劉 雪,王玉嬌,全吉淑,沈明花

(延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院,吉林延吉 133000)

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榆干離褶傘溶栓酶對(duì)血栓模型大鼠血小板活性的影響

劉 雪,王玉嬌,全吉淑,沈明花

(延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院,吉林延吉 133000)

目的:研究榆干離褶傘(Lyophyllumulmarium,L.u)溶栓酶的抗血栓作用及對(duì)血小板活性的影響。方法:三氯化鐵誘導(dǎo)大鼠頸動(dòng)脈血栓模型,檢測(cè)血栓重量,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD62P的表達(dá),酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定p-選擇素、血管性血友病因子(vWF)、血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa、血栓素B2(TXB2)和6-酮-前列腺素E1α(6-keto-PGE1α)的水平。結(jié)果:與模型組相比,L.u溶栓酶處理以后大鼠血栓重量明顯減輕,CD62P陽(yáng)性率、p-選擇素、vWF、血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa以及TXB2的含量不同程度地下降,對(duì)6-keto-PGE1α的影響不明顯。結(jié)論:L.u溶栓酶具有抗血栓作用,其機(jī)制可能與抑制血小板的活化作用有關(guān)。

榆干離褶傘,溶栓酶,血栓,血小板

榆干離褶傘(Lyophyllumulmarium,L.u),又名榆生離褶傘、大榆蘑,主要分布于我國(guó)東北三省。目前,有關(guān)榆干離褶傘生物活性方面的研究報(bào)道較少。在前期研究中,我們發(fā)現(xiàn)榆干離褶傘發(fā)酵液具有溶栓[1]、保肝[2]、抗氧化作用[3]和保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞[4]等功效。我們已從榆干離褶傘菌絲體中分離純化了分子量為50 ku的溶栓酶,并進(jìn)行了酶學(xué)特性分析[5]。

血栓是血液中纖維蛋白多聚體與細(xì)胞組成的復(fù)合物,其形成與諸多因素有關(guān)。如血管內(nèi)膜的損傷、血小板的活化、血液粘度的改變等。其中,血小板的粘附、聚集及釋放功能的異常是血栓形成過(guò)程中的重要因素。在前期工作中,我們發(fā)現(xiàn)榆干離褶傘溶栓酶對(duì)氧化應(yīng)激損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用[6]。本文中通過(guò)建立大鼠頸動(dòng)脈血栓模型,探討榆干離褶傘溶栓酶對(duì)血小板活性的影響,為闡明其抗栓機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

榆干離褶傘溶栓酶 由延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究室提供;動(dòng)物 清潔級(jí)SD大鼠40只,體重在180～220 g,雌雄各半,由延邊大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK(吉)2011-0007;CD61-PE、CD62P-FITC 購(gòu)于美國(guó)BD公司;p-selectin、vWF、GPⅡb/Ⅲa、6-keto-PGE1α和TXB2試劑盒 均購(gòu)自上海嚴(yán)謹(jǐn)生物科技有限公司。

流式細(xì)胞儀 Beckman公司;MS105DU分析天平 梅特勒公司;5308型全自動(dòng)離心機(jī) Sigma公司;RT-2100型酶標(biāo)儀 深圳雷杜公司。

圖1 L.u溶栓酶對(duì)血小板CD62P表達(dá)的影響Fig.1 Effects of fibrinolytic enzyme from L.u on the expression of CD62p of plateletA:假手術(shù)組;B:模型組;C:低劑量組;C:中劑量組;D:高劑量組。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理 將40只大鼠隨機(jī)分為5組,即假手術(shù)組、模型組、低、中、高劑量用藥組。用藥組按5、10、40 mg/100 g體質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)灌胃榆干離褶傘溶栓酶,假手術(shù)組和模型組灌胃等量生理鹽水,每日1次,連續(xù)7 d。末次給藥30 min后參照Kurz[7]法復(fù)制頸總動(dòng)脈血栓模型。鈍性分離右側(cè)頸總動(dòng)脈,其底下墊1.5 cm×2 cm的醫(yī)用敷料,除假手術(shù)組外的其余各組用浸有20% FeCl3溶液的濾紙條包裹該段頸總動(dòng)脈,而假手術(shù)組用生理鹽替代20% FeCl3溶液。15 min后取下濾紙條,40 min后結(jié)扎敷料兩端血管,按照敷料長(zhǎng)度精確剪下濾紙條包裹的血管,并取出血栓,稱(chēng)重。大鼠心臟取血,全血用于測(cè)定血小板CD62P水平,部分血液用枸櫞酸鈉抗凝,制備血漿,用于血漿指標(biāo)的檢測(cè)。

1.2.2 血小板活化CD61/CD62P檢測(cè) 在流式專(zhuān)用上樣管中分別加入CD61-PE、CD62P-FITC抗體2 μL,再加入全血5 μL。避光靜置15～20 min,加入預(yù)冷的1%多聚甲醛1 mL,4 ℃暗處?kù)o置30 min后在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)。

1.2.3 血漿指標(biāo)測(cè)定 用ELISA法檢測(cè)p-選擇素、vWF、血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa、TXB2和6-keto-PGE1α的水平。檢測(cè)方法按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件處理,組間差異性檢驗(yàn)采用單因素方差分析和t-檢驗(yàn)。p<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 榆干離褶傘溶栓酶對(duì)血栓重量的影響

表1所示,假手術(shù)組無(wú)血栓形成,而模型組血栓重量均值為3.2 mg,說(shuō)明模型組造模成功。與模型組相比,榆干離褶傘溶栓酶中、高劑量給藥組的血栓重量明顯減輕,具有顯著性差異(p<0.05),提示榆干離褶傘溶栓酶具有抗血栓作用。

表1 榆干離褶傘溶栓酶對(duì)血栓重量的影響(±s)

注:與模型組相比,*表示p<0.05;“-”表示未進(jìn)行榆干離褶傘溶栓酶處理或無(wú)血栓形成。

2.2 L.u溶栓酶對(duì)血小板CD62P的影響

圖1為血小板CD61/CD62P散點(diǎn)圖。CD62P作為血小板活化的靈敏指標(biāo),可反映血小板活化程度。各組血小板CD62P的表達(dá)率分別為假手術(shù)組(A)為2.67%,模型組(B)為6.64%,低劑量組為4.44%,中劑量組為3.73%,高劑量組的3.53%。與模型組相比,用藥組的CD62P的陽(yáng)性率下降(p<0.05),這就說(shuō)明榆干離褶傘溶栓酶降低FeCl3誘導(dǎo)的血小板的活化水平。

2.3 L.u溶栓酶對(duì)大鼠血漿相關(guān)指標(biāo)的影響

表2 L.u溶栓酶對(duì)p-選擇素、vWF、GPⅡb/Ⅲa、TXB2和6-keto-PGE1α的影響(±s)

注:與模型組相比,*表示p<0.05;**表示p<0.01;“-”表示未進(jìn)行榆干離褶傘溶栓酶處理。

表2顯示,除了模型組的6-keto-PGE1α水平低于假手術(shù)組(p<0.01)以外,p-選擇素、vWF、GPⅡb/Ⅲa和TXB2水平明顯高于假手術(shù)組,這就提示三氯化鐵作用于血管以后損傷血管內(nèi)皮,進(jìn)一步激活血小板的粘附、聚集功能。與模型組相比,中、高劑量用藥組的p-選擇素、vWF、Ⅱb/Ⅲa和TXB2水平不同程度地下降,這就說(shuō)明榆干離褶傘溶栓酶抑制血小板的粘附及聚集。

3 討論與結(jié)論

Lockyer等[8]學(xué)者發(fā)現(xiàn),FeCl3溶液外敷使血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,膠原暴露,血小板黏附集聚而形成混合型血栓。動(dòng)脈外膜上的FeCl3通過(guò)胞吞-胞吐作用進(jìn)入血管腔,通過(guò)高鐵離子的氧化作用引起血管內(nèi)皮損傷,繼而發(fā)生血小板的粘附、聚集和釋放反應(yīng)而形成血栓。本實(shí)驗(yàn)以FeCl3溶液外敷頸動(dòng)脈的方法建立大鼠頸動(dòng)脈血栓模型,觀察了榆干離褶傘溶栓酶的抗栓、抗血小板聚集作用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,用藥組的血栓重量低于模型組,說(shuō)明榆干離褶傘溶栓酶具有抗血栓作用。諸多研究結(jié)果表明,在血栓形成過(guò)程中血小板的活化起重要作用。CD62P作為血小板活化的特異性標(biāo)志物[9],主要分布于血小板的α顆粒和內(nèi)皮細(xì)胞Weibel-palade小體膜上。在某些誘因的作用下,當(dāng)血小板活化時(shí),血小板表面CD62P表達(dá)增多。本實(shí)驗(yàn)中模型組的CD62P陽(yáng)性率明顯高于假手術(shù)組,說(shuō)明FeCl3損傷內(nèi)皮結(jié)構(gòu)和功能,使膠原暴露,促進(jìn)血小板的粘附和聚集。與模型組相比,用藥組CD62P表達(dá)減少,并有一定的劑量效果。結(jié)果提示,榆干離褶傘溶栓酶有可能直接抑制血小板的活化,或者通過(guò)保護(hù)血管內(nèi)皮的作用來(lái)間接抑制血小板的粘附、聚集。CD62P又稱(chēng)P-選擇素。本實(shí)驗(yàn)中采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定血小板膜CD62P陽(yáng)性率的同時(shí),測(cè)定了血漿P-選擇素的含量。結(jié)果表明,各組的血漿P-選擇素含量變化與血小板CD62P表達(dá)趨勢(shì)相一致,這就進(jìn)一步驗(yàn)證了榆干離褶傘的抗血小板作用。

本實(shí)驗(yàn)中,FeCl3對(duì)血管內(nèi)膜的氧化損傷導(dǎo)致血漿vWF 含量增多,6-keto-PGE1α水平下降。高水平的vWF介導(dǎo)血小板的聚集和釋放反應(yīng),促進(jìn)血栓素的合成,故血漿中的TXA2代謝產(chǎn)物-TXB2水平隨之增高。這就可以解釋模型組的vWF和TXB2水平高于假手術(shù)組的現(xiàn)象。vWF水平可以反映內(nèi)皮受損程度,血漿vWF水平升高可增加血栓形成的危險(xiǎn)性[10]。用藥組的vWF和TXB2水平明顯下降,說(shuō)明榆干離褶傘溶栓酶一方面通過(guò)保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞,減輕高價(jià)鐵對(duì)血管內(nèi)皮的損傷,從而降低血漿vWF水平,減輕血小板的聚集從而抑制血栓的形成。另一方面,榆干離褶傘通過(guò)抑制血小板的活化,抑制磷脂酶A2的活性,阻斷花生四烯酸的代謝,從而減少TXA2的合成。

GPⅡb/Ⅲa作為血栓形成最后途徑的關(guān)鍵因子,與纖維蛋白、vWF等配體結(jié)合,在血小板聚集和血栓形成中起著重要的作用。血小板活化時(shí),其表面糖蛋白Ⅱb/Ⅲa含量升高并發(fā)生構(gòu)象變化而暴露纖維蛋白原的結(jié)合位點(diǎn),通過(guò)纖維蛋白原的橋梁作用使血小板聚集,最終形成血栓[11]。本實(shí)驗(yàn)中模型組的GPⅡb/Ⅲa水平顯著升高,而用藥組其含量減少,提示榆干離褶傘溶栓酶通過(guò)抑制血小板GPⅡb/Ⅲa的表達(dá)而減輕血小板的聚集,從而減少血栓形成的。

綜上所述,榆干離褶傘溶栓酶具有抗血栓作用,對(duì)血小板的的抑制作用有可能是抗栓作用的機(jī)制之一。

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Effect of fibrinolytic enzyme fromLyophyllumulmariumon platelet activation in thrombotic rat

LIU Xue,WANG Yu-jiao,QUAN Ji-shu,SHEN Ming-hua*

(Medical College Yanbian University,Yanji 133000,China)

Objective:To study the antithrombotic effect and the effect on platelet activity of fibrinolytic enzyme fromLyophyllumulmarium. Methods:The carotid arterial thrombosis model was induced by ferric chloride in rats,and then the thrombus weight was detected. The expression of CD62p on the platelet were applied by flow cytometric analysis,and the levels of p-selectin,vWF,platelet glycoprotein Ⅱb/Ⅲa(GPⅡb/Ⅲa),TXB2and 6-keto-PGE1α,in plasma were measured. Results:Compared with the model group,fibrinolytic enzyme fromLyophyllumulmariumreduced thrombus weight,suppressed the expression of CD62p,and reduced the contents of P-selectin,vWF,platelet glycoprotein GPⅡb/Ⅲa and TXB2. However,there was no significant difference in the 6-keto-PGE1αlevel. Conclusion:Fibrinolytic enzyme fromLyophyllumulmariumhas an antithrombotic activity,and the mechanism may be due to inhibition of platelet activity.

Lyophyllumulmarium;fibrinolytic enzyme;thrombus;platelet

2016-03-30

劉雪(1991-)，女，碩士，研究方向：天然物質(zhì)活性研究，E-mail:928710669@qq.com。

*通訊作者:沈明花(1970-)，女，博士，副教授，研究方向：食用菌生物活性，E-mail:sdjjch@ybu.edu.cn。

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30760150，81360088)。

TS255.3

A

1002-0306(2016)20-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.20.000