孫蔚楠，朱清，閻磊，邵鳳民

（河南省人民醫(yī)院，鄭州450003）

利格列汀對體外高糖誘導(dǎo)后人腎小管上皮細(xì)胞E-cadherin、α-SMA表達的影響及機制

孫蔚楠，朱清，閻磊，邵鳳民

（河南省人民醫(yī)院，鄭州450003）

目的 探討利格列汀對體外高糖誘導(dǎo)后人腎小管上皮細(xì)胞鈣黏附蛋白E（E-cadherin）、肌動蛋白α（α-SMA）表達的影響及機制。方法 將體外培養(yǎng)的人腎小管上皮細(xì)胞（HK-2細(xì)胞）隨機分為正常對照組、高糖組、高糖+Wnt4 siRNA組、高糖+β-catenin siRNA組、高糖+利格列汀組，高糖+Wnt4 siRNA組、高糖+β-catenin siRNA組分別轉(zhuǎn)染siRNA沉默Wnt4、β-catenin，12 h后與高糖組、高糖+利格列汀組同時加入D-葡萄糖（葡萄糖終濃度為30 mmol／L），高糖+利格列汀組同時加入利格列汀（終濃度10 μmol／L），繼續(xù)培養(yǎng)48 h。采用Western blotting法檢測各組E-cadherin、α-SMA、Wnt4、β-catenin蛋白表達，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，測定細(xì)胞長與寬比值。結(jié)果 與正常對照組比較，高糖組E-cadherin表達下調(diào)、α-SMA、Wnt4、β-catenin表達上調(diào)（P均＜0.05）；與高糖組比較，高糖+Wnt4 siRNA組、高糖+β-catenin siRNA組、高糖+利格列汀組E-cadherin表達上調(diào)、α-SMA表達下調(diào)（P均＜0.05）。高糖組細(xì)胞由卵圓形伸長呈梭形，高糖+利格列汀組細(xì)胞由卵圓形向梭形改變程度減輕。高糖組細(xì)胞長／寬較正常對照組、高糖+利格列汀組升高（P均＜0.05）。結(jié)論 利格列汀可部分抑制體外高糖誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞E-cadherin表達下調(diào)、α-SMA表達上調(diào)，其機制可能與Wnt4／β-catenin通路有關(guān)。

利格列??；腎小管上皮細(xì)胞；鈣黏附蛋白E；肌動蛋白α；Wnt4／β-catenin通路

高糖可通過多種途徑誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化（EMT），并最終導(dǎo)致腎小管間質(zhì)纖維化（TIF）的發(fā)生［1］。利格列汀是目前臨床常用的新型降糖藥二肽基肽酶（DPP-4）抑制劑之一，具有降糖效果佳、安全性高、適應(yīng)證廣等優(yōu)點［2，3］。最新研究表明利格列汀具有抑制EMT及TIF的作用［4］。2015年6～11月，本研究探討利格列汀對體外高糖誘導(dǎo)后腎小管上皮細(xì)胞鈣黏附蛋白E（E-cadherin）、肌動蛋白α（α-SMA）表達的影響及機制。

1　材料與方法

1.1材料 利格列汀片（歐唐寧，5 mg／片，Boe-

hringer Ingelheim Pharmaceuticals公司），人近端腎小管上皮細(xì)胞系（HK-2細(xì)胞系，ATCC公司），胎牛血清（FBS，Hyclone公司），DMEM／F12培養(yǎng)液（Invitrogen公司），0.25%胰蛋白酶、D-甘露醇、D-葡萄糖（Sigma公司），Wnt4 siRNA、β-catenin siRNA（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），轉(zhuǎn)染試劑lipofectamineTM2000（Invitrogen公司），E-cadherin多克隆抗體（Abcam公司），a-SMA、Wnt4、β-catenin多克隆抗體（Santa cruz公司），HRP標(biāo)記山羊抗兔、抗小鼠IgG（中國碧云天公司）。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及處理 HK-2細(xì)胞復(fù)蘇后，以含10%FBS的DMEM／F12培養(yǎng)液于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。細(xì)胞長滿后，用0.25%胰酶消化，將HK-2細(xì)胞以1×105／mL接種于T25培養(yǎng)瓶，按照以下方式分組培養(yǎng)：正常對照組、高糖誘導(dǎo)組、高糖+Wnt4 siRNA組、高糖+β-catenin siRNA組、高糖+利格列汀組。培養(yǎng)方法：DMEM／F12 10%FBS培養(yǎng)細(xì)胞生長至約30%亞融合后，改用無血清DMEM／F12培養(yǎng)液；高糖+Wnt4 siRNA組、高糖+ β-catenin siRNA組用lipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染siRNA，轉(zhuǎn)染步驟按說明書進行操作，siRNA終濃度為100 nmol／L，將siRNA／lipofectamineTM2000復(fù)合物加入T25培養(yǎng)瓶中輕柔搖晃使其混勻，在CO2培養(yǎng)箱中37℃孵育12 h；正常對照組、高糖組、高糖+利格列汀組同步無血清培養(yǎng)12 h；之后各組同時更換DMEM／F12 10%FBS培養(yǎng)液，除正常對照組外均加入D-葡萄糖，使培養(yǎng)液中葡萄糖終濃度為30 mmol／L，高糖+利格列汀組同時加入利格列汀（終濃度10 μmol／L），繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.3HK-2細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 各組細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌后用倒置顯微鏡拍照觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，每組隨機測量100個細(xì)胞，測定細(xì)胞長與寬的比值，取其平均值。

1.4 細(xì)胞中E-cadherin、a-SMA、Wnt4、β-catenin蛋白表達檢測 采用Western blotting法。收集各組HK-2細(xì)胞，加入適量裂解液，超聲破碎儀裂解細(xì)胞，12 000 r／min×30 min離心，提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取50～100 μg蛋白質(zhì)上樣行聚丙烯酰胺-SDS凝膠電泳，電泳后用電轉(zhuǎn)移儀轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。剪取相應(yīng)條帶，加入相應(yīng)的一抗4℃過夜，TBST洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1～2 h，充分洗滌，應(yīng)用ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色，X片顯影。以β-actin為內(nèi)參照，應(yīng)用吸光度值分析軟件進行條帶分析，用目的蛋白灰度值與內(nèi)參灰度值的比值代表蛋白相對表達量。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件。計量資料用±s表示，多組比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組E-cadherin、α-SMA、Wnt4、β-catenin蛋白表達比較 見表1。

表1　各組E-cadherin、α-SMA、Wnt4、β-catenin蛋白相對表達量比較（±s）

表1　各組E-cadherin、α-SMA、Wnt4、β-catenin蛋白相對表達量比較（±s）

注：與正常對照組比較，aP＜0.05；與高糖組比較，bP＜0.05。

組別E-cadherinα-SMAWnt4β-catenin正常對照組1.24±0.220.34±0.100.26±0.080.30±0.14高糖組0.31±0.09a1.25±0.24a1.17±0.30a1.04±0.17a高糖+Wnt4 siRNA組0.93±0.16b0.47±0.12b0.48±0.13b0.63±0.10b高糖+catenin siRNA組0.78±0.13b0.56±0.11b0.79±0.15b0.45±0.16b高糖+利格列汀組1.03±0.14b0.78±0.17b0.62±0.13b0.65±0.09b

2.2各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 鏡下觀察見正常對照組HK-2細(xì)胞形態(tài)為卵圓形；高糖組給予高糖刺激48 h后細(xì)胞發(fā)生形態(tài)學(xué)改變，由卵圓形伸長呈梭形；高糖+利格列汀組細(xì)胞形態(tài)由卵圓形向梭形改變的程度減輕。正常對照組、高糖組、高糖+Wnt4 siRNA組、高糖+β-catenin siRNA組、高糖+利格列汀組細(xì)胞長／寬值分別為1.38±0.41、4.47±1.12、2.84±0.72、3.11±0.65、2.62±0.73，高糖組細(xì)胞長／寬較正常對照組、高糖+利格列汀組升高（P均＜0.05）。

3　討論

研究表明，在體外可通過高糖誘導(dǎo)腎小管EMT，形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為腎小管上皮細(xì)胞由正常的卵圓形伸長成梭形，分子水平則表現(xiàn)為腎小管上皮細(xì)胞標(biāo)志物如E-cadherin等的下調(diào)及間充質(zhì)標(biāo)志物α-SMA、Vimentin、Fibronectin等表達增加［5，6］。利格列汀作為DPP-4抑制劑類降糖藥的代表藥物之一，因其降糖效果佳及多重腎臟保護作用而成為近年來研究的熱點。因此，我們通過在體外構(gòu)建高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化模型并應(yīng)用利格列汀干預(yù)來進行相關(guān)研究。

Wnt／β-catenin信號調(diào)節(jié)EMT的作用已得到廣泛認(rèn)可。Wnt蛋白屬于高度保守的分泌生長因子家族，β-catenin是Wnt家族的核心下游因子。Wnt／βcatenin信號調(diào)節(jié)EMT的作用已在器官發(fā)育和腫瘤轉(zhuǎn)移方面得到多項研究的證實［7］，也有研究表明其可能參與了腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生［8］，然而其在糖尿病腎病腎小管上皮細(xì)胞EMT中的作用仍有待進一步研究。近期研究顯示，Wnt4及下游β-catenin信號參與介導(dǎo)了甲狀旁腺激素誘導(dǎo)的腎小管EMT［9］；另有研究表明β-catenin作為細(xì)胞骨架蛋白是細(xì)胞連接的重要組成部分，與E-cadherin等黏附因子共同參與細(xì)胞連接的構(gòu)建，而病理狀態(tài)下未磷酸化的β-catenin在胞質(zhì)及核內(nèi)異常聚集，并與轉(zhuǎn)錄因子TCF／LEF家族成員結(jié)合，促使其下游EMT相關(guān)基因的表達，促進EMT的發(fā)生［10～12］。

本研究在體外建立了高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞EMT模型，在高糖誘導(dǎo)下可見HK-2細(xì)胞由卵圓形伸長成梭形，上皮標(biāo)志物E-cadherin表達下調(diào)和間充質(zhì)標(biāo)志物α-SMA表達上調(diào)，以上結(jié)果表明HK-2細(xì)胞在高糖誘導(dǎo)下由上皮表型向間充質(zhì)表型轉(zhuǎn)分化。另外，我們發(fā)現(xiàn)高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞Wnt4及β-catenin表達上調(diào)，而Wnt4 siRNA／β-catenin siRNA可部分抑制高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，表現(xiàn)為與高糖誘導(dǎo)組相比，Wnt4 siRNA及β-catenin siRNA干預(yù)后E-cadherin表達上調(diào)和α-SMA表達下調(diào)，結(jié)果表明Wnt4／β-catenin可能參與了高糖誘導(dǎo)的EMT發(fā)生。

本研究同時觀察了利格列汀對高糖誘導(dǎo)下的HK-2細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的影響，結(jié)果顯示利格列汀能夠抑制HK-2細(xì)胞由卵圓形伸長成梭形，上調(diào)E-cadherin的表達并抑制α-SMA表達，表明利格列汀可部分抑制高糖誘導(dǎo)的腎小管EMT。另外，研究結(jié)果表明利格列汀干預(yù)后可部分減輕高糖誘導(dǎo)下HK-2細(xì)胞Wnt4及β-catenin的表達上調(diào)。糖尿病腎病TIF及EMT是多種病理因素誘導(dǎo)下的動態(tài)復(fù)雜過程，而利格列汀的腎臟保護作用亦可能存在著多種機制。然而，該研究結(jié)果表明抑制多種病理因素下促EMT信號分子Wnt4和β-catenin的表達增加可能是利格列汀抑制EMT及延緩腎間質(zhì)纖維化的重要機制之一。

［1］Yung S，Lee CY，Zhang Q，et al.Elevated glucose induction ofthrombospondin-l up-regulates fibronectin synthesis in proximal renal tubular epithelial cells through TGF-beta1 dependent and TGF-beta1 independent pathways［J］.Nephrol Dial transplant，2006，21（6）：1504-1513.

［2］Forst T，Uhlig-Laske B，Ring A，et al.The oral DPP-4 inhibitor linagliptin significantly lowers HbAlc after 4 weeks of treatment in patients with type 2 diabetes mellitus［J］.Diabetes Obes Metab，2011，13（6）：542350.

［3］Graefe-Mody U，F(xiàn)riedrieh C，Port A，et al.Renal impairment has no relevant effect on long-term exposure of linagliptin in patients with 2 diabetes mellitus［J］.Diabetes Obes Metab，2011，13（10）：939-946.

［4］Zeisberg M，Zeisberg EM.Evidence for antifibrotic incretin-independent effects of the DPP-4 inhibitor linagliptin［J］.Kidney Int，2015，88（3）：429-431.

［5］張飛飛，譚若云，熊明霞，等.高糖通過轉(zhuǎn)化生長因子β1-Smad信號傳遞途徑誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化［J］.中華腎臟病雜志，2008，24（3）：174-178.

［6］Lv ZM，Wang Q，Wan Q，et al.The role of the p38 MAPK signaling pathway in high glucose-induced epithelial-mesenchymal transition of cultured human renal tubular epithelial cells［J］.PLoS One，2011，6（7）：e22806.

［7］Wu Y，Zhou BP.New insights of epithelialmesenchymal transition in cancer metastasis［J］.Acta Biochim Biophys Sin，2008，40（7）：643-650.

［8］He W，Dai C，Li Y，et al.Wnt／beta-catenin signaling promotes renal interstitial fibrosis［J］.J Am Soc Nephrol，2009，20（4）：765-776.

［9］Guo Y，Li Z，Ding R，et al.Parathyroid hormone induces epithelial-to-mesenchymal transition via the Wnt／β-catenin signaling pathway in human renal proximal tubular cells［J］.Int J Clin Exp Pathol，2014，7（9）：5978-5987.

［10］Yoshino J，Monkawa T，Tsuji M，et al.Snail1 is involved in the renal epithelial-mesenchymal transition［J］.Biochem Biophys Res Commun，2007，362（1）：63-68.

［11］Graham TR，Zhau HE，Odero-Marah VA，et al.Insulin-like growth factor-I-dependent up-regulation of ZEB1 drives epithelialto-mesenchymal transition in human prostate cancer cells［J］.Cancer Res，2008，68（7）：2479-2488.

［12］Kida Y，Asahina K，Teraoka H，et al.Twist relates to tubular epithelialmesenchymal transition and interstitial fibrogenesis in the obstructed kidney［J］.J Histochem Cytochem，2007，55（7）：661-673.

10.3969／j.issn.1002-266X.2016.21.012

R977.1

A

1002-266X（2016）21-0033-03

（2016-01-16）