陳展冊,杜智欣,高 佳,劉軍義,羅兆飛

(1.廣西出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心,廣西南寧 530021;2.南寧市種子管理站,廣西南寧 530001)

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顯微鏡與實時熒光PCR檢測方法在馬蹄淀粉鑒定中的應用

陳展冊,杜智欣,高 佳,劉軍義,羅兆飛

(1.廣西出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心,廣西南寧 530021;2.南寧市種子管理站,廣西南寧 530001)

采用光學生物顯微鏡觀測結(jié)合實時熒光PCR檢測方法對馬蹄淀粉中摻雜行為進行定性鑒別,以期為鑒別淀粉摻雜成分提供更客觀、更準確的檢測手段。結(jié)果顯示:32個隨意摻雜的馬蹄淀粉樣品中8個是純馬蹄淀粉,5個是純木薯淀粉,1個是純玉米淀粉,3個是純馬鈴薯淀粉,3個是馬蹄淀粉和馬鈴薯淀粉的混合物,1個是馬蹄淀粉和木薯淀粉的混合物,1個是馬蹄淀粉和玉米淀粉的混合物,5個是木薯和玉米淀粉的混合物,3個是木薯淀粉和馬鈴薯淀粉的混合物,2個是木薯淀粉、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉的混合物。32個樣品顯微鏡鏡檢結(jié)果和PCR檢測結(jié)果基本吻合。兩種方法可為國內(nèi)淀粉市場質(zhì)量監(jiān)督提供有效的檢測方法。

鏡檢法,實時熒光PCR檢測法,馬蹄淀粉,檢測,摻雜

淀粉是生物圈中最豐富的碳水化合物之一,它主要貯存于綠色植物的根、莖、葉、芽、果實和籽粒等組織器官中。人類利用的淀粉主要來源于植物的籽粒、塊根和塊莖,每年產(chǎn)生于籽粒的淀粉約20.5億噸,玉米、水稻、小麥、馬鈴薯、木薯等是生產(chǎn)淀粉的主要作物[1-4]。淀粉作為營養(yǎng)物質(zhì)是人類食物和動物飼料的主要成分,提供了60%～80%的熱量,同時淀粉也具有重要的商品價值,被大量用作食品工業(yè)原料[5-6]。然而,伴隨著人類生活需求的增長,國內(nèi)淀粉的生產(chǎn)加工貿(mào)易發(fā)展,一些不法商販為賺取更多利潤,在一些成本相對較高的淀粉如馬蹄淀粉中摻入一些廉價的淀粉(如木薯淀粉、紅薯淀粉、玉米淀粉等)或直接用廉價淀粉冒充出售,嚴重損害消費者的利益。目前對淀粉的研究已成為國內(nèi)外科技工作者非常重視的前沿課題之一。為加強國內(nèi)淀粉產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)管,國家已出臺多項標準方法,但針對市場上新出現(xiàn)的價格差異較大的不同種類淀粉之間的摻雜現(xiàn)象,尚無可行鑒別方法,也無國家標準方法可依。因為無論是普通感官檢驗還是理化分析指標上,不同種類的淀粉之間的差別都很小,難以作為鑒別依據(jù)。雖然在掃描電子顯微鏡(SEM)下,不同種類的淀粉顆粒顯現(xiàn)出形態(tài)各異的超微形貌特征,但這些特征是否與淀粉顆粒原始形貌特征一致,仍需研究驗證,而且它們存在諸如淀粉之間形態(tài)相似,無法精確判斷等限制[7]。

本研究針對淀粉行業(yè)所面臨的問題,提取馬蹄淀粉、木薯淀粉、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉顆粒,模擬市場上馬蹄淀粉產(chǎn)品可能的摻雜情況將馬蹄淀粉與3種淀粉進行隨機組合,采用普通的光學生物顯微鏡對其顯微特征進行分析,同時探討用熒光PCR對其分子結(jié)構(gòu)進行分析,建立不同種類食用淀粉的分析方法,構(gòu)建淀粉表征屬性分析技術(shù)體系。為規(guī)范整治市場的有序運行,維護消費者的利益提供鑒定技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

馬蹄、木薯、玉米、馬鈴薯 均購自廣西農(nóng)貿(mào)市場;實驗所用的32個樣品 從市場購置的馬蹄、木薯、玉米、馬鈴薯原料中提取的淀粉模擬市場上可能出現(xiàn)的不同成分的摻雜情況進行隨機摻雜組成 如表2;Premix ExTaq、CTAB、Tris、PVP、EDTA、Na2·2H2O、β-巰基乙醇 寶生物工程(大連)有限公司;Tris-平衡酚 北京天根生化科技有限公司;其他常規(guī)有機試劑 均為國產(chǎn)分析純;馬蹄淀粉、木薯淀粉兩對檢測引物及Tagman探針[8]、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉引物及Tagman探針[9-10]購自寶生物工程(大連)有限公司。

DM6000高級生物顯微鏡 德國徠卡公司;ML3002電子分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;HERMLE Z323K高速冷凍離心機 德國HERMLE公司;7500實時熒光PCR儀 美國Life公司;ND2000C超微量分光光度計 美國Thermo公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準淀粉制備 在王紹清[7,11-12]介紹的制備方法下略作修改,步驟如下:每次稱取原料50 g,用蒸餾水洗滌干凈后于100 mL 1 g/100 mL的亞硫酸氫鈉溶液中浸泡過夜。將樣品粉碎后的勻漿過100目標準篩,篩下的淀粉懸濁液經(jīng)4000 r/min離心20 min,分離所得的沉淀用超純水反復洗滌離心3次,最后分散于0.2 g/100 mL的氫氧化鈉溶液中放置3～5 h。隨后離心分離出淀粉,用蒸餾水反復清洗、離心3遍,最后所得沉淀分散于蒸餾水中,靜置沉降,倒掉上清液后,除去上面有顏色部分,將剩余的淀粉置于烘箱中,40 ℃烘干過夜。分數(shù)次提取直至達到樣品的混樣量。

1.2.2 顯微鏡觀察法 對照標準淀粉樣品和32個隨機摻雜淀粉樣品的顯微鏡觀察。將自制的4個標準樣品(馬蹄淀粉、木薯淀粉、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉)和32個隨機摻雜淀粉樣品分別稱取10 g于燒杯中,以10倍蒸餾水均勻分散成懸濁液。取一滴懸濁液約50 μL涂布于載玻片上,蓋上蓋玻片,輕輕揉按使顆粒分布均勻并除去氣泡。將玻片置于400倍光學顯微鏡下鏡檢,對淀粉顆粒大小、形貌等特征進行觀察和測量[11]。

1.2.3 熒光PCR鑒定方法

1.2.3.1 實時熒光特異性檢測 分別提取32種淀粉樣品的DNA[8],提取后的DNA均定量至50 ng/μL,分別以針對馬蹄淀粉、木薯淀粉、玉米淀粉和馬鈴薯淀粉4對引物探針來擴增全部淀粉樣品,陰性對照模板均為TE緩沖液,空白對照模板均為雙蒸水,PCR反應體系為:淀粉DNA樣品2 μL,Mix 12.5 μL,引物終濃度0.2 μmol/L,探針終濃度為0.1 μmol/L,用ddH2O補充到25 μL;實時熒光PCR反應條件為95 ℃ 10 min;95 ℃ 15 s、55 ℃ 1 min,共45個循環(huán)。

1.2.3.2 結(jié)果判定 循環(huán)閾值(cycle threshold,Ct值)≤ 35,并且陰性對照、陽性對照和空白對照結(jié)果正常,可直接判定為陽性;待檢樣基因檢測Ct值在36～40之間,應重做實時熒光PCR擴增;再次擴增后Ct值仍>36,且曲線有明顯的對數(shù)增長期,并且陰性對照、陽性對照和空白對照結(jié)果正常,則可判定為陽性;再次擴增后外源基因Ct值>40,且陰性對照、陽性對照和空白對照結(jié)果正常,可判定為陰性[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 顯微鏡鑒別

2.1.1 4種標準淀粉樣品的顯微鏡觀察 如圖1～圖4所示,標準馬蹄淀粉顆粒的形貌特征為:呈扁平狀,大顆粒形狀不規(guī)則,小顆粒形似葵花籽,呈水滴狀[13];木薯淀粉的形貌特征為:呈大半個球體顆粒,少數(shù)底面為中心凹陷的圓形,多數(shù)底面為多面體錐形或梯形,每個多邊形面的中心稍有凹陷;玉米淀粉顆粒的形貌特征為:呈多面體形,棱角圓滑,部分小顆粒呈球形;馬鈴薯淀粉顆粒的形貌特征為:表面光滑,大的典型顆粒形似馬鈴薯塊莖,小的近似卵形,未成熟的小顆粒呈球形,有輪紋[11-15]。

圖1 標準馬蹄淀粉(400 X)Fig.1 Standard water chestnuts starch(400 X)注:A.馬蹄淀粉;a.單個馬蹄淀粉顆粒。

圖2 標準木薯淀粉(400 X)Fig.2 Standard cassava starch(400 X)注:B.木薯淀粉;b.單個木薯淀粉顆粒。

圖3 標準玉米淀粉(400 X)Fig.3 Standard corn starch(400 X)注:C.玉米淀粉;c.單個玉米淀粉顆粒。

圖4 標準馬鈴薯淀粉(400 X)Fig.4 Standard potato starch(400 X)注:D.馬鈴薯淀粉;d.單個馬鈴薯淀粉顆粒。

2.1.2 32種摻雜淀粉樣品的顯微鏡觀察 淀粉樣品顆粒在400倍顯微鏡下進行觀察并顯微拍照,挑選摻雜不同淀粉的樣品顆粒的顯微圖片各1張,如圖5～圖10所示,同時相應給出了各種摻雜淀粉樣品中每種淀粉的典型形貌特寫。

圖5 樣品1、4、19、26、27、28、29、30(純馬蹄淀粉)(400 X)Fig.5 Sample No.1,4,19,26,27,28,29,30(Pure water chestnut starch)(400 X)注:E.樣品1、4、19、26、27、28、29、30;e.單個馬蹄淀粉顆粒。

圖6 樣品10、16、23、31、32(木薯淀粉)(400 X)Fig.6 Sample No.10,16,23,31,32(cassava starch)(400 X)注:F. 樣品10、16、23、31、32;f. 單個木薯淀粉顆粒。

圖7 樣品24(玉米淀粉)(400 X)Fig.7 Sample No.24(corn starch)(400 X)注:G. 樣品24;g. 單個玉米淀粉顆粒。

圖8 樣品12、13、25(馬鈴薯淀粉)(400 X)Fig.8 Sample No.12,13,25(potato starch)(400 X)注:H. 樣品12、13、25;h. 單個馬鈴薯淀粉顆粒。

圖9 樣品5、14、15(馬蹄淀粉、馬鈴薯淀粉摻雜)(400 X)Fig.9 Sample No.5,14,15(Water chestnut starch mixed with potato starch)(400 X)注:I. 樣品5、14、15;i-1.單個馬蹄淀粉顆粒;i-2.單個馬鈴薯淀粉顆粒。

圖10 樣品20(摻雜馬蹄淀粉、木薯淀粉)(400 X)Fig.10 Sample No.20(Water chestnut starch mixed with cassava starch)(400 X)注:J. 樣品20;j-1.單個馬蹄淀粉顆粒;j-2.單個木薯淀粉顆粒。

圖11 樣品11(摻雜馬蹄淀粉、玉米淀粉)(400 X)Fig.11 Sample No.11(Water chestnut starch mixed with corn starch)(400 X)注:K. 樣品11;k-1.單個馬蹄淀粉顆粒;k-2.單個玉米淀粉顆粒。

圖12 樣品2、3、6、18、21(摻雜木薯淀粉、玉米淀粉)(400 X)Fig.12 Sample No. 2,3,6,18,21(cassava starch mixed with corn starch)(400 X)注:L. 樣品2、3、6、18、21;l-1.單個木薯淀粉顆粒;l-2.單個玉米淀粉顆粒。

圖13 樣品8、9、17(摻雜木薯淀粉、馬鈴薯淀粉)(400 X)Fig.13 Sample No. 8,9,17(cassava starch mixed with potato starch)(400 X)注:M. 樣品8、9、17;m-1.單個木薯淀粉顆粒;m-2.單個馬鈴薯淀粉顆粒。

圖14 樣品7、22(摻雜馬鈴薯淀粉、木薯淀粉、玉米淀粉)(400 X)Fig.14 Sample No. 7,22(potato starch mixed with cassava starch and corn starch)(400 X)注:N. 樣品7、22;n-1.單個馬鈴薯淀粉顆粒;n-2.單個木薯淀粉顆粒;n-3.單個玉米淀粉顆粒。

如圖5所示,樣品1、4、19、26、27、28、29、30 的顆粒形態(tài)為橢圓形,扁平狀,大顆粒形態(tài)不規(guī)則,多近似多邊形,但部分小顆粒呈水滴狀,形似葵花籽,均為純正馬蹄淀粉顆粒的形態(tài);如圖6所示,樣品10、16、23、31、32的顆粒形態(tài)為大半個球體顆粒,少數(shù)底面為中心凹陷的圓形,多數(shù)底面為多面體錐形或梯形,每個多邊形面的中心稍有凹陷,均為木薯淀粉顆粒的形態(tài);如圖7所示,樣品24的顆粒形態(tài)為多面體形,棱角圓滑,部分小顆粒呈球形,均為玉米淀粉顆粒的形態(tài);如圖8所示,樣品12、13、25的顆粒形態(tài)為表面光滑,大的典型顆粒形似馬鈴薯塊莖,小的近似卵形,未成熟的小顆粒呈球形,有輪紋,均為馬鈴薯淀粉顆粒的形態(tài);如圖9所示,樣品5、14、15的顆粒形態(tài)為橢圓形扁平狀和馬鈴薯塊莖狀,為馬蹄、馬鈴薯兩種淀粉顆粒的混雜;如圖10所示,樣品20的顆粒形態(tài)為橢圓形扁平狀和底面為多面體梯形的大半個球體,為馬蹄、木薯兩種淀粉顆粒的混雜;如圖11所示,樣品11的顆粒形態(tài)為橢圓形扁平狀和棱角圓滑的多面體形,為馬蹄、玉米兩種淀粉顆粒的混雜;如圖12所示,樣品2、3、6、18、21的顆粒形態(tài)為多面體梯形顆粒和棱角圓滑的多面體形,為木薯、玉米兩種淀粉顆粒的混雜;如圖13所示,樣品8、9、17的顆粒形態(tài)為馬鈴薯塊莖狀和多面體梯形,為木薯、馬鈴薯兩種淀粉顆粒的混雜;如圖14所示,樣品7、22的顆粒形態(tài)為馬鈴薯塊莖狀、多面體梯形和棱角圓滑的多面體形,為馬鈴薯、木薯、玉米三種淀粉顆粒的混雜。

不同品種的淀粉顆粒形狀和大小方面存在差異,是判斷淀粉種類的依據(jù)之一[16-23]。目前國內(nèi)外對于摻雜淀粉的鑒別較為準確的方法主要是通過掃描電鏡等高級顯微鏡來觀測、比較它們的顯微結(jié)構(gòu),用形態(tài)學來分析淀粉分子的結(jié)構(gòu)變化和測定淀粉顆粒的大小等,再與標準品對照[24-26]。掃描電鏡要求用到樣品要制成金鍍膜,對設(shè)備要求高,操作復雜,成本昂貴,只能適用于高級實驗室。顯微鏡鏡檢法操作簡便快捷,成本低,但通過顆粒形態(tài)學觀察來對樣品的摻雜比例、濃度的結(jié)果判斷具有一定主觀性和局限性,尤其對于一些形態(tài)上極其相似的淀粉顆粒的區(qū)別(如木薯淀粉和紅薯淀粉均具有半球形、大半球形、球形碎塊樣的顆粒和非球面表面中心凹陷的特征[11]),僅僅通過形態(tài)的判斷仍無法進行區(qū)分。

表1 32個隨機摻雜淀粉樣品檢測結(jié)果

備注:Ct值1表示檢測馬蹄成分的Ct值;Ct值2表示檢測木薯成分的Ct值;Ct值3表示檢測玉米成分的Ct值;Ct值4表示檢測馬鈴薯成分的Ct值。

2.2 32個隨機摻雜淀粉的實時熒光特異性檢測

32個隨機摻雜淀粉樣品的馬蹄成分篩查結(jié)果為13個樣品(1、4、19、26、27、28、29、30、5、11、14、15、20號)呈陽性,19個呈陰性;木薯成分篩查結(jié)果為16個樣品(10、16、23、31、32、2、3、6、7、8、9、18、20、21、17、22號)呈陽性,16個呈陰性;玉米成分篩查結(jié)果為9個樣品(24、11、2、3、6、18、21、7、22號)呈陽性,23個呈陰性;馬鈴薯成分篩查結(jié)果為11個樣品(12、13、25、5、7、8、9、14、15、17、22號)呈陽性,21個呈陰性。

所有淀粉樣品內(nèi)源基因檢測的Ct值見下表1。

32個隨機摻雜淀粉樣品的摻雜情況見表2。實驗選用的32個實驗淀粉樣品均為馬蹄、木薯、玉米、馬鈴薯4種原材料提取的淀粉模擬市場上可能存在的摻雜行為隨機混合所得,具有一定的代表性。

表2 32個隨機摻雜淀粉樣品摻雜情況

顯微鏡鏡檢的結(jié)果和PCR的結(jié)果基本吻合?？梢奝CR檢測方法實用有效。實時熒光PCR檢測方法因為其探針靈敏度高,能通過不同的引物探針來最終區(qū)別這兩種相似淀粉,精密度高,并對淀粉的成分含量有一定的了解。但實時熒光PCR檢測方法也有一定的缺陷,成本相對較高,操作相對復雜。

3 結(jié)論

本研究采用普通的光學生物顯微鏡和熒光PCR鑒定方法,對32個隨機摻雜淀粉的顯微結(jié)構(gòu)進行觀察鑒別和分子鑒別,發(fā)現(xiàn)兩種方法均可以對馬蹄淀粉與木薯淀粉、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉的摻雜進行鑒定。鏡檢法實用方便,操作相對簡單直接,實際工作中,如在流通零售領(lǐng)域的大型菜市場、超市等內(nèi)部的快速檢測實驗室內(nèi)由于檢測環(huán)境條件簡陋,選擇光鏡能更快完成摻雜鑒別[27]。但針對貨值較大的淀粉貿(mào)易行為,則需要靈敏度、精確度更高的熒光PCR鑒定技術(shù)來更科學的完成摻雜鑒別。但由于PCR檢測方法的靈敏度高,使不同淀粉交替生產(chǎn)殘留在同一生產(chǎn)線上造成淀粉的少量無意識混雜等問題混淆鑒定結(jié)果,如何規(guī)范摻雜的范圍、定義及檢測的閾值有待我們下一步深入的研究和探討。

因為顯微鏡技術(shù)和PCR技術(shù)已經(jīng)成熟,所以應用在市面上淀粉摻假實際檢測工作中具有更好的可操作性、實用性和準確性。利用建立的顯微鏡鏡檢法和實時熒光PCR檢測方法,可針對市面上流通的不同環(huán)境條件下的馬蹄類淀粉中的摻假行為選擇更為有效靈活的查驗方法,對國內(nèi)淀粉產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)管有很大的幫助,同時也為打擊市場上用廉價淀粉向高價淀粉摻雜的行為提供技術(shù)支持。

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Application of the detection method by ligh microscopy and RT-PCR in authentication of water chestnut starch

CHEN Zhan-ce1,DU Zhi-xin1,GAO Jia2,LIU Jun-yi1,LUO Zhao-fei1,*

(1.Technology Center of Guangxi Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Nanning 530021,China;2.Nanning Seed Management Station,Nanning 530001,China)

The granular adulterated properties of water chestnut starch were investigated experimentally by using the modem analytical techniques such as Light microscopy and RT-PCR assay. The results showed that eight commercialized samples were pure water chestnut starchs,five in 32 samples were pure tapioca starchs,one was pure corn starch,three were pure potato starchs,three were mixture of water chestnut starch and potato starch,one was mixture of water chestnut starch and tapioca starch,one was mixture of water chestnut starch and corn starch,five were mixture of tapioca starch and corn starch,three were mixture of tapioca starch and potato starch,two were mixture of tapioca starch,corn starch and potato starch. The results using microscopy was consistent with that of RT-PCR assay. Two kinds of detection methods could be used as product quality supervision of domestic starch market.

microscopic method;RT-PCR;water chestnut starch;detection;doping

2016-03-30

陳展冊(1984-)，女，碩士，農(nóng)藝師，研究方向:植物檢疫,E-mail：chenzhance@163.com。

*通訊作者:羅兆飛(1978-)，男，本科，高級獸醫(yī)師，研究方向:食品安全,E-mail：luozf@gxicq.gov.cn。

廣西科技基礎(chǔ)條件平臺建設(shè)項目(12-112-01A)。

TS210.1

A

1002-0306(2016)20-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.20.000