鄧文祥，李亮，吳華英，潘繼興，蔡雄，曾光，黃惠勇*

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙410208）

四君子湯對(duì)FCIR大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究

鄧文祥，李亮，吳華英，潘繼興，蔡雄，曾光，黃惠勇*

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙410208）

目的探討四君子湯對(duì)局灶性腦缺血再灌注（focal cerebral ischemia-reperfusion，F(xiàn)CIR）大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制。方法將48只SD雄性大鼠隨機(jī)分成對(duì)照組、模型組、尼莫地平組（10.80 mg/kg）、四君子湯組（6 g/kg），每組12只。運(yùn)用大腦中動(dòng)脈栓塞法制備大鼠FCIR模型，對(duì)照組和模型組給予生理鹽水，其它各組則用相應(yīng)藥物連續(xù)灌胃14 d。運(yùn)用Zea-Longa 5級(jí)評(píng)分法評(píng)定FCIR大鼠神經(jīng)功能，免疫組化檢測(cè)層粘連蛋白（laminin,LN）、組織金屬蛋白酶抑制劑1（tissue inhibitor of matrix metalloproteinases 1,TIMP1）和基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinases 9,MMP9）表達(dá)。結(jié)果與對(duì)照組比較，模型組神經(jīng)功能評(píng)分顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，四君子湯組、尼莫地平組神經(jīng)功能評(píng)分均明顯減少（P＜0.01），且四君子湯組、尼莫地平組組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。模型組大腦皮質(zhì)LN陽性表達(dá)明顯低于對(duì)照組（P＜0.01），四君子湯和尼莫地平組LN陽性表達(dá)明顯高于模型組（P＜0.01）。模型組大腦皮質(zhì)TIMP1、MMP9陽性表達(dá)明顯高于對(duì)照組（P＜0.01）。四君子湯和尼莫地平組TIMP1陽性表達(dá)明顯高于模型組（P＜0.01），而MMP9陽性表達(dá)明顯低于模型組（P＜0.01）。結(jié)論四君子湯可能通過促進(jìn)LN和TIMP1表達(dá)，抑制MMP9表達(dá)，減輕大鼠的神經(jīng)功能癥狀，進(jìn)而對(duì)FCIR大鼠大腦皮質(zhì)起到神經(jīng)保護(hù)作用。

四君子湯；腦缺血再灌注；層粘連蛋白；基質(zhì)金屬蛋白酶的組織抑制劑1；基質(zhì)金屬蛋白酶9

腦缺血損傷過程中，細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）在酶解作用下降解，導(dǎo)致細(xì)胞間信號(hào)傳遞失調(diào)，從而造成神經(jīng)元損傷、凋亡。ECM是構(gòu)成血腦屏障的主要成分，也是神經(jīng)元賴以生存的外環(huán)境和載體，能穩(wěn)定神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境學(xué)，與中醫(yī)學(xué)“脾土”的功能相似，ECM的功能當(dāng)屬中醫(yī)學(xué)“脾土”功能的范疇，因此劉旺華等提出健脾補(bǔ)土法治療腦缺血的理論[1-2]。

血管細(xì)胞外基質(zhì)成分的合成和降解在正常生理情況下保持著動(dòng)態(tài)平衡,基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPs）參與了所有ECM成分的調(diào)節(jié)，能夠降解ECM的大部分成分[3]。腦缺血過程中，微血管基底膜的損傷導(dǎo)致層粘連蛋白（laminin，LN）表達(dá)減少，與纖溶酶原激活系變化有關(guān)；組織金屬蛋白酶抑制劑（tissue inhibitor of matrix metalloproteinases，TIMPs）是MMPs的特異性內(nèi)源性抑制劑，可阻斷MMPs與底物的結(jié)合，防止ECM降解，TIMP1為其家族主要成員之一。ECM的降解可以破壞腦微血管結(jié)構(gòu)的完整性，同時(shí)損壞血腦屏障，導(dǎo)致繼發(fā)性腦水腫以及腦損傷。研究發(fā)現(xiàn)，健脾補(bǔ)土法組方能減少神經(jīng)元凋亡對(duì)于腦卒中后遺癥，其機(jī)制可能是通過抑制MMP9表達(dá)以及LN降解[4]。本研究從LN、TIMP1和MMP9蛋白的表達(dá)探討健脾補(bǔ)土法名方四君子湯對(duì)大腦皮質(zhì)的神經(jīng)保護(hù)作用，探討四君子湯腦保護(hù)作用的可能機(jī)制，以期為臨床抗腦缺血/再灌注損傷提供新的思路。

1　材料

1.1動(dòng)物

清潔級(jí)SD大鼠48只，雄性，體質(zhì)量280~ 300 g。動(dòng)物由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限司提供，許可證號(hào)：SCXK（湘）2013-0004。常規(guī)飼養(yǎng)，運(yùn)用12 h交替光線進(jìn)行照明，實(shí)驗(yàn)室通風(fēng)良好，室溫控制在21~26℃，相對(duì)濕度保持在40%~50%。

1.2藥物

選用健脾補(bǔ)土名方四君子湯（由人參9 g，白術(shù)9 g，茯苓9 g，炙甘草6 g組成）。水煎液濃縮為含生藥2 g/mL，4℃冰箱冷藏備用。尼莫地平：購于德國拜耳公司，規(guī)格30 mg，溶于蒸餾水配成3.6 mg/mL備用。

1.3主要試劑和儀器

TIMP1兔抗鼠多克隆抗體（Proteintech公司），MMP9兔抗鼠多克隆抗體（Proteintech公司），LN兔抗鼠多克隆抗體（Proteintech公司），PV-9000二步法通用試劑盒（北京中杉金橋生物公司），DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物公司）。手動(dòng)石蠟切片機(jī)（中國浙江金華），顯微攝像圖像分析系統(tǒng)（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)公司）。

2　方法

2.1動(dòng)物分組及給藥

將48只SD大鼠隨機(jī)分為4組，對(duì)照組、模型組、尼莫地平組（10.8 mg/kg）、四君子湯組（6 g/kg）每組12只。從造模前3 d開始給藥，每天1次，劑量根據(jù)人臨床劑量按動(dòng)物體表面積換算，對(duì)照組、模型組大鼠用等體積蒸餾水灌胃。連續(xù)灌胃14 d。

2.2模型制備及模型篩選

采用大腦中動(dòng)脈栓塞法制備大鼠局灶性腦缺血/再灌注（focal cerebral ischemia/reperfusion, FCIR）模型[5]。運(yùn)用Zea-Longa[6]的5級(jí)4分評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)模型進(jìn)行篩選：0分，正常，無神經(jīng)功能缺損；1分，左前肢不能充分伸展，輕度神經(jīng)功能缺損；2分，行走時(shí)，大鼠向癱瘓側(cè)（左側(cè)）轉(zhuǎn)圈，中度神經(jīng)功能缺損;3分，行走時(shí)，大鼠身體向癱瘓側(cè)（左側(cè)）傾倒。重度神經(jīng)功能缺損；4分，不能自發(fā)行走，有意識(shí)喪失。模型只保留神經(jīng)功能障礙在1級(jí)以上的大鼠，不成功者剔除，補(bǔ)充動(dòng)物，保證每組動(dòng)物12只。

2.3標(biāo)本采集及處理

灌胃后第15 d，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉并固定大鼠，用200 mL生理鹽水經(jīng)左心室快速灌注，至流出液變清，再用4%多聚甲醛緩慢灌注固定30 min，至肝臟變硬白后斷頭取腦，置于4%多聚甲醛固定4 h。石蠟切片機(jī)做冠狀切片，片厚5μm。

2.4指標(biāo)檢測(cè)

2.4.1神經(jīng)功能評(píng)分神經(jīng)功能評(píng)分參照Longa 5級(jí)4分法[6]，各組動(dòng)物在手術(shù)完全清醒后和灌注后第15天處死前2 h進(jìn)行評(píng)分。

2.4.2免疫組化檢測(cè)LN、TIMP1和MMP9表達(dá)具體步驟如下：切片脫蠟、水化組織切片；3%雙氧水孵育10 min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；入PBS修復(fù)液置微波爐修復(fù)抗原，PBS沖洗，2 min×3次；滴加一抗LN、TIMP1或MMP9（均為1∶100），4℃過夜；PBS沖洗，2 min×3次；滴加試劑1，37℃孵育20 min，PBS沖洗，2 min×3次；滴加試劑2（試劑盒自帶）37℃孵育20 min，PBS沖洗，2 min×3次；應(yīng)用DAB溶液顯色，自來水充分沖洗、復(fù)染、脫水、透明、封片。

顯微鏡下LN主要為細(xì)胞外基質(zhì)染成棕黃色顆粒狀。TIMP1、MMP9陽性主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，為黃色或棕黃色。采用彩色圖像分析系統(tǒng)，每張切片400倍下隨機(jī)取6個(gè)不重疊的視野，測(cè)定陽性表達(dá)的面積密度及平均光密度，計(jì)算整合光密度值（IOD），IOD=面積密度×平均光密度；陽性反應(yīng)越大，表示反應(yīng)越強(qiáng)。

2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)均采用“±s”表示。組間兩兩比較方差齊者用LSD法檢驗(yàn)，方差不齊者用Dunnett's T3法檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3　結(jié)果

3.1各組大鼠肢體神經(jīng)功能評(píng)分情況

與對(duì)照組比較，模型組神經(jīng)功能評(píng)分顯著增加，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，四君子湯組、尼莫地平組神經(jīng)功能評(píng)分均明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），且四君子湯組、尼莫地平組組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

3.2四君子湯對(duì)FCIR大鼠大腦皮質(zhì)LN蛋白表達(dá)的影響

對(duì)照組LN在神經(jīng)元及血管細(xì)胞外基質(zhì)呈強(qiáng)陽性表達(dá)，染色呈深棕色，厚度適中。模型組、四君子湯組、尼莫地平組表達(dá)減弱,染色較淡和厚度變小等。對(duì)照組LN在顳葉皮質(zhì)表達(dá)呈強(qiáng)陽性表達(dá)；模型組LN表達(dá)明顯降低，染色淡；四君子湯組和尼莫地平組LN表達(dá)降低，染色較淡。模型組大腦皮質(zhì)LN陽性表達(dá)明顯低于對(duì)照組（P＜0.01），四君子湯和尼莫地平組LN陽性表達(dá)明顯高于模型組（P＜0.01）見表1，圖1。

3.3四君子湯對(duì)FCIR大鼠大腦皮質(zhì)TIMP1、MMP9蛋白表達(dá)的影響

胞漿或胞核著色呈棕黃色為TIMP1陽性細(xì)胞。對(duì)照組偶見少量TIMP1、MMP9陽性表達(dá)；模型組TIMP1、MMP9陽性表達(dá)應(yīng)激性升高；四君子湯組和尼莫地平組TIMP1陽性表達(dá)增多，MMP9陽性表達(dá)減少。模型組大腦皮質(zhì)TIMP1、MMP9陽性表達(dá)明顯高于對(duì)照組（P＜0.01）。四君子湯和尼莫地平組TIMP1陽性表達(dá)明顯高于模型組（P＜0.01），而MMP9陽性表達(dá)明顯低于模型組（P＜0.01）。見表1，圖2、3。

圖1　各組大鼠皮質(zhì)LN表達(dá)顯微光鏡圖（免疫組化×400）

圖2　各組大鼠皮質(zhì)TIMP1顯微光鏡圖（免疫組化×400）

圖3　各組大鼠皮質(zhì)MMP9顯微光鏡圖（免疫組化×400）

表1　各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分及LN、TIMP1、MMP9表達(dá)的光密度比較(±s)

表1　各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分及LN、TIMP1、MMP9表達(dá)的光密度比較(±s)

注：與對(duì)照組比較**P＜0.01，與模型組比較△△P＜0.01。

組別n神經(jīng)功能評(píng)分LN(整合光密度值)TIMP1光密度值MMP9光密度值對(duì)照組12 0 35.11±7.25 0.186±0.023 0.053±0.016模型組12 2.83±0.71**13.56±6.23**0.255±0.030**0.405±0.029**四君子湯組12 2.00±0.75**△△23.37±4.69**△△0.357±0.028**△△0.284±0.023**△△尼莫地平組12 1.75±0.88**△△24.25±5.87**△△0.342±0.024**△△0.267±0.021**△△F值4.26 10.23 9.65 8.79 P值0.008 0.00 0.00 0.00

4　討論

缺血性腦血管病以其高發(fā)病率和高致殘率成為當(dāng)前威脅人類健康的三大主要疾病之一,是威脅中老年人健康的常見疾病[7]。

腦缺血后神經(jīng)元凋亡是腦損傷和神經(jīng)功能缺損的重要原因，近年來研究發(fā)現(xiàn)，“失巢凋亡”是神經(jīng)元凋亡的重要途徑，腦缺血損傷過程中，ECM在酶解作用下降解，同時(shí)，導(dǎo)致細(xì)胞間信號(hào)傳遞失調(diào)，從而造成神經(jīng)元損傷、凋亡，即所謂“失巢凋亡”?！捌楹筇熘荆瑲庋础笔侵嗅t(yī)學(xué)的基本理論之一，“脾者土也……土者生萬物……”，土為坤元，“至哉坤元，萬物滋生，坤厚載物”。而ECM是神經(jīng)元賴以生存的外環(huán)境和載體，如同神經(jīng)元的“巢穴”，具有承載、營養(yǎng)、保護(hù)、促進(jìn)神經(jīng)元突觸生長、促進(jìn)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元的作用，從這一角度來看，ECM的功能當(dāng)屬中醫(yī)學(xué)“脾土”功能的范疇，而“失巢凋亡”當(dāng)屬脾虛承載功能不足的范疇。神經(jīng)細(xì)胞外ECM的破壞和降解在FCIR損傷過程中發(fā)揮重要作用，LN為ECM的重要組成成分。李瑞梅等[8]研究發(fā)現(xiàn)FCIR后LN的表達(dá)先降低后回升，與血腦屏障的病理性改變有關(guān)，其可造成繼發(fā)性腦水腫損傷；與促使新生血管生成相關(guān)聯(lián)。TIMPs是MMPs的特異性抑制劑，特異性抑制MMPs的活性。當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)缺血缺氧性變化出現(xiàn)在腦組織中時(shí)，大量的MMP9將由組織中的血管內(nèi)皮細(xì)胞以及中性粒細(xì)胞分泌并且釋放，同時(shí)，MMP9與炎癥的發(fā)生關(guān)系較為密切，ECM的降解與其釋放呈正相關(guān)，可能增加血腦屏障的通透性，進(jìn)一步誘導(dǎo)血管腦源性水腫[9]。正常情況下，MMPs和TIMPs相互作用，使ECM處于動(dòng)態(tài)平衡中。因此，如果MMP和TIMP之間的平衡被打破，有可能會(huì)影響到ECM的合成與降解。黃越等[10]研究發(fā)現(xiàn)TIMP1在新生鼠缺血腦組織表達(dá)明顯增加，可能與新生鼠缺血腦組織損傷有關(guān)。

四君子湯出自《太平惠民和劑局方·卷三》，是健脾補(bǔ)土的名方，該方以人參為君，甘溫益氣，補(bǔ)中健脾養(yǎng)胃；白術(shù)苦溫，健脾燥濕，濕去脾自健，合人參益氣助運(yùn)之力為臣；茯苓甘淡為佐，健脾滲濕，苓術(shù)合用，則進(jìn)一步增強(qiáng)健脾除濕以及運(yùn)化之力；炙甘草甘溫，益氣和中，調(diào)和諸藥，共同發(fā)揮補(bǔ)氣健脾功效為使。四藥配伍，共奏益氣健脾之功。脾為后天之本，氣血生化之源，《靈樞·海論》記載“腦為髓之海腦”，《素問·脈要精微論》記載“頭者,精明之府”，其與人體的生命、精神以及感覺等方面密切相關(guān)?！端貑枴そ?jīng)脈別論》記載：“飲入于胃，游溢精氣，上輸于脾，脾氣散精，上歸于肺。及脾主升清，運(yùn)化水谷精微濡養(yǎng)腦髓。由此可見脾腦相關(guān)的橋梁可能通過脾胃的氣機(jī)升降功能實(shí)現(xiàn)，為其腦部病變的防治提供了理論依據(jù)[11]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)ICR后可見明顯神經(jīng)功能損害，ECM在酶解作用下降解，與文獻(xiàn)報(bào)道基本相符[8-10]，提示ECM在FCIR所致神經(jīng)元損傷中發(fā)揮重要作用。而四君子湯組和尼莫地平組TIMP1陽性表達(dá)高于模型組，MMP9陽性表達(dá)明顯減少，LN陽性表達(dá)明顯多于模型組，提示四君子湯對(duì)神經(jīng)功能具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與促進(jìn)LN和TIMP1表達(dá)，抑制MMP9表達(dá)，從而維護(hù)細(xì)胞外基質(zhì)完整性、保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞有關(guān)。其具體機(jī)制有待研究?，F(xiàn)代研究表明[12]人參皂苷Rb1可能在腦缺血死后神經(jīng)可塑性中起促進(jìn)作用，與其促進(jìn)大鼠局灶性腦缺血后腦白質(zhì)重塑有關(guān)；研究發(fā)現(xiàn)[13]人參皂苷Rg2可通過減少缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能評(píng)分，減少腦梗死面積，提高膽堿能神經(jīng)活性，對(duì)腦缺血再灌注損傷具有防護(hù)作用。這可能是四君子湯腦保護(hù)作用的物質(zhì)基礎(chǔ)之一。

[1]劉旺華,李花,周小青.論神經(jīng)細(xì)胞外基質(zhì)與中醫(yī)脾土相關(guān)及其對(duì)腦缺血保護(hù)的啟示[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2010,17(3):5-6,56.

[2]付小金,劉旺華,李花,等.健脾補(bǔ)土方對(duì)腦缺血/再灌注損傷大鼠NF-κB和IκBα蛋白表達(dá)水平的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2015,35(3):5-8+73.

[3]Chang JH,Huang YH,Cunningham CM,et al.Matrix metalloprotei nase 14 modulates signal transduction and angiogenesis in the cornea[J].Surv Ophthalmol,2015,61(4):478-97.

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（本文編輯 楊瑛）

Neuroprotective Effect of Sijunzi Decoction on Cerebral Cortex in FCIR Rats

DENG Wenxiang,LI Liang,WU Huaying,PAN Jixing,CAI Xiong,ZENG Guang,HUANG Huiyong*
(Provincial Key Laboratory of TCM Diagnostics,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China）

Objective To explore the mechanism of neuroprotective effect of Sijunzi Decoction on cerebral cortex in focal cerebral ischemia-reperfusion (FCIR)rats.Methods 48 male Sprague Dawley(SD)rats were random ly divided into control group,model group,nimodipine group and Sijunzi Decoction group,with 12 rats in each group.The FCIR rat models were established by middle cerebral artery occlusion.The control and model groups were treated with normal saline for 14 d, while nimodipine and Sijunzi Decoction groups were treated with nimodipine(10.80 mg/kg)and Sijunzi Decoction(6 g/kg)for 14 d,respectively.The neural function of FCIR rats was assessed according to five grade scale proposed by Zea-Longa.The expressions of LN,TIMP1 and MMP9 protein were determined by immunohistochemistry.Results Compared with the control group,scores of neural function increased remarkably in model group(P＜0.01).Compared with the model group,the scores of nimodipine and Sijunzi decoction groups decreased remarkably(P＜0.01),but there was no difference between nimodipine and Sijunzi decoction groups(P＞0.05).The expression of LN in model group was lower than that in the control group(P＜0.01),while the LN expression in nimodipine and Sijunzi decoction groups was higher than that in the model group(P＜0.01).The expression of TIMP1 and MMP9 in the model group was obviously higher than that in the control group(P＜0.01).The TIMP1 postive expression of nimodipine and Sijunzi decoction groups was obviously higher than that in model group(P＜0.01),while the expressiom of MMP9 was lower than that in the model group(P＜0.01).ConclusionThe neuroprotective effect of Sijunzi Decoctioon on cortex in FCIR rats may be by promoting the expression of LN and TIMP1,inhibiting the expression of MMP9,improving the neural function.

Sijunzi Decoction;cerebral ischemia reperfusion;LN;TIMP1;MMP9

R285.5；R743.3

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2016.11.003

2016-05-21

湖南省教育廳科學(xué)研究項(xiàng)目重點(diǎn)項(xiàng)目（60010408）；湖南省科技廳社會(huì)發(fā)展支撐計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（2014S2032）；湖南省中醫(yī)藥科研計(jì)劃項(xiàng)目（2014153）；中醫(yī)診斷學(xué)國家重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目（2013ZYZD04）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生院華潤三九科研創(chuàng)新項(xiàng)目（2015SJ01）。

鄧文祥，男，在讀碩士研究生，研究方向：中醫(yī)辨證學(xué)與數(shù)字中醫(yī)藥。

*黃惠勇，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail:tony427000@aliyun.com。