張石蕾， 趙 軍， 劉 濤， 吉騰飛， 徐 芳

(1新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院， 烏魯木齊 830011; 2新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所維吾爾藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 烏魯木齊 830004;

?

·藥學(xué)研究·

煙花苷對(duì)刀豆蛋白A致小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用

張石蕾1， 趙 軍2， 劉 濤1， 吉騰飛3， 徐 芳2

(1新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院， 烏魯木齊 830011;2新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所維吾爾藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 烏魯木齊 830004;

3中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所天然藥物活性成分與功能國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100050)

目的 探究煙花苷對(duì)刀豆蛋白A (Con A) 致小鼠急性免疫性肝損傷的保護(hù)作用。方法 選取48只昆明種小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、聯(lián)苯雙酯陽性對(duì)照(150 mg/kg體質(zhì)量)組和煙花苷低、中、高劑量(25、50、100 mg/kg體質(zhì)量)組。煙花苷低、中、高劑量和聯(lián)苯雙酯陽性對(duì)照組連續(xù)給藥10 d，末次給藥 1 h后，模型組、聯(lián)苯雙酯陽性對(duì)照組和煙花苷低、中、高劑量尾靜脈注射刀豆蛋白A(Con A)20 mg/kg體質(zhì)量造模，正常組小鼠尾靜脈注射相同體積PBS溶液。造模8 h后采血，處死小鼠，剖腹取肝臟，制備肝勻漿。檢測小鼠肝臟血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、干擾素-γ(IFN-γ)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)活性；檢測肝臟組織勻漿中丙二醛 (MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)和一氧化氮(NO)的含量；并通過HE染色觀察肝臟組織的病理學(xué)變化。結(jié)果 與模型組比較，煙花苷中、高劑量組小鼠血清AST水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，低、中、高劑量組小鼠血清ALT水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；煙花苷中、高劑量組能降低小鼠血清MDA和NO水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，低、中、高劑量組SOD和GSH水平明顯提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；煙花苷低、中、高劑量組小鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平降低, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，高劑量組小鼠血清IFN-γ水平降低, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；肝臟病理學(xué)檢測顯示煙花苷能明顯減輕Con A對(duì)肝臟組織的病理損傷。結(jié)論 煙花苷對(duì)ConA致小鼠急性免疫性肝損傷有明顯的保護(hù)作用，其機(jī)制與其抗氧化、抑制促炎因子的表達(dá)密切相關(guān)。

煙花苷； 刀豆蛋白A； 肝損傷； 保肝作用

維吾爾藥睡蓮花為睡蓮科睡蓮屬多年生水生草本植物雪白睡蓮(Nymphaea candida Presl)的干燥花蕾，是炎消迪娜兒糖漿等抗肝炎藥物的主要組成之一，被《維吾爾藥志》收載[1]。煙花苷(山奈酚-3-O-β-D蕓香糖苷)是睡蓮花的主要標(biāo)識(shí)性成分之一，是一種連接有蕓香糖的黃酮醇苷類化合物，存在于多種植物中，具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗炎鎮(zhèn)痛及神經(jīng)保護(hù)等多種生物活性[2-4]，但其保肝作用的系統(tǒng)研究鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，通過刀豆蛋白A誘導(dǎo)的小鼠急性免疫性肝損傷模型探討煙花苷的保肝護(hù)肝作用，以期為煙花苷的深入開發(fā)提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)昆明種小鼠，雄性，體質(zhì)量18～22 g，購自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，合格證號(hào)：SYXK(新)2011-0004，使用許可證號(hào)：SYXK(新)2011-0001。實(shí)驗(yàn)室通風(fēng)良好，室溫(20±2)℃，濕度30%～40%，清潔環(huán)境，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自由飲水進(jìn)食。

1.2 試劑 煙花苷提取物自制(含量>95%)，聯(lián)苯雙酯滴丸(北京協(xié)和藥廠生產(chǎn)，批號(hào)：0505010r7)，刀豆蛋白TypeⅣ (ConA)(北京博奧拓達(dá),批號(hào)：20151026)，總蛋白定量(BCA法)、MDA、SOD、GSH、NO試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20151219、20151207、20150610、20151112、20150605)，IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ試劑盒(武漢博士德生物有限公司，批號(hào)：11611921015、132111031015、24111951015、9711891015)，PBS緩沖液(上海易利生化試劑有限公司，批號(hào)：20150617)，其它試劑均為分析純。

1.3 儀器 全自動(dòng)生化分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療有限公司)，UV1200 紫外可見分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司)，BIO-RAD全波長酶標(biāo)儀(Bench Mark PLUS)，F(xiàn)SH-2A可調(diào)高速勻漿機(jī)(金壇市醫(yī)療儀器廠)，MIKR022R低速冷凍離心機(jī)(杭州普瑞特儀器有限公司)，電熱恒溫水溫箱(北京市永光明醫(yī)療儀器廠)。

2 方法

2.1 小鼠急性免疫性肝損傷模型的建立 昆明種小鼠48只，體質(zhì)量18～22 g，隨機(jī)分為正常組、模型組、聯(lián)苯雙酯對(duì)照組(150 mg/kg體質(zhì)量)和不同濃度的煙花苷高、中、低劑量組(100、50、25 mg/kg體質(zhì)量)。除正常組和模型組每天灌胃等體積的蒸餾水1次外，其他各給藥組小鼠按10 mL/kg體質(zhì)量每天灌胃給藥1次，連續(xù)灌胃10 d。末次給藥1 h后，模型組和各給藥組尾靜脈注射ConA 20 mg/kg體質(zhì)量造模，正常組小鼠尾靜脈注射相同體積PBS溶液。禁食8 h后，摘眼球取血，4℃放置2 h后，3 000 r/min離心10 min，留取血清待檢。頸椎脫臼處死小鼠，解剖，摘取肝臟。精確稱取各組小鼠同部位肝臟組織0.5 g置于冷生理鹽水中，濾紙吸干水分，按 1∶9( 質(zhì)量體積比) 加入生理鹽水4.5 mL，冰浴研磨至漿狀，3 000 r/min離心10 min，取肝勻漿上清液待檢。

2.2 檢測指標(biāo) 按試劑盒說明書測定肝勻漿中丙二醛 (MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)和一氧化氮(NO)的含量，采用全自動(dòng)生化儀測定血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)含量；采用ELISA法測定血清白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、干擾素-γ(IFN-γ)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)活性。

2.3 病理組織學(xué)觀察 處死小鼠后，取肝臟左葉距邊緣0.5 cm處小塊組織，用10%甲醛固定，HE染色，光鏡下觀察肝組織病理學(xué)變化。

3 結(jié)果

3.1 煙花苷對(duì)ConA致急性肝損傷小鼠血清AST和ALT的影響 與正常組比較，模型組小鼠血清ALT和AST活性顯著提高(P<0.05)，表明肝細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能損傷，造模成功。與模型組比較，煙花苷中、高劑量組小鼠血清AST水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組比較，煙花苷低、中、高劑量組小鼠血清ALT水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

3.2 煙花苷對(duì)ConA致急性肝損傷小鼠肝勻漿MDA、SOD、GSH和NO的影響 與正常組相比較，模型組小鼠肝勻漿MDA和NO水平提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；SOD和GSH水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，煙花苷中、高劑量組小鼠血清MDA和NO水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；煙花苷低、中、高劑量組SOD和GSH水平明顯提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，效果接近于對(duì)照組,見表2。

組別劑量/(mg/kg體質(zhì)量)ALT/(U/L)AST/(U/L)正常組-44.7±11.65104.07±13.82模型組-77.22±28.91#133.02±11.62#對(duì)照組15054.4±15.73*120.91±12.19煙花苷高劑量組10045.57±11.66*110.58±19.59*煙花苷中劑量組5053.76±8.20*116.51±13.16*煙花苷低劑量組2557.7±27.05*122.95±13.24

注：與正常組比較，#P<0.05； 與模型組比較，*P<0.05。

表2 煙花苷對(duì)ConA致急性肝損傷小鼠肝勻漿MDA、SOD、GSH和NO的影響(n=8, ±s)

注：與正常組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

3.3 煙花苷對(duì)ConA致急性肝損傷小鼠血清IL-1β、TNF-α、IL-6和IFN-γ的影響 與正常組相比較，模型組小鼠血清IL-1β、TNF-α、IL-6和IFN-γ水平提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比較，煙花苷低、中、高劑量組小鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比較，煙花苷高劑量組小鼠血清IFN-γ水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，中、低劑量組IFN-γ降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。

表3 煙花苷對(duì)ConA致急性肝損傷小鼠血清細(xì)胞因子的影響(n=8, ±s)

注：與正常組比較，#P<0.05； 與模型組比較，*P<0.05。

3.4 煙花苷對(duì)ConA致急性肝損傷小鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)的影響 光鏡下觀察可見正常組小鼠肝細(xì)胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，無病理改變，匯管區(qū)未見炎細(xì)胞浸潤(圖1A)。模型組小鼠肝細(xì)胞嚴(yán)重水腫，細(xì)胞質(zhì)疏松化，中央靜脈肝血竇擴(kuò)張充血，肝竇內(nèi)可見紅細(xì)胞堆集，肝內(nèi)出現(xiàn)彌漫性分布的點(diǎn)、片狀壞死，小葉周邊脂肪變性，彌散性炎細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤，嗜酸性變(圖1B)。聯(lián)苯雙酯組小鼠肝細(xì)胞水腫不明顯，偶見點(diǎn)狀壞死，匯管區(qū)只有少量炎細(xì)胞浸潤(圖1C)。睡蓮花煙花苷各劑量組相比,模型組肝細(xì)胞損傷程度明顯減輕，炎性細(xì)胞浸潤顯著減少，其中煙花花苷高(圖1D)、中(圖1E)劑量組較低(圖1F)劑量組，受損程度及修復(fù)情況較好。

A：正常組 B：模型組 C：聯(lián)苯雙酯陽性對(duì)照組150 mg/kg

D：煙花苷高劑量組100 mg/kg E：煙花苷中劑量組 50 mg/kg F：煙花苷低劑量組 25mg/kg

圖1 煙花苷對(duì)ConA致急性肝損傷小鼠肝臟病理組織學(xué)的影響(HE染色，×200)

4 討論

Con A是一種被廣泛應(yīng)用可活化T細(xì)胞的有絲分裂原，其誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞依賴性肝損傷病理與人類自身免疫性肝病，急、慢性病毒性肝炎相似[5-6]。在急性免疫性肝損傷模型中，T淋巴細(xì)胞被確認(rèn)為是ConA誘導(dǎo)的小鼠免疫性肝損傷模型的效應(yīng)細(xì)胞，引起小鼠T細(xì)胞依賴性肝損傷[7]。輔助性T淋巴細(xì)胞(Th)主要分為：Th1和Th2。Th1和Th2細(xì)胞因子有相互抑制和調(diào)節(jié)的作用，機(jī)體正常狀態(tài)時(shí)Th1和Th2處于相對(duì)平衡狀態(tài)，這種平衡狀態(tài)被打破就會(huì)引起疾病的產(chǎn)生。脂質(zhì)過氧化反應(yīng)是肝損傷發(fā)生的重要機(jī)制。脂質(zhì)過氧化的主要降解產(chǎn)物脂質(zhì)過氧化物MDA，可嚴(yán)重?fù)p傷肝細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致肝細(xì)胞的腫脹、壞死，可反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化程度，是評(píng)價(jià)自由基損傷的關(guān)鍵指標(biāo)，其含量高低與自由基損傷程度密切相關(guān)。SOD是體內(nèi)重要的氧自由基清除劑，SOD活性的降低將導(dǎo)致氧自由基蓄積，從而誘導(dǎo)細(xì)胞損傷。NO是許多肝臟疾病中重要的炎性介質(zhì)之一，肝細(xì)胞在體外可經(jīng)特異性細(xì)胞因子及LPS協(xié)同誘導(dǎo)，持續(xù)產(chǎn)生大量的NO，介導(dǎo)多種病理生理效應(yīng)，包括肝細(xì)胞毒性效應(yīng)。Con A 活化Th1 細(xì)胞后可刺激庫普弗細(xì)胞和肝細(xì)胞產(chǎn)生大量TNF-α，TNF-α可通過激活核因子誘導(dǎo)多個(gè)調(diào)節(jié)免疫與炎癥過程的基因轉(zhuǎn)錄，包括TNF-α、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)及IFN-γ等，這些細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄激活都與肝損傷密切相關(guān)[8-10]。

本研究表明Con A誘導(dǎo)急性肝損傷后，小鼠血清ALT、AST活性明顯升高。預(yù)先給予及治療性給予煙花苷后，小鼠血清ALT、AST活性較模型組明顯降低,并且可減輕小鼠肝臟的病理損傷程度。此外，煙花苷可降低MDA、NO含量，并升高SOD、GSH活性。表明煙花苷有明顯抑制肝組織脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，提示其作用機(jī)制可能與其抗氧化作用有關(guān)。給小鼠注射Con A后，活化Th細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生過量TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6等細(xì)胞因子。煙花苷中、高劑量組小鼠血清中TNF-α、IFN-γ和IL-1β、IL-6水平明顯降低。

綜上所述，煙花苷對(duì)小鼠急性免疫性肝損傷有明顯的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抗氧化及炎性細(xì)胞因子的抑制有關(guān)。

[1] 劉勇民.維吾爾藥志[M].烏魯木齊:新疆科技衛(wèi)生出版社,1999:496.

[2] Wang Y, Chen P, Tang CY, et al. Antinociceptive and anti-inflammatory activities of extract and twoisolated flavonoids of Carthamustinctorius[J]. J of Ethnopharm Pharm, 2014,151 :944-950.

[3] Li R, Guo ML, Zhang G,Xu XF, et al. Neuroprotection of Nicotiflorin in permanent focal cerebral ischemiaand in neuronal cultures[J].Biol Pharm Bull,2006,29(9): 1868-1872.

[4] Huang JL,Fu ST, Jiang YY, etal. Protective effects of Nicotiflorin on reducing memory dysfunction, energymetabolism failure and oxidative stress in multi-infarct dementia model rats[J].Pharm Bioch Behavior,2007, 86:741-748.

[5] 劉耕陶.中藥藥理研究與藥物創(chuàng)新[M].北京:中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社,2006:34-35.

[6] 張翔,凌保東,李蕊興,等.肝病沖劑對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝損傷的保護(hù)作用[J].川北醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),1991,5(2):22-24.

[7] 曲建慧,張修禮.Con A性小鼠肝損傷模型的研究及應(yīng)用[J].中國肝臟,2001, 6(3):180-181.

[8] 劉光偉,王靈臺(tái),高月求,等.刀豆蛋白A誘導(dǎo)的肝損傷模型T細(xì)胞亞群變化及機(jī)制探討[J].中國中西醫(yī)結(jié)合消化雜志, 2008, 16(5): 332-334.

[9] Nakamura K, Okada M, Yoneda M, et al. Macrophage inflammatory protein-2 induced by TNF-alpha plays a pivotal role in concanavalin A-induced liver injury in mice [J]. J Hepatol, 2001, 35(2): 217-224.

[10] Gantner F,Leist M, Lohse AW,et al. Concanavalin A-induced T-cell mediated hepatic injury in mice:the role of tumor necrosis factor[J]. Hepatology,1995,21(1):190 -198.

(本文編輯 施洋)

The protective effect of nicotiflorin on acute hepatic injury in mice induced by concanavalin A

ZHANG Shilei1, Zhao Jun2, LIU Tao1, JI Tengfei3, XU Fang2

(1CollegeofPublicHygiene,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China;2XinjiangKeyLaboratoryforresearchandDevelopmentofUighurMedicines;XinjiangInstituteofMateriaMedica,Urumqi830004.3StateKeyLaboratoryofBioactiveSubstanceandFunctionofNaturalMedicines,InstituteofMateriaMedica,ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege,Beijing100050,China)

Objective To study protective effect of Nicotiflorin from Nymphaea andida on immunological liver injury induced by ConA in mice and its mechanism. Methods Forty-eight healthy adult mice were divided into six groups equaled randomly: control group, model group, dimethyl diphenyl bicarboxylate (DDB) positive control group and Nicotiflorin group (25, 50, 100 mg/kg·d), intragastric administration for ten days. One hour after the last medication, the mice except the blank control group were tail vein injected with ConA 20 mg/kg PBS solution. Mice were sacrificed at the 8th hour and blood was collected, the liver was harvested for liver homogenate. The levels of ALT, AST, IL-1β , IL-6, IFN-γ and TNF-α in serum, and the contents of MDA, SOD, NO and GSH in 1iver homogenate were measured. And histopathlogical examination was observed． Results Compared with that of model group, the levels of serum AST were decreased in the high dose group, which the difference was statistically significant (P<0.05); the low, middle and high dose group could reduce the level of serum ALT in mice, and the difference was statistically significant (P<0.05); the serum levels of MDA and NO were decreased in the high dose group, which the difference was statistically significant (P<0.05); and the low, medium and high dose group could significantly improve the level of SOD and GSH, and the difference was statistically significant (P<0.05); the low, medium and high dose group could reduce serum TNF-α, IL-6 and IL-1β (P<0.05), and the high dose group could reduce the level of serum IFN-γ (P<0.05) in mice and the hepatic pathological features were improved. Conclusion Nicotiflorin has a protective effect on acute damage of liver in mice induced by ConA, and its mechanism might be related to anti-oxidant and decrease of releasing inflammatory cytokines.

nicotiflorin; concanavalin A; liver injury; protective effect

新疆維吾爾自治區(qū)科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(20133318)

張石蕾(1992-)，女，在讀碩士，研究方向：新疆特色藥兼藥用植物的應(yīng)用研究。

劉 濤，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：新疆特色藥兼藥用植物的應(yīng)用研究，E-mail:xjmult@163.com。

R966

A

1009-5551(2016)12-1559-05

10.3969/j.issn.1009-5551.2016.12.018

2016-6-10]