李建宏，李雪萍，馬文文，姚拓*，孫建軍，蔣永梅，張建貴，師尚禮

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070；3.臨洮縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，甘肅 臨洮 730500)

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東祁連山高寒草地幾種禾本科牧草根際促生菌研究

李建宏1,2，李雪萍1,2，馬文文1,2，姚拓1,2*，孫建軍3，蔣永梅1,2，張建貴1,2，師尚禮1,2

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070；3.臨洮縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，甘肅 臨洮 730500)

本研究以東祁連山高寒草地常見的7種禾本科牧草為材料，通過分離培養(yǎng)的方法研究了其根際細(xì)菌的數(shù)量和分布，重點(diǎn)研究了其有固氮作用的細(xì)菌數(shù)量和分布。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，7種植物根際均存在大量的細(xì)菌，總數(shù)在2.50×106～17.07×106cfu/g，不同植物根際細(xì)菌的數(shù)量和分布不同，以高原早熟禾根際細(xì)菌數(shù)量最多，冰草和賴草根際細(xì)菌最少，其余禾草居中；根際固氮菌的數(shù)量和分布也因牧草種類不同而不同。7種供試植物根際分離到固氮菌201株。且細(xì)菌和PGPR菌株的數(shù)量均呈現(xiàn)“根系表面(RP)>根際土壤(RS)>根內(nèi)(HP)”的分布趨勢，表現(xiàn)出強(qiáng)烈的根際效應(yīng)。

禾草；PGPR；聯(lián)合固氮菌

禾本科牧草是最重要的飼草飼料作物，不論是分布范圍、面積，還是經(jīng)濟(jì)價(jià)值、生態(tài)意義，均顯示出其他科植物無法比擬的優(yōu)點(diǎn)。但該科植物對(duì)氮需求量較大，氮供應(yīng)量直接影響其生存狀況與功能發(fā)揮。為了滿足禾本科植物生存、生產(chǎn)所需要的氮素營養(yǎng)，化肥一直被認(rèn)為是實(shí)現(xiàn)這一目的的主要途徑，然而在經(jīng)濟(jì)落后且土地貧瘠的西北地區(qū)，在草地上大量使用高成本化肥在某種程度上說是一種“奢望”。而且隨著化肥使用量的增加，土壤和植物中的NO2-積累，大量磷素被固定，導(dǎo)致了肥效下降，肥料利用率降低，環(huán)境污染加重，人、畜及食品安全難以保障，土壤結(jié)構(gòu)及微生物多樣性的破壞等一系列問題。因此，研究開發(fā)對(duì)環(huán)境友好的新型肥料來替代化肥就是一項(xiàng)十分迫切的任務(wù)。

研究表明，植物根際生存著許多對(duì)植物生長有益的細(xì)菌，它們生活在土壤或定植于植物根表、根內(nèi)，在其生長代謝過程中能產(chǎn)生許多促進(jìn)植物生長的物質(zhì)。這類細(xì)菌被稱為植物生長促進(jìn)菌(plant growth promoting rhizobacteria，簡稱PGPR)。這類菌一般指具有固氮、解磷、產(chǎn)生植物激素和分泌抗生素等能力或至少具有其中一種能力的細(xì)菌、藍(lán)細(xì)菌等[1-2]。PGPR是寶貴的生物資源，其發(fā)現(xiàn)及分離培養(yǎng)、篩選將為禾本科植物固氮、溶磷、產(chǎn)生植物激素、分泌抗生素的研究及生物菌肥的開發(fā)起到巨大的作用。PGPR菌株不僅可以促進(jìn)植物生長、提高作物產(chǎn)量和質(zhì)量，還可以改善土壤結(jié)構(gòu)，提高土壤有機(jī)質(zhì)含量，改良鹽堿地。如榮良燕等[3]的研究結(jié)果顯示PGPR菌可以提高岷山紅三葉(Trifoliumpratense)的干草產(chǎn)量以及干草中的粗蛋白含量，降低纖維含量，從而提高其產(chǎn)量和質(zhì)量；劉方春等[4]的研究則證實(shí)了PGPR生物肥的施用提高了甜櫻桃(Prunusavium)根際土壤中養(yǎng)分離子的有效性和養(yǎng)分保持能力，促進(jìn)了表層土壤中根系的生長。因此，PGPR資源的開發(fā)利用已成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)[5]。

祁連山位于我國青海省東北部與甘肅省西部邊境，是我國主要山脈之一。1988年經(jīng)國務(wù)院批準(zhǔn)建立 “祁連山國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)”(2015年1月獲批國家環(huán)?？破栈?。祁連山具有涵養(yǎng)水源、調(diào)節(jié)氣候、保護(hù)綠洲、防治荒漠、固持土壤、保護(hù)物種和儲(chǔ)存基因等重要的生態(tài)功能，是國際生物多樣性保護(hù)的重點(diǎn)區(qū)域，也是國家生態(tài)安全格局“北方防沙帶”中重要的一環(huán)，我國草地學(xué)家對(duì)其資源的開發(fā)利用、防止退化及提高草地生產(chǎn)力等方面進(jìn)行了廣泛的研究，取得了多項(xiàng)重要理論和實(shí)踐成果，并已廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)[6]。但對(duì)于微生物資源研究較少，尤其是對(duì)禾本科牧草聯(lián)合固氮菌資源狀況很少見諸報(bào)道。因此，研究和開發(fā)該地區(qū)促生菌(PGPR)資源，進(jìn)而開發(fā)出適宜于該地區(qū)的微生物肥料制品，對(duì)于解決該地區(qū)天然草地肥料的供給，實(shí)現(xiàn)農(nóng)牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重大意義。

為了探索和發(fā)掘新的生物資源，本研究從東祁連山高寒草地主要禾本科牧草根際分離篩選促生菌，并對(duì)其特性進(jìn)行研究和評(píng)價(jià)，為進(jìn)一步開發(fā)利用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于甘肅省武威市天祝藏族自治縣抓喜秀龍溝甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)高山草原試驗(yàn)站(坐標(biāo)為N 37°11′-37°13′，E 102°29′-102°33′)，海拔為2960～2990 m，氣候寒冷潮濕，年均溫-0.1 ℃，>0 ℃年積溫1380 ℃，水熱同期，年平均降水量416 mm，多為地形雨，集中于7-9月，年蒸發(fā)量1592 mm。年日照時(shí)數(shù)2600 h；無絕對(duì)無霜期，僅分冷、熱兩季。植被以早熟禾(Poaspp.)、嵩草(Kobresiabellardii)、苔草(Carexspp.)、針茅(Stipacapillata)、金露梅(Potentillafruticosa)、珠芽蓼(Polygonumviviparum)、棘豆(Oxytropisspp.)、委陵菜(Potentillachinensis)、甘肅馬先蒿(Pediculariskansuensis)等為主。土壤以亞高山黑鈣土、亞高山草甸土為主，有機(jī)質(zhì)含量10%～16%，水分含量40%～80%，全磷含量0.056%～0.071%，全氮含量0.5%～0.8%，pH為7.0～8.2[7]。

1.2 樣品采集與處理

于2015年7月在研究區(qū)采集當(dāng)?shù)剌^常見的高原早熟禾(Poaalpigena)、垂穗披堿草(Elymusnutans)、醉馬草(Achnatheruminebrians)、賴草(Leymussecalinus)、冰草(Agropyroncristatum)、紫花針茅(Stipapurpurea)和糙毛鵝觀草(Roegneriahirsuta)7種禾本科植物根際樣品(包括植物根系和土壤)，將取得樣品裝入無菌聚乙烯袋中，低溫運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室立即進(jìn)行PGPR 菌株分離。

分離時(shí)為了方便研究細(xì)菌在植物根際的分布，將根際分為根際土壤(soil adhering to roots, RS)、根系表面(rhizoplan or surface of roots,RP)與根內(nèi)(histoplan or interior of roots，HP)3個(gè)區(qū)域[8]。

1.3 不同植物根際細(xì)菌的數(shù)量與分布測定

植物根際細(xì)菌的數(shù)量測定與分離用涂布平板法，培養(yǎng)基選用NA 培養(yǎng)基[9]。稱取樣品1 g，放入裝有9 mL 0.85%無菌生理鹽水中，800 r/min震蕩2 min，靜置20 min后取上清液，然后依次稀釋至10-3、10-4、10-5，充分混勻后吸取50 μL接種于NA平板固體培養(yǎng)基上，每個(gè)區(qū)域的每個(gè)梯度稀釋液各重復(fù) 3 次，用無菌涂布器涂抹均勻，28～30 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)菌的數(shù)量。計(jì)算公式如下：

細(xì)菌數(shù)量(cfu/g)=(菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù))/干土

NA培養(yǎng)基配方為：蛋白胨 5.0 g，牛肉膏 3.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂 18.0 g，總體積 1000 mL，pH 7.0～7.2。

1.4 聯(lián)合固氮菌的分離與純化

在NFM培養(yǎng)基[9]表面運(yùn)用涂布平板法分離純化不同植物不同部位的聯(lián)合固氮菌。分別取已制備的3個(gè)區(qū)域的10-3、10-4、10-5稀釋液50 μL接種于NFM 固體培養(yǎng)基上。每個(gè)區(qū)域的每個(gè)梯度稀釋液各重復(fù) 3 次，用無菌涂布器均勻涂抹到培養(yǎng)基表面，28 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后計(jì)數(shù)，計(jì)算固氮菌的數(shù)量，計(jì)算公式與1.3相同。

NFM培養(yǎng)基配方為：蘋果酸 5.0 g，KOH 4.5 g，K2HPO40.5 g，CaCl2·2H2O 0.02 g，NaCl 0.1 g，NaMoO4·2H2O 0.002 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，生物素 10 μg，0.5%溴麝香草酚藍(lán)5 mL，瓊脂 2%，總體積 1000 mL，pH 7.0。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用 Microsoft Excel 2007錄入數(shù)據(jù)，用Word 2007進(jìn)行表格制作。采用DPS 7.65統(tǒng)計(jì)分析軟件分別對(duì)不同植物不同部位總細(xì)菌和PGPR的數(shù)量進(jìn)行顯著性分析，選用 Duncan法進(jìn)行多重比較，并就總細(xì)菌數(shù)量和功能菌(固氮菌或溶磷菌)數(shù)量進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植物根際細(xì)菌的數(shù)量及分布

采用NA平板計(jì)數(shù)法測定了7種供試植物根部3個(gè)區(qū)域細(xì)菌的數(shù)量及分布，如表1所示，不同植物根際細(xì)菌總數(shù)和分布不同，同一植物根部不同部位細(xì)菌數(shù)量也不同，除賴草和冰草之間差異不顯著外，其余植物根際細(xì)菌分布數(shù)量差異顯著(P<0.05)，高原早熟禾根際細(xì)菌分布數(shù)量最多，糙毛鵝觀草根際細(xì)菌分布數(shù)量次之，垂穗披堿草根際細(xì)菌分布數(shù)量僅次于糙毛鵝觀草，醉馬草、冰草和賴草根際細(xì)菌分布數(shù)量較少。除醉馬草外，各植物根際3個(gè)分布區(qū)域細(xì)菌的數(shù)量都呈現(xiàn)出“根系表面>根際土壤>根內(nèi)”的分布趨勢。

2.2 不同植物根際固氮菌的數(shù)量及分布

采用NFM選擇性培養(yǎng)基從7種供試植物根際分離到生長速度快、菌落較大的菌株，進(jìn)一步純化得到聯(lián)合固氮菌201株(表2)，其中，分離自醉馬草根際的菌株最多，分離自高原早熟禾根際的菌株次之，垂穗披堿草根際分離到的菌株僅次于高原早熟禾，賴草根際分離到的菌株居中，糙毛鵝觀草根際分離的菌株較少，冰草根際分離到的菌株最少。

2.3 根際總微生物數(shù)量和PGPR數(shù)量相關(guān)性分析

如表5所示，根系表面和根際土壤所含的細(xì)菌數(shù)量和土壤細(xì)菌總數(shù)呈極顯著相關(guān)，而根內(nèi)細(xì)菌數(shù)量和土壤細(xì)菌總數(shù)呈顯著相關(guān)或不相關(guān)。對(duì)于固氮菌而言，細(xì)菌總數(shù)與根際土壤、根系表面和根內(nèi)固氮菌的含量都呈極顯著相關(guān)或顯著相關(guān)，這預(yù)示著無論在根際土壤還是根系表面和根內(nèi)，都有相當(dāng)數(shù)量的固氮細(xì)菌存在。

3 討論

3.1 不同植物根際PGPR菌株分布規(guī)律不同

從7種植物根際分離的細(xì)菌、固氮菌的數(shù)量和種類有很大差異。這與植物種類本身及其生存的環(huán)境(如各植物所處區(qū)域土壤肥力、水熱狀況)有關(guān)[10-11]，還與不同的植物根系向土壤中分泌的不同物質(zhì)有一定關(guān)系[12]，此外也與采集樣品的時(shí)間、保存樣品的時(shí)間及方式和所用選擇性培養(yǎng)基的種類等有關(guān)[12-16]。土壤細(xì)菌所需營養(yǎng)主要來源于植物殘?bào)w，不同的植物必然導(dǎo)致細(xì)菌在各植物根際分布的不均一性[13]。我們認(rèn)為每種牧草根系與其周圍的固氮微生物是一個(gè)統(tǒng)一的生態(tài)環(huán)境。

表1 不同禾草根際土壤細(xì)菌數(shù)量及分布Table1 Thenumberanddistributionofbacteriasinrhizospheresoilofdifferentsampleplantscfu/g植物Plants細(xì)菌數(shù)量Thenumberofbacterias(×106)總數(shù)Total根際土壤RS根系表面RP根內(nèi)HP高原早熟禾P.alpigena17.07a5.679.451.95垂穗披堿草E.nutans10.68c4.555.900.23醉馬草A.inebrians4.10d2.551.470.08賴草L.secalinus2.50f0.791.590.12冰草A.cristatum2.53f0.801.520.21紫花針茅S.purpurea3.31e1.411.890.01糙毛鵝觀草R.hirsuta13.91b4.708.810.40 注:同列不同字母表示差異顯著(P<0.05);RS:根際土壤;RP:根系表面;HP:根內(nèi)。下同。 Note:DifferentlowercaselettersinthesamecolumnmeansignificantdifferencesatP<0.05level.RS:Soiladheringtoroots;RP:Rhizoplanorsurfaceofroots;HP:Histoplanorinteriorofroots.Thesamebe-low.

表2 不同禾草根際固氮菌株數(shù)量及分布Table2 Thenumberanddistributionofnitrogenfixingbacteriainrhizosphereofplants株Strains植物Plants總數(shù)Total菌株分布Distribution根際土壤RS根系表面RP根內(nèi)HP高原早熟禾P.alpigena37a15166垂穗披堿草E.nutans34ab11176醉馬草A.inebrians39a16194賴草L.secalinus27c9135冰草A.cristatum14e572紫花針茅S.purpurea30bc12144糙毛鵝觀草R.hirsuta20d6113表3 根際總微生物數(shù)量和PGPR數(shù)量相關(guān)性分析Table3 CorrelationanalysisofrhizospheretotalmicroorganismquantityandPGPRnumber項(xiàng)目ItemRS(B)RP(B)HP(B)T(NFB)RS(NFB)RP(NFB)HP(NFB)Total(B)0.97**0.99**0.78*0.250.170.220.43RS(B)0.93**0.680.400.310.410.50RP(B)0.73*0.130.040.110.36HP(B)0.310.350.160.46T(NFB)0.96**0.98**0.78*RS(NFB)0.90**0.63RP(NFB)0.73* *P<0.05;**P<0.01;T:總數(shù)Total;B:細(xì)菌Bacteria;NFB:固氮菌Nitrogenfixingbacteria.

分離自7種不同植物的總微生物和固氮微生物的數(shù)量在植物根際的分布均表現(xiàn)出根系表面(RP)數(shù)量最多，根際土壤(RS)僅次于根系表面，根內(nèi)(HP)的最少，即“根系表面>根際土壤>根內(nèi)”的分布趨勢，這與姚拓等[13-15]、張英[12]的結(jié)果大體一致。產(chǎn)生這種結(jié)果的原因一方面可能與菌株本身的屬性有關(guān)，菌株越接近根表，越容易獲取植物分泌的某些物質(zhì)，使得聚集在根表的微生物越多[17];另一方面由于在土壤表層和植物根系表層土壤細(xì)菌分布密集，積累的枯枝落葉和根系分泌物也多，可為細(xì)菌生長提供豐富的營養(yǎng)[18]；也可能與土壤溫度、土壤濕度、土壤中的氧氣分布、牧草種類以及C/N有關(guān)[19]。

3.2 PGPR菌株分布數(shù)量與根際總細(xì)菌數(shù)量的相關(guān)性問題

本研究相關(guān)性分析結(jié)果顯示根表面和根表土所含的細(xì)菌數(shù)量和土壤細(xì)菌總數(shù)呈極顯著相關(guān)，而根內(nèi)細(xì)菌數(shù)量和土壤細(xì)菌總數(shù)呈顯著相關(guān)或不相關(guān)，這一結(jié)果預(yù)示著植物根際土壤中細(xì)菌的主要分布是根表面和根表土壤，也印證了本研究得出的土壤微生物數(shù)量“根系表面(RP)>根際土壤(RS)>根內(nèi)(HP)”的分布規(guī)律。

4 小結(jié)

不同禾草根際的細(xì)菌數(shù)量不同，高原早熟禾根際細(xì)菌分布數(shù)量最多，糙毛鵝觀草根際細(xì)菌分布數(shù)量次之，垂穗披堿草根際細(xì)菌分布數(shù)量僅次于糙毛鵝觀草，醉馬草根際細(xì)菌分布數(shù)量較少，冰草和賴草根際細(xì)菌分布數(shù)量最少。

7種供試禾草根際共分離到固氮菌201株。細(xì)菌和固氮菌株的數(shù)量分布呈現(xiàn)“根系表面(RP)>根際土壤(RS)>根內(nèi)(HP)”的分布趨勢，表現(xiàn)出強(qiáng)烈的根際效應(yīng)。

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The study of plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) from several Poaceous species in the East Chi-lien Mountains of China

LI Jian-Hong1,2, LI Xue-Ping1,2, MA Wen-Wen1,2, YAO Tuo1,2*, SUN Jian-Jun3, JIANG Yong-Mei1,2, ZHANG Jian-Gui1,2, SHI Shang-Li1,2

1.CollegeofPrataculture,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China; 2.KeyLaboratoryofGrasslandEcosystem,MinistryofEducation,Lanzhou730070,China; 3.LintaoCountyAgriculturalTechnologyPromotionCenter,Lintao730500,China

This research studied the quantity and distribution of bacteria in the rhizosphere of seven Poaceous species from the east Chi-lien Mountains. The research employed a cultivation method, and mainly studied nitrogen fixing bacteria. It was found that there were large numbers of bacteria in rhizospheres of all 7 plant species studied. The total number of rhizosphere bacteria counted ranged from 2.5×106cfu/g to 17.07×106cfu/g, withAgropyroncristatumandLeymussecalinushaving the lowest rhizosphere nitrogen-fixing bacterial populations andPoaalpigenahaving the highest, with the other 4 species intermediate. A total of 201 nitrogen-fixing strains were isolated from the 7 grass species studied. The quantity of bacteria and PGPR present a distribution trend: “root system surface (RP)>root surface soil (RS)>histoplan or interior of roots (HP)”.

grasses; plant growth promoting rhizobacteria (PGPR); Nitrogen fixing bacteria

10.11686/cyxb2016090

http://cyxb.lzu.edu.cn

2016-03-04；改回日期：2016-06-06

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31360584)和農(nóng)業(yè)部國家牧草產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-35)項(xiàng)目資助。

李建宏(1986-)，男，甘肅臨潭人，在讀博士。E-mail:lijianhong123@126.com*通信作者Corresponding author. E-mail:yaotuo@gsau.edu.cn

李建宏，李雪萍，馬文文，姚拓，孫建軍，蔣永梅，張建貴，師尚禮. 東祁連山高寒草地幾種禾本科牧草根際促生菌研究. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2016, 25(11): 173-177.

LI Jian-Hong, LI Xue-Ping, MA Wen-Wen, YAO Tuo, SUN Jian-Jun, JIANG Yong-Mei, ZHANG Jian-Gui, SHI Shang-Li. The study of plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) from several Poaceous species in the East Chi-lien Mountains of China. Acta Prataculturae Sinica, 2016, 25(11): 173-177.