分別為:代森錳鋅(0、1、2、4、8、16μg·mL-1)；2-氨基-4硝基苯酚(0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6mg·mL-1)；8-羥基喹啉(0、20、40、80、160、320μg·mL-1)；兒茶酚(0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6mg·mL-1)；溴化乙啶(EB)(0、1、2、4、8、16μg·mL-1)；丙烯酰胺(0、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8mg·mL-1)；NiCl2(0、0.03、0.06、0.12、0.24、0.48mg·mL-1)；孔雀石綠(0、12.5、25、50、100、200μg·mL-1)。Fig.2 Dose-effect relationship between genotoxic compounds and cell growth rate ofHUG1-yEGFPbiosensorNote:Columns with different filling pattern represent different drug groups.The drug concentrations in each group increase from left to right in turn and the concentrations are as follows:mancozeb(0,1,2,4,8,16μg·mL-1);2-amino-4-nitrophenol(0,0.1,0.2,0.4,0.8,1.6mg·mL-1);8-hydroxyquinoline(0,20,40,80,160,320μg·mL-1);catechol(0,0.1,0.2,0.4,0.8,1.6mg·mL-1);EB(0,1,2,4,8,16μg·mL-1);acrylamide(0,0.8, 1.6,3.2,6.4,12.8mg·mL-1);NiCl2(0,0.03,0.06,0.12,0.24,0.48mg·mL-1);malachite green(0,12.5,25,50,100,200μg·mL-1).

表1 超敏感酵母HUG1-yEGFP生物傳感器各化合物基因毒性的檢測(cè)及與其他3種檢測(cè)系統(tǒng)結(jié)果的比較Table 1 Genotoxicity of chemical compounds tested byHUG1-yEGFPbiosensor and comparison with three other tests

圖3 基因毒性化合物誘導(dǎo)超敏感HUG1-EGFP生物傳感器的熒光蛋白表達(dá)的劑效關(guān)系注:不同填充圖案的條柱代表不同的藥物組處理。每一藥物組處理濃度從左至右依次增加,各處理組藥物濃度分別為:代森錳鋅(0、1、2、4、8、16μg·mL-1)；2-氨基-4硝基苯酚(0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6mg·mL-1)；8-羥基喹啉(0、20、40、80、160、320μg·mL-1)；兒茶酚(0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6mg·mL-1)；EB(0、1、2、4、8、16μg·mL-1)；丙烯酰胺(0、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8mg·mL-1)；NiCl2(0、0.03、0.06、0.12、0.24、0.48mg·mL-1)；孔雀石綠(0、12.5、25、50、100、200μg·mL-1)。Fig.3 Dose-effect relationship between genotoxic compounds and induced expression of green fluorensence protein ofHUG1-yEGFPbiosensorNote:Columns with different filling pattern represent different drug groups.The drug concentrations in each group increase from left to right in turn and the concentrations are as follows:mancozeb(0,1,2,4,8,16μg·mL-1);2-amino-4-nitrophenol(0,0.1,0.2,0.4,0.8,1.6mg·mL-1);8-hydroxyquinoline(0,20,40,80,160,320μg·mL-1);catechol(0,0.1,0.2,0.4,0.8,1.6mg·mL-1);EB(0,1,2,4,8,16μg·mL-1);acrylamide(0,0.8,1.6,3.2,6.4, 12.8mg·mL-1);NiCl2(0,0.03,0.06,0.12,0.24,0.48mg·mL-1);malachite green(0,12.5,25,50,100,200μg·mL-1).

2.3 超敏感酵母HUG1-yEGFP生物傳感器篩選基因毒性化合物與其他微生物檢測(cè)系統(tǒng)的比較

將本次研究結(jié)果與現(xiàn)有微生物檢測(cè)系統(tǒng)的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了對(duì)比,如表1所示,本次研究中共有23種化合物在現(xiàn)有的檢測(cè)系統(tǒng)中測(cè)試過,與Ames試驗(yàn)測(cè)試化合物重疊的種類有19種,所得結(jié)果一致的藥品有10種,其中4種呈陽性的化合物分別為2-氨基-4-硝基苯酚、8-羥基喹啉、兒茶酚、EB,6種呈陰性的化合物分別為馬來酰肼、DEHP、V2O5、Pb(CH3COO)2、CuSO4、CdCl2；與SOS毒性試驗(yàn)相比較,重疊的藥物有17種,其中試驗(yàn)結(jié)果一致的有12種,但只有EB為基因毒性陽性藥物；與GSA試驗(yàn)相比較,檢測(cè)重疊的藥物有7種,其中只有8-羥基喹啉的檢測(cè)結(jié)果不一致,檢測(cè)同為基因毒性陽性的藥物分別為2-氨基-4硝基苯酚、兒茶酚、EB及鎳離子。與現(xiàn)有檢測(cè)系統(tǒng)結(jié)果重疊但檢測(cè)結(jié)果不一致的化合物是NaNO2、孔雀石綠、K2Cr2O7。另有3種化合物沒有查到被其他3種檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)的數(shù)據(jù),這些化合物是代森錳鋅、2,4-D、蓬灰。

3 討論(Discussion)

為了擴(kuò)展本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的超敏感HUG1-yEGFP生物傳感器的檢測(cè)范圍并積累參考數(shù)據(jù),為實(shí)際應(yīng)用打下實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),我們對(duì)26種與環(huán)境及人類生活息息相關(guān)的化合物的基因毒性進(jìn)行了檢測(cè),篩選出8種具有基因毒性的化合物,并將其結(jié)果與現(xiàn)有微生物檢測(cè)系統(tǒng)的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了對(duì)比。

本研究結(jié)果對(duì)比于現(xiàn)有的Ames實(shí)驗(yàn)、SOS顯色試驗(yàn)及GSA實(shí)驗(yàn),其中與Ames試驗(yàn)測(cè)試藥品重疊的種類有19種,所得結(jié)果一致的藥品有10種,結(jié)果吻合度為52.63%；與SOS顯色試驗(yàn)相比較,重疊的藥物有17種,其中試驗(yàn)結(jié)果一致的有12種,吻合度為70.59%,但只有EB為基因毒性陽性；與GSA試驗(yàn)相比較,檢測(cè)重疊的藥物有7種,其中6種的檢測(cè)結(jié)果一致,吻合度為85.71%。綜上,本研究結(jié)果更接近于GSA試驗(yàn),其原因可能與二者都是基于釀酒酵母響應(yīng)于DNA損傷高表達(dá)基因所建立的報(bào)告系統(tǒng)有關(guān)。同時(shí)EB在以上幾種檢測(cè)系統(tǒng)中均為陽性,但以細(xì)菌為模式生物的Ames試驗(yàn)及SOS試驗(yàn)需S9處理,而酵母為模式生物的超敏感酵母HUG1-yEGFP生物傳感器及GSA檢測(cè)系統(tǒng)不需要對(duì)受試化合物進(jìn)行代謝活化,推測(cè)釀酒酵母中存在可對(duì)EB進(jìn)行代謝活化的酶。

造成本研究檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)某些化合物檢測(cè)的結(jié)果與現(xiàn)有檢測(cè)系統(tǒng)不一致的原因,可能與各種檢測(cè)系統(tǒng)所基于的檢測(cè)原理及不同檢測(cè)系統(tǒng)宿主細(xì)胞的差異相關(guān)聯(lián)。Ames實(shí)驗(yàn)和SOS試驗(yàn)的宿主細(xì)胞都是原核生物細(xì)菌,Ames實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的是細(xì)胞回復(fù)突變率,是以細(xì)胞整體形態(tài)為檢測(cè)指標(biāo),而SOS顯色試驗(yàn)基于大腸桿菌損傷快速應(yīng)答機(jī)制,將報(bào)告基因LacZ與SOS基因(如SfiA)啟動(dòng)子融合,檢測(cè)大腸桿菌與底物X-gal顯色反應(yīng),是以單個(gè)分子的響應(yīng)表達(dá)水平來定性及定量基因毒性化合物[15],所以它們之間的檢測(cè)結(jié)果的差異主要是因?yàn)闄z測(cè)原理的差異。而 GSA實(shí)驗(yàn)是基于 DNA損傷響應(yīng)基因RAD54和綠色熒光蛋白融合,和超敏感酵母HUG1-yEGFP生物傳感器的宿主細(xì)胞都是真核生物酵母,都是基于單分子的DNA損傷響應(yīng)表達(dá)水平的檢測(cè)原理,因此它們的檢測(cè)結(jié)果高度相似,它們與Ames檢測(cè)和SOS反應(yīng)的檢測(cè)結(jié)果的差異可能更多地表現(xiàn)在原核生物和真核生物之間在損傷修復(fù),代謝解毒和抗脅迫機(jī)理的差異。這種差異比檢測(cè)原理的差異更關(guān)鍵,可能是很多化合物的基因毒性檢測(cè)不到的主要原因。比如亞硝酸鈉在Ames實(shí)驗(yàn)和SOS試驗(yàn)中都被檢測(cè)為基因毒性陽性,但在超敏感酵母HUG1-yEGFP生物傳感器檢測(cè)中卻為基因毒性陰性。這暗示著,在真核生物酵母中可能存在與原核生物不同的某種解毒機(jī)制。同樣的情況也可能發(fā)生在對(duì)重金屬的檢測(cè)中。有大量文獻(xiàn)報(bào)道,酵母中存在多種金屬硫蛋白,因此酵母表現(xiàn)出對(duì)重金屬具有較強(qiáng)的抗性,這也可以解釋為什么用超敏感酵母HUG1-yEGFP生物傳感器只檢測(cè)到NiCl2為基因毒性陽性,其他的都為陰性。另一方面,由于酵母也缺乏高等真核生物的代謝活化酶系統(tǒng),所以我們開始以為用大鼠肝微粒體抽提液S9對(duì)一些化合物進(jìn)行處理后,也可以用超敏感酵母HUG1-yEGFP生物傳感器進(jìn)行檢測(cè),但結(jié)果卻出乎預(yù)料。環(huán)磷酰胺是一種大量使用的抗癌藥物,需要經(jīng)過代謝活化后才能表現(xiàn)出基因毒性,但用S9處理后的檢測(cè)結(jié)果卻為陰性。本實(shí)驗(yàn)室前期也嘗試過對(duì)其他一些有機(jī)化合物進(jìn)行代謝活化,如苯并芘,雖然活化了的化合物可以使Ames實(shí)驗(yàn)檢測(cè)為陽性,但仍然不能使酵母生物傳感器檢測(cè)為陽性。所以猜測(cè),對(duì)于酵母生物傳感器而言,這些化合物所涉及的不僅僅是代謝活化,可能還與酵母的細(xì)胞屏蔽和抗脅迫機(jī)制有關(guān)。鑒于上述所出現(xiàn)的問題,我們還需要對(duì)酵母細(xì)胞的抗脅迫機(jī)制進(jìn)行深入的了解,找到關(guān)鍵的基因進(jìn)行改造,進(jìn)一步改善和擴(kuò)展酵母生物傳感器的檢測(cè)和應(yīng)用范圍。

本研究中被超敏感酵母HUG1-yEGFP生物傳感器特異性檢測(cè)為基因毒性陽性的3種化合物為代森錳鋅、孔雀石綠及丙烯酰胺。這個(gè)檢測(cè)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的這3種化合物均具有潛在致癌性的結(jié)果相一致。代森錳鋅為一種廣譜的乙撐二硫代氨基甲酸酯類保護(hù)性殺菌劑[16],能增加大鼠癌癥的發(fā)生率及與性別相關(guān)的特異癌癥[17],且代森錳鋅受試人類淋巴能導(dǎo)致胞內(nèi)染色體斷裂并促進(jìn)細(xì)胞的凋亡[18]?？兹甘G是一種有毒的三苯甲烷類化合物,作為染色劑用于服飾、瓷器、報(bào)紙等行業(yè)的染色劑,同時(shí)因其具有抗真菌、細(xì)菌、寄生蟲且及急性毒性低等特性,曾被用于漁業(yè)。Fernandes等[19]及Rao[20]等的研究表明孔雀石綠能增加嚙齒動(dòng)物癌癥發(fā)生率,同時(shí)能引起兔子和魚類的生殖異常。1993年美國(guó)明令禁止其使用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)[21],在我國(guó),孔雀石綠于2002年被列入《食品動(dòng)物禁用的獸藥及其化合物清單》,但仍有不少的水產(chǎn)養(yǎng)殖戶因其價(jià)格低廉,殺菌范圍廣,而違規(guī)使用。Ames test在鼠肝微粒體S9存在的情況下,檢測(cè)孔雀石綠為陽性[22],而在本研究中,孔雀石綠在無外源代謝系統(tǒng)的情況下誘導(dǎo)報(bào)告系統(tǒng),檢測(cè)為基因毒性陽性,意味著酵母細(xì)胞中可能存在催化孔雀石綠代謝活化的酶。同時(shí),真菌雅致小克銀漢霉菌催化孔雀石綠脫甲基生成隱色孔雀石綠的研究結(jié)果也支持本研究的猜測(cè)[23]。丙烯酰胺為生產(chǎn)聚丙烯酰胺的原料,聚丙烯酰胺主要用于水的凈化處理及管道涂層、凝膠電泳等。長(zhǎng)時(shí)間高溫烹飪尤其是油炸使得食物特別是淀粉類食物中丙烯酰胺含量升高,甚至能達(dá)到150～4 000μg·mL-1[24],在本研究中有效誘導(dǎo)HUG1-yEGFP生物傳感器的最低劑量為6 400μg·mL-1。對(duì)以上幾種化合物的基因毒性陽性檢測(cè)表明,超敏感酵母HUG1-yEGFP生物傳感器可以有效地對(duì)環(huán)境污染有關(guān)的基因毒性化合物進(jìn)行檢測(cè),可以作為其他現(xiàn)有檢測(cè)系統(tǒng)的補(bǔ)充,應(yīng)用于環(huán)境化學(xué)污染的健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)。

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Utilization of Super-sensitive Yeast HUG1-yEGFP Biosensor to Screen Genotoxic Compounds

Tang Huamei1,2,Wei Ting1,2,Zhang Chao1,2,Liu Yuqian1,2,Wang Yan1,Zhang Xiaohua1,Yuan Li1, Dai Heping1,*
1.State Key Laboratory of Freshwater Ecology and Biotechnology,Institute of Hydrobiology,Chinese Academy of Sciences,Wuhan 430072,China
2.University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China

6 February 2015 accepted 19 March 2015

In order to extend the detection range of super-sensitive DNA damage responded yeastHUG1-yEGFP biosensor which was constructed by our laboratory,and to accumulate more relevant data for practical application, 26 kinds of chemicals which were widely distributed in the environment and human lives were detected and 8 kinds of genotoxic compounds were screened out.Compared with three existed microbiological whole-cell sensing systems,the detection results in this study matched over 50%of the data from Ames test and SOS colorimetric testbased on bacterial cell,and over 85%of the data from the GSA test based on yeast cell.The differences of the results between the test systems based on eukaryotic yeast cell and prokaryotic bacteria cells reflected the different mechanisms of stress resistance.In this study,three kinds of genotoxicity-positive compounds,mancozeb,malachite green and acrylamide which were reported as potential carcinogens,were specifically detected by super-sensitive yeastHUG1-yEGFPbiosensor.The results of the study indicated that super-sensitive yeastHUG1-yEGFPbiosensor can be used to effectively detect genotoxic compounds which were related to environmental pollution.Therefore,they are valuable in environmental health risk assessment for chemical pollutant as a complementary method for other existed detection systems.

environmental pollution;yeast;biosensor;genotoxicity;health risk assessment

2015-02-06 錄用日期:2015-03-19

1673-5897(2016)1-194-08

X171.5

A

10.7524/AJE.1673-5897.20150206002

湯花梅,魏婷,張超,等.應(yīng)用超敏感酵母HUG1-yEGFP生物傳感器篩選基因毒性化合物[J].生態(tài)毒理學(xué)報(bào),2016,11(1):194-201

Tang H M,Wei T,Zhang C,et al.Utilization of super-sensitive yeastHUG1-yEGFPbiosensor to screen genotoxic compounds[J].Asian Journal of Ecotoxicology,2016,11(1):194-201(in Chinese)

國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(21037004)；淡水生態(tài)和生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目(2012FBZ10)

湯花梅(1989-),女,碩士,研究方向?yàn)榻湍干飩鞲衅鞅O(jiān)測(cè)基因毒性研究,E-mail:sjtangyuan@sina.cn

),E-mail:hpdai@ihb.ac.cn

簡(jiǎn)介:戴和平(1955-)，女，博士，研究員，主要研究興趣是將高通量生物標(biāo)志物的檢測(cè)方法應(yīng)用于環(huán)境科學(xué)中。