唐治玉,傅博強,盛靈慧,王 晶

(中國計量科學研究院醫(yī)學與生物計量研究所,北京 100029)

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唐治玉,傅博強,盛靈慧,王 晶

(中國計量科學研究院醫(yī)學與生物計量研究所,北京 100029)

針對口香糖、餅干、面包、飲料等食品中添加的代糖成分赤蘚糖醇、木糖醇、山梨糖醇和麥芽糖醇的檢測,建立了水和乙腈為流動相,等度洗脫,氨基色譜柱分離,蒸發(fā)光散射檢測器檢測食品中添加的糖醇含量的高效液相色譜方法。赤蘚糖醇、木糖醇、山梨醇和麥芽糖醇的線性工作范圍分別為0.14～0.49、0.10～0.35、0.10～0.35和0.10～0.35 mg/mL,線性相關系數(shù)R2分別為0.998、0.999、0.999和0.999,對不同類型的食品,四種糖醇的回收率在91.9%～105.2%之間,方法準確度高。室內(nèi)重復性變異系數(shù)一般都低于5%,室間再現(xiàn)性變異系數(shù)一般都低于10%,說明方法的重復性和再線性良好。該方法簡單、便于操作,測定結果準確,適于復雜食品基質中糖醇含量的測定。

食品,糖醇,高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法,含量測定

糖醇是醛糖或酮糖的羧基被還原成羥基的多元羥基化合物,糖醇雖然不是糖,但是具有某些糖的屬性,采用糖醇代替蔗糖的食品的形狀和口感與使用蔗糖類似,但總熱量和甜度減少,因此糖醇取代天然甜味劑蔗糖已成為當今國際食品市場的消費熱點和開發(fā)重點[1]。目前人工合成的用于食品工業(yè)的糖醇包括山梨醇、甘露糖醇、赤蘚糖醇、乳糖醇、木糖醇、麥芽糖醇等。

目前常用的糖醇檢測方法有氣相色譜法[2],氣相色譜法-質譜聯(lián)用法[3],陰離子交換色譜-脈沖安培檢測法[4,5],離子色譜-質譜聯(lián)用法[6],選擇性衍生-毛細管電泳檢測法[7],高效液相色譜法[8-11]和液相色譜-串聯(lián)質譜法[12]等。其中基于氣相色譜、氣相色譜質譜和毛細管電泳檢測的方法,前處理需要對樣品進行衍生化,步驟繁瑣,耗時較長?；陔x子色譜和質譜的方法雖然靈敏度高于液相色譜法,但對普通檢測實驗室的儀器配備提出更高要求。

目前我國測定食品中糖醇的國家標準為GB/T 22222-2008《食品中木糖醇、山梨醇、麥芽糖醇的測定高效液相色譜法》[13],采用等度洗脫,示差折光檢測器檢測。該方法的靈敏度相對較低,基線穩(wěn)定時間長。隨著越來越多基體非常復雜的食品添加多種糖醇,該標準方法出現(xiàn)了一定的不適用性,需要采用梯度洗脫排除基質成分的干擾,并進一步提高靈敏度。蒸發(fā)光散射檢測器可以使用梯度洗脫,靈敏度比示差折光檢測器高一個數(shù)量級。因此,結合國家衛(wèi)計委下達的針對GB/T 22222-2008的食品安全國家標準整合項目,本研究建立了多類食品中4種糖醇的高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測分析方法,并進行了實驗室室內(nèi)和室間的方法驗證。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

三氯乙酸 純度≥99.0% Sigma公司;無水碳酸鈉 分析純,國藥集團化學試劑有限公司;木糖醇、山梨醇、麥芽糖醇、赤蘚糖醇 純度≥99% 美國SUPELCO公司;乙腈 色譜純,Fisher 公司;口香糖、乳酸菌飲料、燕麥餅干、野生藍莓汁、夾心餅干和發(fā)酵面包樣品 市售產(chǎn)品,購自北京市某超市。

Agilent1200高效液相色譜系統(tǒng)(配有四元高壓輸液泵、自動進樣器、柱溫箱、ChemStation色譜工作站和35900E 數(shù)模轉換器)美國Agilent公司;Alltech ELSD 2000ES蒸發(fā)光散射檢測器、AlltechPrevailTMCarbohydrate ES氨基色譜柱 美國Grace公司;空氣壓縮機 北京中惠普分析技術研究所;BS323S電子天平 感量1 mg,德國Sartorious公司;XP504電子天平 感量0.1 mg,瑞士METTLER TOLEDO公司;(10～100) μL可調移液器和(100～1000)μL可調移液器 德國Ephendof公司;EYELA OSB-2100水浴鍋 上海愛明儀器有限公司;KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;3-30K臺式高速冷凍離心機 Sigma公司;Milli-Q超純水制備系統(tǒng) 美國MILLIPORE公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 試劑配制 碳酸鈉溶液(21.2 g/L):稱取2.12 g碳酸鈉,加水溶解并定容至100 mL,現(xiàn)用現(xiàn)配。三氯乙酸溶液(100 g/L):稱取10 g三氯乙酸,加水溶解并定容至100 mL。

1.2.2 糖醇標準溶液的配制 分別準確稱取木糖醇25 mg、山梨醇25 mg、麥芽糖醇25 mg,赤蘚糖醇35 mg,精確至0.1 mg,加水定容至10 mL,每毫升溶液含相當于3.5 mg赤蘚糖醇、2.5 mg木糖醇、2.5 mg山梨醇、2.5 mg麥芽糖醇,作為儲備液,放置4 ℃密封可貯藏1個月。

用移液器分別準確移取各種糖醇標準儲備液40、60、80、100、120、140 μL于液相色譜樣品瓶中混合,用移液器補加水至1 mL,赤蘚糖醇配制成質量濃度分別為0.14、0.21、0.28、0.35、0.42、0.49 mg/mL的混合系列標準工作溶液,木糖醇、山梨醇和麥芽糖醇配制成質量濃度分別為0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35 mg/mL的混合系列標準工作溶液。

1.2.3 液相色譜條件 色譜柱:AlltechPrevailTMCarbohydrate ES氨基色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),保護柱(4.6 mm×20 mm,5 μm);柱溫:30 ℃;流動相:乙腈∶水=80∶20。蒸發(fā)光散射檢測器,漂移管溫度83.5 ℃,霧化氣流速2.2 mL/min。

1.2.4 試樣制備

1.2.4.1 口香糖 取口香糖樣品至少20 g,用刀片切成小碎塊,置于密閉的容器內(nèi)混勻。準確稱取2 g左右切碎的樣品,置于50 mL旋蓋離心管中,加入40 mL水,混勻后置于80 ℃水浴鍋中加熱20 min,每隔5 min振蕩混勻,取出后9000 r/min離心10 min。取8 mL上清液置于10 mL容量瓶中,加水定容、搖勻,0.22 μm濾膜過濾后,稀釋后上機測試。

1.2.4.2 飲料 對非蛋白飲料類,取樣品200 mL,充分混勻,置于密閉的容器內(nèi)。稱取10 g飲料于50 mL容量瓶中,加水定容至50 mL,搖勻,0.22 μm濾膜過濾后,稀釋后上機測試。對蛋白飲料類,取樣品至少200 mL,置于密閉的容器內(nèi)混勻。稱取樣品5 g,置于50 mL容量瓶中,加入35 mL水,搖勻后超聲30 min,每隔5 min振蕩混勻,取出后9000 r/min離心10 min。

沉淀蛋白質:上清液中加入三氯乙酸溶液5 mL,搖勻后室溫放置30 min,9500 r/min離心10 min。取8 mL上清液于10 mL容量瓶中并加水定容,搖勻后取濾液850 μL,加入21.2 g/L碳酸鈉溶液150 μL中和,搖勻。0.22 μm濾膜過濾,稀釋后上機測試。

1.2.4.3 餅干、糕點 取樣品至少200 g,用粉碎機粉碎,置于密閉的容器內(nèi)混勻。稱取粉碎的樣品1～5 g,置于50 mL旋蓋離心管中,加入40 mL水,搖勻后超聲30 min,每隔5 min振蕩混勻,取出后9000 r/min離心10 min。

沉淀蛋白質:上清液中加入三氯乙酸溶液5 mL,搖勻后室溫放置30 min,9500 r/min離心10 min。取8 mL上清液于10 mL容量瓶中并加水定容,搖勻后取濾液850 μL,加入碳酸鈉溶液150 μL中和,搖勻;或取10 mL上清液加入20 mL的乙腈,搖勻后室溫放置30 min,9500 r/min離心10 min,上清定容至50 mL,搖勻。0.22 μm濾膜過濾后,稀釋后上機測試。

1.2.5 方法準確度 稱取適量食品樣品,添加等量的4種糖醇標準物質,按1.2.4的方法進行提取。方法準確度的計算:由標準曲線計算出加標后的食品中糖醇含量,扣除由1.2.4測定得到的對應食品中糖醇含量的平均值,得到糖醇標準物質添加量的計算值,將其與糖醇標準物質的添加量(稱量值)相比,計算得到加標回收率,用回收率表示方法的準確度。

1.2.6 方法的精密度

1.2.6.1 室內(nèi)重復性實驗 以口香糖、野生藍莓汁、高纖燕麥餅干、夾心餅干、全麥吐司面包和乳酸菌飲料六個樣品為驗證樣品,按1.2.4中的方法進行處理,每個樣品做6個平行,計算檢測結果的變異系數(shù),作為室內(nèi)重復性的精密度。

1.2.6.2 室間再現(xiàn)性實驗 以口香糖、野生藍莓汁、高纖燕麥餅干、夾心餅干和乳酸菌飲料為驗證樣品,選取4家食品檢測實驗室均按照1.2.4的方法進行樣品處理和樣品測試,每個樣品做三個平行,取平均值為各實驗室測得的樣品含量,計算4家實驗室檢測結果的變異系數(shù)作為室間再現(xiàn)性的精密度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Agilent ChemStation for LC 3D systems(Rev. B. 04.02)數(shù)據(jù)處理軟件對色譜峰進行面積積分。標準曲線外標法定量。每種檢測樣品均做三個平行,取平均值。

2 結果與討論

2.1 標準曲線及線性范圍

將10 μL標準系列工作液分別注入高效液相色譜儀中,測定系列糖醇混合標準工作溶液中赤蘚糖醇、木糖醇、山梨醇、麥芽糖醇的響應值(峰面積),以濃度的對數(shù)值為橫坐標,糖醇峰面積的對數(shù)值為縱坐標,分別繪制4種糖醇的標準工作曲線。標準曲線圖譜見圖1～圖4。

圖1 赤蘚糖醇標準曲線圖Fig.1 Curve of erythritol standard

圖2 木糖醇標準曲線圖Fig.2 Curve of xylitol standard

圖3 山梨醇標準曲線圖Fig.3 Curve of sorbitol standard

圖4 麥芽糖醇標準曲線圖Fig.4 Curve of maltitol standard

實驗結果表明,赤蘚糖醇在0.35～1.35 mg/L,木糖醇、山梨醇和麥芽糖醇在0.25～0.95 mg/L范圍時,標準工作曲線的線性相關系數(shù)R2分別為0.998、0.999、0.999和0.999,濃度與峰面積的線性關系良好。

2.2 液相色譜分析結果

將10 μL試樣溶液注入高效液相色譜儀中,測定試樣的響應值(峰面積)。根據(jù)標準曲線計算樣品溶液中木糖醇、山梨醇、麥芽糖醇、赤蘚糖醇的濃度。混合標準和典型樣品的液相分析色譜圖見圖5～圖7。

圖5 赤蘚糖醇、木糖醇、山梨醇和麥芽糖醇混合標準的液相色譜圖Fig.5 HPLC chromatograph of erythlitol,xylitol,sorbitol and maltitol mixture standard

圖6 口香糖樣品的液相色譜圖Fig.6 HPLC chromatograph of chewing gum

圖7 糖醇全麥面包樣品的液相色譜圖Fig.7 HPLC chromatograph of whole wheat bread with xylitol

2.3 檢出限和定量限

依據(jù)The Fitness for Purpose of Analytical Methods—A Laboratory Guide to Method Validation andRelated Topics,對方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)進行計算,赤蘚糖醇、木糖醇、山梨醇和麥芽糖醇的檢出限分別為0.04、0.01、0.02和0.03,定量限分別為0.12、0.03、0.05和0.07 g/100 g。

2.4 準確度

采用添加糖醇標準測定回收率的方法計算方法的準確度,分別測定口香糖、野生藍莓汁、高纖燕麥餅干、夾心餅干、全麥吐司面包和活性乳酸菌飲料樣品中糖醇測定的加標回收率,結果見表2。數(shù)據(jù)表明,赤蘚糖醇、木糖醇、山梨醇、麥芽糖醇的回收率在91.9%～105.2%之間,說明該方法準確度好。

表2 食品樣品中四種糖醇含量測定的回收率(n=3)

表1 四種糖醇的檢出限和定量限結果

表3 食品樣品中四種糖醇含量測定的室內(nèi)重復性實驗結果(g/100 g)

表4 食品樣品中糖醇含量測定的室間再現(xiàn)性實驗結果(g/100 g)

表5 方法的重復性限和再現(xiàn)性限

2.5 方法的精密度實驗

2.5.1 室內(nèi)重復性實驗 以口香糖、野生藍莓汁、高纖燕麥餅干、夾心餅干、全麥吐司面包和乳酸菌飲料六個樣品為驗證樣品,由本實驗室完成了驗證,具體實驗結果如表3所示。

2.5.2 室間再現(xiàn)性實驗 以口香糖、野生藍莓汁、高纖燕麥餅干、夾心餅干和乳酸菌飲料為驗證樣品,4家有資質的檢測實驗室完成了方法的實驗室間驗證。實驗結果如表4所示。

由表5可見,所有樣品的重復性和再現(xiàn)性變異系數(shù)都低于10%,重復性和再現(xiàn)性良好。在不同實驗室,由不同操作者使用不同的設備,按相同的分析方法,對同一樣品獨立進行測試獲得的兩次獨立測試結果的絕對差值不得超過表5中列出的再現(xiàn)性限R的10%。

3 結論

本研究建立的高效液相色譜方法可以將赤蘚糖醇、木糖醇、山梨醇、麥芽糖醇與復雜食品中的干擾成分如葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、乳糖等糖類和其他雜質在色譜柱上實現(xiàn)有效分離。方法簡單、易于掌握,測定結果準確,可以滿足食品生產(chǎn)企業(yè)質量控制和質檢部門進行市場監(jiān)管的需求。形成的檢測國家標準將為食品營養(yǎng)標簽中4種糖醇含量的測定提供檢測依據(jù)。

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Study on the determination of sugar alcohols in foods by high performance liquid chromatography-evaporative light scattering detection

TANG Zhi-yu,FU Bo-qiang+,SHENG Ling-hui,WANG Jing*

(Division of Medical and Biological Measurements,National Institute of Metrology,Beijing 100029,China)

A high performance liquid chromatography-evaporative light scattering detection(HPLC-ELSD)method had been developed for the determination of erythritol,xylitol,sorbitol and maltitolinchewing gum,biscuits,bread and beverage. The sugar alcohols in foods were separated on amino column by isocratic elution with acetonitrile-water solution(80∶20,V∶V). The linear range of standard working curve for erythritol,xylitol,sorbitol and maltitol were 0.14～0.49 mg/mL,0.10～0.35 mg/mL,0.10～0.35 mg/mL and 0.10～0.35 mg/mL,with linear correlation coefficient(R2)of 0.998,0.999,0.999 and 0.999,respectively.For different kinds of food,the recovery of four kinds of sugar alcohols were in the range of 91.9%～105.2%. The coefficient of variations of intra-laboratory repeatability and inter-laboratory reproducibility were less than 5% and 10%,respectively. This method was simple,easy to grasp and accurate in the determination of sugar alcohols in complex food matrix.

foods;sugar alcohols;high performance liquid chromatography-evaporative light scattering detection;determination

2016-03-11 +并列第一作者

唐治玉(1979-),女,碩士,工程師,研究方向:生物計量,E-mail:tangzhy@nim.ac.cn。

傅博強(1975-),男,博士,副研究員,研究方向:生物計量,E-mail:fubq@nim.ac.cn。

國家衛(wèi)計委食品安全國家標準整合項目(ZHENGHE-2014-308)。

TS207.3

A

1002-0306(2016)20-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.20.000

*通訊作者:王晶(1968-),女,博士,研究員,研究方向:生物計量,E-mail:wj@nim.ac.cn。