胡金強,雷俊婷,白艷紅,魏向珂,景建洲,高 輝,孫新城,董彩文,耿 堯,姜春鵬

(1.鄭州輕工業(yè)學院食品與生物工程學院,河南鄭州 450002;2.河南省食品安全國際聯(lián)合實驗室,河南鄭州 450002;3.食品生產(chǎn)與安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心,河南鄭州 450002)

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胡金強,雷俊婷,白艷紅,魏向珂,景建洲,高 輝,孫新城,董彩文,耿 堯,姜春鵬

(1.鄭州輕工業(yè)學院食品與生物工程學院,河南鄭州 450002;2.河南省食品安全國際聯(lián)合實驗室,河南鄭州 450002;3.食品生產(chǎn)與安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心,河南鄭州 450002)

針對食品中金黃色葡萄球菌檢測,選取金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶nuc基因作為靶標,利用地高辛標記引物擴增的PCR產(chǎn)物與生物素標記的探針雜交,然后與ELISA平板上的鏈霉素雜交,通過抗地高辛抗體顯色建立PCR-ELISA檢測技術。應用該方法檢測人工污染牛奶中金黃色葡萄球菌,同時將大腸埃希氏菌、沙門氏菌、志賀氏菌、單增李斯特菌等常見食源性致病菌作為陰性對照。結果顯示,金黃色葡萄球菌的純培養(yǎng)物以及人工污染金黃色葡萄球菌牛奶,金黃色葡萄球菌為陽性,其他對照菌為陰性,兩者PCR-ELISA檢測敏感性均為101CFU/mL,比普通PCR檢測的敏感性(103CFU/mL)高100倍。因此,該研究建立的PCR-ELISA方法具有良好的特異性與敏感性,能夠特異、敏感、準確地檢測牛奶中的金黃色葡萄球菌,為食品中金黃色葡萄菌的快速鑒定、風險評估與有效監(jiān)測提供重要技術手段。

金黃色葡萄球菌,PCR-ELISA,檢測

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,以下簡稱金葡菌)是一種人畜共患食源性致病菌,可引起肺炎、偽膜性腸炎與膿毒血癥等化膿性疾病以及細菌性食物中毒。據(jù)美國疾病預防控制中心報告,在美國,金黃色葡萄球菌僅次于大腸桿菌占整個細菌性食物中毒的33%,在加拿大占45%,一些歐洲國家如芬蘭、匈牙利等高達50%以上[1]。在我國食品安全事件中,金黃色葡萄球菌引發(fā)的食源性疾病占相當大的比重[2]。由此可見,金黃色葡萄球菌在全世界廣泛分布并造成成千上萬例的人類疾病,導致嚴重的公共安全問題,對人類健康和經(jīng)濟社會造成極大危害。

綜上,金黃色葡萄球菌導致食源性疾病,是食品安全問題的重要隱患,迫切需要建立特異、敏感、高效的快速檢測技術,減少食品安全事件的發(fā)生。針對食品中金黃色葡萄球菌檢測,無論是國際標準(ISO 6888-1、ISO 6888-2、AOAC 2003.07、AOAC 575.55)還是國家標準(GB/T 4789.10-2010)多采用的是傳統(tǒng)平板培養(yǎng)法結合生物化學方法或者免疫學方法。這些技術手段存在樣品處理繁瑣、測定周期長、敏感性與特異性不高等諸多缺陷,已不能滿足食品安全對金黃色葡萄球菌快速檢測的需求[3]。在此背景下,迫切需要建立金黃色葡萄球菌新型檢測技術手段。PCR-ELISA技術是近年來發(fā)展起來的分子檢測技術,整合了ELISA敏感性與PCR特異性的雙重優(yōu)勢,適用于食源性微生物的快速檢測(圖1)[4-7]。然而到目前為止,應用PCR-ELISA技術檢測金黃色葡萄球菌鮮見文獻報道。為此,建立食品中金黃色葡萄球菌快速、簡便、特異的PCR-ELISA檢測技術,預防與控制金黃色葡萄球菌引發(fā)的食品安全問題具有重要的理論與現(xiàn)實意義。

圖 1 PCR-ELISA實驗原理Fig.1 Experimental principle of PCR-ELISA

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金葡菌(Staphylococcusaureus,CGMCC 1.1361)、大腸桿菌O157∶H7(EscherichiacoliO157∶H7,ATCC 43895)、大腸埃希氏菌(Escherichiacoli,CICC 10032)、單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes,ATCC 15313)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium,CGMCC 1.1194)、腸炎沙門氏菌(Salmonellaenteritidis,ATCC 50041)、痢疾志賀氏菌(Shigelladysenteriae,CGMCC 1.1869) 本實驗室保存;普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒、Taq DNA聚合酶、dNTPs(10 mmol/L)、10×buffer 緩沖液、6×Glycerol Gel Loading Dye II、100 bp DNA Ladder-H1、鏈霉親和素、牛血清白蛋白(BSA)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB) 上海生工公司;HRP標記小鼠抗地高辛單克隆抗體 美國Jackson公司;地高辛標記的引物與生物素標記的探針 委托上海生工公司合成;超高溫滅菌純牛奶 當?shù)爻?其他試劑 均為化學分析純。

高速冷凍離心機、微量移液器 美國Eppendorf公司;恒溫水浴鍋、超凈工作臺、生化恒溫培養(yǎng)箱 上海智城公司;超微量分光光度計Nanodrop2000 美國Thermo公司;梯度PCR擴增儀 美國ABI公司;EDAS290凝膠成像系統(tǒng) 美國柯達公司;電泳儀、酶標儀、洗板機 美國Bio-Rad公司;Bullet Blender組織細胞破碎儀 美國Next Advence公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株活化 取-80 ℃凍存金葡菌、大腸桿菌 O157∶H7、大腸埃希氏菌、腸炎沙門氏菌、單增李斯特菌、鼠傷寒沙門氏菌、痢疾志賀氏菌等7株標準菌株,每種菌株挑取1環(huán)接種于4 mL普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液中,37 ℃搖床培養(yǎng)24 h,接種針劃線接種于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)24～48 h。以無菌牙簽挑取單個菌落,接種于普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液中,37 ℃搖床培養(yǎng)12～16 h。

1.2.2 細菌基因組DNA提取 取1.2.1中普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液2 mL,按Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒提取細菌基因組。基因組DNA應用超微量分光光度計進行定量。

1.2.3 引物設計 根據(jù)金葡菌耐熱核酸酶nuc基因序列(GenBank no V01281)保守片段(437 bp),采用Primer Primier 5.0軟件設計特異性引物與探針。上游引物:SA-F:5′-GCGATTGATGGTGATACG GT-3′(511-530bp),5′端標記地高辛;下游引物:SA-R:5′-TGCCACTAGCAGCAGTGACA-3′(928-947bp);捕獲探針5′-ATGCACTTGCTTCAGGACCATAT-3′,3′端標記生物素。引物與探針由上海生工公司合成。

1.2.4 Nuc特異性保守片段擴增 PCR反應體系(25 μL):10×PCR buffer 2.5 μL,10 mmol/L dNTPs 0.5 μL,25 mmol/L Mg2+1.5 μL,Taq DNA聚合酶0.5 μL,DNA模板1 μL,25 μmol/L上下游引物各1 μL,ddH2O 17 μL。PCR反應條件:94 ℃預變性5 min,94 ℃ 30 s,53 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,30個循環(huán),最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物應用1.5%瓊脂糖凝膠,90 V電壓電泳40 min,分析電泳結果。

1.2.5 地高辛標記PCR產(chǎn)物的ELISA檢測 將含有10 mg/L鏈霉親和素的包被液(Na2CO31.6 g、NaHCO32.9 g、NaN30.2 g、蒸餾水加至1 L,pH調至9.8,高壓滅菌)以200 μL/孔加入微孔板,4 ℃在濕盒中包被過夜。取出后棄去液體,每孔加200 μL的0.05% PBST緩沖液,洗滌5次,每次5 min。

將含1% BSA以200 μL/孔加入微孔板,于37 ℃溫育1 h進行封閉。棄去封閉液,每孔加250 μL的0.05% PBST緩沖液,洗滌5次,每次5 min。

40 μL變性液(0.1 mol/L NaOH、0.3 mol/L NaCl)與5 μL地高辛標記的產(chǎn)物混勻,室溫放置40 min,加入200 μL生物素標記探針(10 pmol/L),混勻。在96孔板中每孔加入200 μL雜交反應液,55 ℃溫育2 h。然后每孔加入250 μL PBST緩沖液,洗滌5次,每次5 min。

每孔加入50 μL PBS稀釋的HRP標記小鼠抗地高辛單克隆抗體(100 U/mL),37 ℃孵育30 min。每孔加250 μL PBST緩沖液,洗滌5次,每次5 min。

每孔加入50 μL 1 mg/mL TMB底物顯色液(A液:CH3COONa 13.6 g,C6H8O71.6 g,30% H2O20.3 mL,蒸餾水加至500 mL;B液:C10H14N2Na2O8·2H2O 0.2 g,C6H8O70.95 g,C3H8O350 mL,取0.15 g TMB溶解于3 mL DMSO,蒸餾水加至500 mL)。使用前,底物顯色A、B液以相同體積比混合,室溫避光放置10 min。

最后,每孔加入20 μL濃度2 mol/L H2SO4終止液,終止顯色。在酶標儀上,讀取450 nm處的光密度值。實驗設立陰性與空白對照。

1.2.6 特異性實驗 分別應用大腸桿菌O157∶H7、大腸埃希氏菌、單增李斯特菌、鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、痢疾志賀氏菌等食品中常見致病菌進行特異性實驗。分別以這7種細菌的基因組為模板,用金黃色葡萄球菌特異性引物進行擴增,電泳觀察是否出現(xiàn)目的條帶。

1.2.7 敏感性實驗 按照1.2.1所述步驟將金黃色葡萄球菌接種于LB液體培養(yǎng)基中,搖床上37 ℃培養(yǎng)過夜。選取1×107CFU/mL(平板計數(shù)法測定)的細菌懸液1 mL加至9 mL無菌生理鹽水中,10倍梯度稀釋,共8個稀釋度,對每個稀釋度進行平板計數(shù)。不同稀釋度菌液取1 mL提取基因組進行PCR擴增(含菌量依次為107、106、105、104、103、102、101、100CFU/mL),電泳檢測。然后將不同稀釋度PCR產(chǎn)物進行ELISA實驗(含菌量依次為107、106、105、104、103、102、101、100CFU/mL)。確定PCR-ELISA檢測金黃色葡萄球菌的敏感性以及與普通PCR方法的敏感性差異。

1.2.8 PCR-ELISA方法的結果判定 每份樣品設3個重復,取三孔平均值減去陰性樣品本底值確定為樣品的吸光度值。對于陰性對照,吸光度值應低于0.2。對于檢測樣本,吸光度值和陰性本底吸光度值之差高于0.2,則可判定為陽性結果[6,8]。

1.2.9 PCR-ELISA檢測方法的應用評估 按照1.2.7所述步驟10倍倍比稀釋的金黃色葡萄球菌懸液分別加入經(jīng)超高溫滅菌純牛奶中。對于人工污染金黃色葡萄球菌的24份牛奶樣品(樣品分為8組,每組3個重復,8組的含菌量分別為107、106、105、104、103、102、101、100CFU/mL),進行PCR檢測與PCR-ELISA檢測。

2 結果與分析

2.1 PCR方法的特異性分析

按照1.2.4所述的PCR反應體系與反應條件,對大腸桿菌O157、大腸埃希氏菌、單增李斯特菌、鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、痢疾志賀氏菌進行PCR方法的特異性實驗。電泳結果顯示,僅金葡菌可擴增出條帶,其他致病菌均無擴增條帶(圖2),說明該引物對于金黃色葡萄球菌是特異性的。

圖2 金葡菌PCR檢測方法的特異性Fig.2 Specificity of PCR detection for Staphylococcus aureus注:M. 100bp DNA Ladder-H1;1.大腸桿菌O157(ATCC 43895);2.大腸埃希氏菌(CICC 10032);3.單增李斯特菌(ATCC 15313);4.鼠傷寒沙門氏菌(CGMCC 1.1194);5.腸炎沙門氏菌(ATCC 50041);6.痢疾志賀氏菌(CGMCC 1.1869);7.陰性對照;8. 金黃色葡萄球菌(CGMCC1.1361)。

2.2 PCR方法的敏感性分析

取高辛標記的系列稀釋度PCR產(chǎn)物各5 μL,進行金葡菌PCR方法的實驗(含菌量依次為107、106、105、104、103、102、101、100CFU/mL)。PCR方法的敏感性為103CFU/mL。PCR方法的檢測結果見圖3。

圖3 PCR敏感性分析 Fig.3 Sensitivity analysis of PCR注:M. 100bp DNA Ladder-H1;1.含菌量107 CFU/mL;2.含菌量106 CFU/mL;3.含菌量105 CFU/mL;4.含菌量104 CFU/mL;5.含菌量103 CFU/mL;6.含菌量102 CFU/mL;7.含菌量101 CFU/mL;8.含菌量100 CFU/mL;9.陰性對照;10.空白對照。

2.3 PCR-ELISA方法的特異性分析

以滅菌超純水為空白對照,對大腸桿菌O157∶H7、大腸埃希氏菌、單增李斯特菌、鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、痢疾志賀氏菌進行PCR-ELISA特異性實驗。結果表明,只有金黃色葡萄球菌檢測為陽性,其他結果均為陰性(表1)。

2.4 PCR-ELISA方法的敏感性分析

取細菌懸液系列稀釋的地高辛標記的PCR產(chǎn)物各5 μL,進行金黃色葡萄球菌PCR-ELISA方法的實驗(含菌量依次為含菌量依次為107、106、105、104、103、102、101、100CFU/mL)。如表2所示,PCR-ELISA方法的敏感性為101CFU/mL,比PCR方法敏感性高100倍。

表1 PCR-ELISA特異性

注:+:陽性;-:陰性;表2同。

表2 PCR-ELISA敏感性

2.5 PCR-ELISA檢測方法應用

對人工污染金葡菌24份牛奶樣品進行金葡菌分離培養(yǎng)和純培養(yǎng),應用本實驗建立的PCR-ELISA方法檢測人工污染牛奶的金葡菌。結果顯示,人工污染不同濃度金黃色葡萄球菌牛奶的PCR與PCR-ELISA方法的檢測下限分別與分離純培養(yǎng)的PCR與PCR-ELISA方法檢測下限一致(表3)。

表3 PCR與PCR-ELISA檢測結果對比

3 結論

應用PCR-ELISA方法檢測金黃色葡萄球菌結果為陽性,檢測大腸桿菌O157、大腸埃希氏菌、單增李斯特菌、鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、痢疾志賀氏菌的結果為陰性。建立的金黃色葡萄球菌PCR-ELISA檢測方法特異性強。應用PCR-ELISA方法檢測金黃色葡萄球菌的敏感性為101CFU/mL,比PCR方法敏感性高100倍。應用PCR-ELISA方法檢測人工污染不同濃度金黃色葡萄球菌的牛奶,與分離純培養(yǎng)檢測金黃色葡萄球菌的檢測下限一致,敏感性為101CFU/mL。

4 討論

金黃色葡萄球菌能夠在敏感型群體內引起呼吸道疾病,是我國細菌性食物中毒病例中的第三大食源性致病菌[9-10]。金黃色葡萄球菌對食品安全造成巨大安全隱患,迫切需要先進的檢測方法。PCR-ELISA 方法結合了PCR、核酸雜交與ELISA 三種技術的優(yōu)點,能夠實現(xiàn)了快速、準確、定量檢測病原微生物[11]。

本研究每次實驗均設置3個陰性對照孔,取吸光度平均值,避免各實驗孔交叉污染,能夠有效防止陰性對照吸光值超過0.1,進一步降低了實驗誤差。以1%的牛血清白蛋白(BSA)包被微孔板,相對于龍軍[12]等應用5%的BSA包被微孔板檢測金黃色葡萄球菌,降低大量檢測時高價試劑的消耗。相對于傳統(tǒng)PCR方法,通過標記引物與探針,使得PCR-ELISA方法的特異性更強,有效避免實驗中假陰性與假陽性的出現(xiàn),提高了實驗結果的客觀性和重現(xiàn)性。本實驗建立的金黃色葡萄球菌PCR-ELISA檢測方法特異性強,敏感性為101CFU/mL,比常規(guī)PCR方法的敏感性高100倍,能夠大幅提高食品微生物檢驗工作的高效性、準確性與可靠性。比文獻報道[13]的同類方法檢測產(chǎn)志賀毒素大腸埃希氏菌的敏感性高10倍,本文將引物上游5′端標記地高辛,捕獲探針3′段標記生物素,再加入HRP標記的抗地高辛抗體進行抗原抗體反應,進而提高PCR-ELISA檢測金黃色葡萄球菌的敏感性。采用人工污染金黃色葡萄球菌的牛奶樣品進行PCR-ELISA檢測,其檢測下限與分離純培養(yǎng)的PCR-ELISA方法的檢測下限一致,說明該方法具有較強的使用與推廣價值。實驗全過程只需5～6 h,能夠滿足食品樣品中金葡菌快速需求[14-16]。

本研究中所采用方法可應用于臨床診斷、食品衛(wèi)生監(jiān)控及出口食品的病原微生物檢測等各個領域,可為食品致病菌檢測提供技術支持,同時為建立食品中致病菌新的快速篩選奠定良好基礎。PCR-ELISA檢測優(yōu)于PCR檢測的特點:a.快速。獲得PCR產(chǎn)物后,ELISA檢測約需6 h,而瓊脂糖凝膠電泳檢測約需2～3 h。由于PCR-ELISA在增菌12 h與PCR在增菌20 h的檢測敏感性相當,檢測時間仍然縮短了4 h;b.安全。ELISA檢測所用試劑對人體較安全,避免了瓊脂糖凝膠電泳的EB污染;c.高通量。每塊微孔板有96個檢測孔,而PCR檢測受電泳槽、加樣槽的大小等限制,檢樣量相對較小。本實驗建立的金葡菌PCR-ELISA檢測方法操作簡便、檢測周期短、特異性強、檢出限低、檢測結果客觀準確。由于采用96孔板,除陽性對照、陰性對照及空白對照外,每板可檢測45份樣品。同時微孔板體積小,可批量操作,很適合大量樣品的快速篩檢,具有較高的推廣應用價值。

PCR-ELISA檢測技術的發(fā)展使定量檢測成為可能,廣泛應用于病原體、轉基因產(chǎn)品等評價及早期腫瘤的診斷[17]。本研究建立的金黃色葡萄球菌PCR-ELISA檢測方法可應用于臨床診斷、食品衛(wèi)生監(jiān)控及進出口食品的病原微生物檢測等各個領域,為食品致病菌檢測提供技術支持,為食品安全保駕護航。

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Establishment of PCR-ELISA technology forStaphylococcusaureusin food

HU Jin-qiang1,2,3,Lei Jun-ting1,BAI Yan-hong1,WEI Xiang-ke1,JING Jian-zhou1,GAO Hui1,SUN Xin-cheng1,DONG Cai-wen1,GENG Yao1,JIANG Chun-peng1

(1.School of Food and Bioengineering,Zhengzhou University of Light Industry,Zhengzhou 450002,China;2.Henan International Joint Laboratory of Food Safety,Zhengzhou 450002,China;3.Collaborative Innovation Center of Food Production and Safety,Zhengzhou 450002,China)

The nuc gene was as a target to detectStaphylococcusaureusin food. The PCR products were hybridized with digoxin-labeled probes,and then with streptomycin in microwell plate. PCR-ELISAmethod had been established by chromogenic reaction with anti-digoxin antibody. This method was applied to detectStaphylococcusaureusin milk artificially contaminated withStaphylococcusaureus,while other bacteria strains,includingEscherichiacoli,Salmonella,Shigella,Listeriamonocytogeneswere as negative controls. The results showed that for the pure culture and artificially contaminated milk,Staphylococcusaureuswere positive,while negative for negative controls. The sensitivity of detection ofStaphylococcusaureusfor the pure culture and artificially contaminated milk were 101CFU/mL,a 100-fold higher than that of conventional PCR method(103CFU/mL). Therefore,PCR-ELISA established in this study for detection ofStaphylococcusaureusin milk sample was specifically,sensitively and accurately,which should provide an important technical means for rapid identification,risk assessment and effective monitoring ofStaphylococcusaureusin food.

Staphylococcusaureus;PCR-ELISA;detection

2016-03-08

胡金強(1979-),博士,副教授,研究方向:病原生物學、免疫學與食品安全,E-mail:jqhu@hotmail.com。

國家自然科學基金(31201901)、教育部留學回國人員科研啟動基金(第46批,教外司留[2013]693號);河南省高校青年骨干教師資助計劃項目(教高[2015]1032號);河南省教育廳科學技術重點研究項目(14A180025);鄭州市科技攻關項目(20130857);鄭州輕工業(yè)學院博士基金項目(2011BSJJ033);鄭州輕工業(yè)學院青年骨干教師資助計劃項目(2013QNGG02);鄭州輕工業(yè)學院研究生創(chuàng)新基金項目(2014031);食品生產(chǎn)與安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心研究生創(chuàng)新基金項目(FCICY201614)。

TS

A

1002-0306(2016)20-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.20.000