張秀磊 錢江輝 任筱青 沙先誼

鹽酸氨溴索注射劑穩(wěn)定性及體內藥物動力學的深層次評價

張秀磊 錢江輝 任筱青 沙先誼

目的 深層次評價四種鹽酸氨溴索注射劑在生理環(huán)境pH條件下的穩(wěn)定性及體內藥物動力學。方法 以pH 7.4磷酸緩沖液模擬血液的生理pH環(huán)境，考察四種制劑不同劑量下與其混合后的含量和pH變化；采用隨機、自身交叉試驗設計，應用HPLC-MS/MS測定鹽酸氨溴索血漿濃度，考察四種鹽酸氨溴索制劑在比格犬體內的藥物動力學。結果 A與B兩種鹽酸氨溴索注射水針劑在pH 7.4磷酸緩沖液中相對比較穩(wěn)定；C和D兩種注射用鹽酸氨溴索粉針劑在低劑量時含量呈現下降趨勢，高劑量時含量降低大于10%。四種制劑的緩沖能力具有明顯的差別，水針劑的緩沖能力明顯強于粉針劑。中、高劑量C、D制劑的生物利用度均明顯低于A制劑，提示鹽酸氨溴索注射劑配方的差異可能影響藥物的生物利用度。四種制劑的藥物生物半衰期t1/2隨劑量的增加而改變，AUC（0-∞）隨劑量增加呈現非線性增加的趨勢，表明該藥物體內動力學可能為非線性藥物動力學過程。結論 鹽酸氨溴索水針劑配方中的緩沖鹽體系增強了鹽酸氨溴索對于PBS的穩(wěn)定性，有利于提高藥物在體內的穩(wěn)定性。

鹽酸氨溴索；緩沖能力；HPLC-MS/MS；生物利用度；質量評價

鹽酸氨溴索（Ambroxol hydrochloride）為溴己新的體內活性代謝物，是新一代黏痰溶解劑，臨床上主要用于治療急、慢性呼吸道疾病[1]。黏液高分泌是慢性氣道炎癥性疾病的重要病理生理特征，可加

重呼吸道氣流阻塞，加速肺功能下降，氣道黏液的黏彈性主要由其中的黏蛋白所決定，鹽酸氨溴索能分解其中的多糖部分，并增加呼吸道黏膜漿液腺體的分泌，減少黏液腺分泌，從而降低痰液黏度，促進黏液排出，對肺泡表面活性物質的合成與分泌也有顯著地促進作用，可增加支氣管纖毛運動，起到有效排痰、改善呼吸狀況的作用[2]。

臨床注射用的鹽酸氨溴索主要有水針劑和凍干粉針兩種劑型。在藥品說明書注意事項處明確指出，該藥物不能與pH大于6.3的溶液混合，因為pH值的增加將會導致產生氨溴索游離堿沉淀。前期通過對水針劑和粉針劑的制劑配方進行分析，發(fā)現兩種劑型配方的主要區(qū)別在于：水針制劑配方中含有磷酸緩沖液體系，而粉針劑主要輔料為甘露醇?？紤]到人體生理環(huán)境的pH為7.4，因此本實驗擬選擇兩種鹽酸氨溴索水針劑和兩種鹽酸氨溴索凍干粉針，深層次評價藥物的體外穩(wěn)定性及其體內動力學的差異性，旨在為該藥物的內在質量評價與臨床用藥的安全性提供一定的理論參考依據。

1 材料與方法

1.1 儀器 高效液相色譜儀：Shimadzu LC-15A高效液相儀（日本島津公司）；色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6×250 mm，5 μm）；天平：Sartorius BS210S，Max 210 g，d=0.1 mg，北京賽多利斯天平有限公司；分析天平：Sartorius BT25S，Max 21 g，d=0.01 mg，北京賽多利斯天平有限公司；pH計：編號1231045508，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；API-3000質譜檢測器（Applied Biosystems，美國）以及Analyst色譜工作站（1.4.1版本，Applied Biosystems，美國），Agilent公司1100型高效液相色譜儀，包括G1312A四元泵、G1316A柱溫箱、G1379A在線脫氣機和CTC HTS型控溫自動進樣器（CTC Analytics，瑞士）。

1.2 藥品與試劑 鹽酸氨溴索對照品（純度＞99.6%，中國藥品生物制品檢定所，批號：100599-200502）；鹽酸氨溴索注射液：A廠（國藥準字J20140032，規(guī)格為每支15 mg/2 ml）；B廠（國藥準字H20041473，規(guī)格為每支15 mg/2 ml）；注射用鹽酸氨溴索粉末：C廠（國藥準字H20031344，規(guī)格為每支30 mg）；D廠（國藥準字H20050243，規(guī)格為每支15 mg）。甲醇、乙腈（色譜純，TEDIA，美國）；其他試劑均為分析純。pH 7.4磷酸緩沖液（PBS）：按中國藥典第四部，取磷酸二氫鉀1.36 g，加0.01 mol/L氫氧化鈉溶液79 ml，用水稀釋至200 ml即得[3]。

1.3 鹽酸氨溴索體內外分析方法的建立

1.3.1 鹽酸氨溴索體外樣品分析方法 色譜條件：色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6×250 mm，5 μm）；流動相：0.01 mol/L磷酸氫二銨溶液（用磷酸調節(jié)pH至7.0）-乙腈（50∶50，V/V）；流速：1.0 ml/min；柱溫：室溫；檢測波長：248 nm；理論塔板數按鹽酸氨溴索計算不低于2000。

1.3.2 鹽酸氨溴索血漿濃度測定方法[4-5]色譜條件：Agela公司Venusil XBP Phenyl column（100 mm× 2.1 mm，5 μm）；采用梯度洗脫（梯度洗脫程序見下表1），流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為甲醇；內標為甲苯磺丁脲（100 ng/ml）；柱溫 40℃；進樣量10 μL。

表1 鹽酸氨溴索LC MS/MS流動相洗脫程序表

質譜條件：離子源為電噴霧電離（ESI）源；檢測方式：正離子檢測；掃描方式：多反應監(jiān)測（MRM）；噴射電壓：5000 V；離子源溫度：500 ℃；氣簾氣流速：10 L/min；霧化氣流速：8 L/min；碰撞氣流速為：4 L/min；掃描時間：0.2 s；采用定量和定性的離子條件。見表2。

表2 鹽酸氨溴索血藥濃度LC MS/MS離子條件

1.4 鹽酸氨溴索注射劑穩(wěn)定性評價

1.4.1 鹽酸氨溴索注射劑在磷酸緩沖液（pH 7.4 PBS）中的穩(wěn)定性 根據藥品說明書該制劑應避免與pH大于6.3的溶液混合，但考慮到人體血液的pH在7.4左右，應考察制劑輸液后在血液環(huán)境中的穩(wěn)定性[6]。以PBS模擬血液的pH環(huán)境，評價四種藥品在不同劑量條件下的穩(wěn)定性。根據鹽酸氨溴索注射液的臨床用藥情況，分別考察不同廠家、不同劑量下（60、120、240、480 mg）與100 ml磷酸緩沖液（pH 7.4 PBS）混勻后0、0.5、1.0、1.5、2.0 h的穩(wěn)定性。

1.4.2 鹽酸氨溴索注射劑緩沖能力比較 考察不同廠家的鹽酸氨溴索注射液在pH 7.4 PBS溶液中pH的改變。鹽酸氨溴索注射液5 ml（粉針劑用注射用水復溶，15 mg/2 ml），以pH 7.4 PBS滴定測定注射液pH的改變。

1.5 鹽酸氨溴索注射劑比格犬體內藥物動力學評價1.5.1 實驗動物 比格犬，普通級，年齡7～8月齡，體重8.0～12.0 kg，24只，雌雄各半。由復旦大學實

驗動物中心供應。

1.5.2 實驗方案 采用隨機、自身交叉試驗設計，測定三種劑量四種鹽酸氨溴索制劑比格犬體內藥物動力學參數。將24只比格犬按雌雄各半隨機分為四組，自身交叉靜脈注射四種鹽酸氨溴索制劑，交叉試驗的凈化期為7 d。四種制劑的給藥劑量均為3、12、48 mg/kg。試驗制劑需在給藥前用0.9%氯化鈉注射液稀釋至相同體積，分別于靜脈給藥前及給藥后0.083、0.25、0.5、1、2、3、4、6、8、12、24 h由后肢靜脈采血1 ml，肝素抗凝，離心10 min（12 000 r/min），分取血漿，-20 ℃保存[7-8]。

1.5.3 樣品處理 精密吸取待測血漿50 L置于1.5 ml離心管中，加入甲苯磺丁脲內標甲醇溶液（100 ng/ml）250 μL，渦漩混勻20 s，沉淀蛋白后，離心10 min（12 000 r/min），吸取上清液100 μL，加入100 μL蒸餾水混合[7-8]。在前述HPLC-MS/MS條件下測定，記錄鹽酸氨溴索與內標的峰面積比值。

1.5.4 數據分析 Cmax用實測數值表示；藥時曲線下面積（AUC）用梯形法計算；四種鹽酸氨溴索制劑的藥物動力學參數的統(tǒng)計學分析，應用t檢驗，判定藥物動力學參數差異的顯著性：*P＜0.05為顯著，**P＜0.01為非常顯著。

2 結果

2.1 鹽酸氨溴索注射液用藥過程穩(wěn)定性評價

2.1.1 鹽酸氨溴索注射液在磷酸緩沖液（pH 7.4， PBS）中的穩(wěn)定性 以PBS模擬血液的pH環(huán)境，評價四種藥品不同劑量（60、120、240、480 mg）條件下在pH 7.4 PBS中的穩(wěn)定性。結果表明：兩種水針劑A制劑與B制劑在pH 7.4 的PBS中相對比較穩(wěn)定，在低劑量時2 h內含量沒有明顯變化。兩種粉針劑C制劑和D制劑2 h時在低劑量時含量明顯下降（＞3%）；高劑量時，含量降低超過10%。見圖1。

圖1 不同廠家的鹽酸氨溴索注射劑在pH 7.4 PBS中的穩(wěn)定性(n=6)

2.1.2 鹽酸氨溴索注射液緩沖能力比較 考察不同廠家的鹽酸氨溴索制劑在PBS溶液中pH的改變。結果如圖2所示，表明四種制劑的緩沖能力具有明顯差別，水針劑的緩沖能力要明顯強于粉針劑。粉針劑在少量PBS滴定下，其pH快速達到6，而水針劑在大量PBS滴定下，其pH值始終小于6.0。

2.2 鹽酸氨溴索比格犬體內藥物動力學

2.2.1 方法學驗證[9-10]①專屬性：鹽酸氨溴索的保留時間為1.43 min左右，內標甲苯磺丁脲的保留時間為3.34 min，其他均為內源性雜質。在所建立的LC-MS/MS分析條件下，藥物和內源性雜質均分離完全，內源性雜質不干擾鹽酸氨溴索的測定。

②基質效應：取比格犬空白血漿180 μL，加入含不同濃度的鹽酸氨溴索標準溶液20 μL，使樣品濃度分別為50、500、5000 ng/ml，按1.5.3項下所述方法進行樣品測定，以同一濃度鹽酸氨溴索標準溶液作為對照，以峰面積比作為檢出率，并以檢出率與100%標準偏差衡量血漿樣品中鹽酸氨溴索生物樣品

的基質效應。結果表明：低、中、高濃度的生物樣品的檢出率為90.26%～108.59%，鹽酸氨溴索樣品與標準品的偏差為-9.74%～8.59%，說明基質效應很小，即無明顯抑制也無明顯增強作用。

圖2 不同廠家鹽酸氨溴索注射劑在PBS滴定下的pH變化曲線(n=3)

以上分析方法評價結果顯示，建立的鹽酸氨溴索體內血漿樣品LC-MS/MS方法專屬性好，內源性雜質對樣品測定無干擾，分析藥物與內標及血漿內源性物質達到完全分離，且樣品處理簡單。精密度及回收率均符合規(guī)定，該體內生物樣品測定方法穩(wěn)定、靈敏、重現性好。

2.2.2 四種制劑低、中、高劑量血藥濃度-時間曲線和AUC（0-∞）本研究采用隨機實驗設計，平行觀察并比較了比格犬靜脈注射四種制劑三種劑量的鹽酸氨溴索的藥物動力學過程。四種制劑三種劑量鹽酸氨溴索血藥濃度-時間曲線和AUC（0-∞）如圖3所示。

圖3 比格犬靜滴不同劑量鹽酸氨溴索注射劑后的平均血藥濃度-時間曲線(n=6)

表3 比格犬靜滴不同劑量鹽酸氨溴索注射劑后的AUC（0-∞）(g/ml·h)比較(n=6)

由表3結果可以看出，低劑量組（3 mg/kg）B、C、D廠相對于原研藥A廠的平均AUC之比分別為98.16%、87.29%、97.76%，其中C廠AUC明顯降低約13%，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；中劑量組（12 mg/kg）B、C、D廠相對于A廠的平均AUC之比分別為95.73%、88.48%、95.94%，其中C廠AUC降低約13%，B與D廠降低約4%；高劑量組（48 mg/kg）B、C、D廠相對于A廠的平均AUC之比分別為94.07%、83.41%、89.50%，其中C廠AUC降低約17%，D廠降低約10%?？梢园l(fā)現，不同劑量的B、C、D廠的生物利用度數值均低于A廠，且C廠的生物利用度最低，提示藥物制劑配方的差異可能在一定程度上影響藥物的生物利用度。

2.2.3 四種制劑低、中、高劑量t1/2與AUC（0-∞）的比較分析 圖4結果顯示，四種制劑的藥物生物半衰期t1/2隨劑量增加而改變，提示該藥物體內動力學可能為非線性藥物動力學過程。圖5結果顯示，四種制劑的AUC（0-∞）隨劑量增加呈現非線性增加的趨勢，進一步表明該藥物體內動力學可能為非線性藥物動力學過程。

3 討論

不同廠家的鹽酸氨溴索制劑在不同劑量下（60、120、240、480 mg）與pH 7.4 PBS混合后測定含量與pH，結果發(fā)現粉針劑在PBS中的穩(wěn)定性明顯低于水針劑，尤其是在高濃度時，其含量在2 h時明顯降低。通過比較四種制劑的緩沖能力可以發(fā)現：水針劑的緩沖能力要明顯強于粉針劑。粉針劑在少量的PBS滴定下，其pH快速達到6，而水針劑在大量PBS滴定下，其pH值始終小于6.0。分析其處方組成發(fā)現，A與B制劑中均含有緩沖鹽，因此具有較好的緩沖能力，其中B制劑由于采用磷酸二氫鈉使注射液pH偏低（pH 4.0左右）。C與D制劑處方中除主藥外僅含有甘露醇，不具有緩沖能力，因此遇到較高的pH溶液時，其pH快速增加。

圖4 鹽酸氨溴索注射劑t1/2與劑量的關系

圖5 鹽酸氨溴索注射劑AUC（0-∞）與劑量的關系

采用液質聯用檢測技術建立測定生物樣品中鹽酸氨溴索的定量方法，方法學指標均可滿足鹽酸氨溴索制劑藥代動力學研究的要求。相對于高效液相色譜法（HPLC），此方法靈敏度高，生物樣品用量少，解決了檢測靈敏度低的問題。雖然，四種制劑在不同劑量條件下AUC（0-∞）上差異無統(tǒng)計學意義，

但是在數值上可以發(fā)現，C制劑在低劑量下其絕對生物利用度已明顯降低，并且在高劑量條件下進一步降低到83.41%；D制劑在高劑量條件下絕對生物利用度也出現明顯的降低，降低約10%。兩種鹽酸氨溴索凍干粉針劑的絕對生物利用度的降低可能與制劑的凍干工藝及原料藥的差異有關。在前期的藥物穩(wěn)定性研究中已發(fā)現，粉針劑在pH 7.4 PBS的環(huán)境中，約10%的藥物析出，從體內的藥物動力學和生物利用度分析結果進一步證明了這兩種制劑給藥后藥物可能在血漿環(huán)境中析出，從而降低該制劑的生物利用度。比較靜脈滴注不同劑量的四種鹽酸氨溴索制劑的藥-時曲線和藥物動力學參數，經劑量校正后，四種鹽酸氨溴索制劑在3、12和48 mg/kg三個劑量組的t1/2與AUC均呈現出非線性動力學的趨勢，表明鹽酸氨溴索在所考察的劑量范圍內（3～48 mg/kg），靜脈給藥后藥物在比格犬體內的藥物動力學行為隨著劑量的增加可能呈現體內非線性動力學消除過程。由于受種屬差異性等生理因素的影響，不同制劑的人體內藥物動力學是否會產生差異性以及引起藥效的區(qū)別，還需要進一步的臨床研究與評價。

藥品的質量是決定其有效性與安全性的重要保證。在藥物制劑處方和工藝研究中，需要全面系統(tǒng)的對影響藥物質量的各個因素進行分析和評價，選擇合理的試驗設計方法以獲得藥物制劑最全面、最準確的信息，對于藥物制劑的研究非常重要。本實驗從兩個角度充分驗證了處方中緩沖鹽體系的存在對于提高藥物穩(wěn)定性的必要性和重要性，尤其是原研制劑A體現了“質量源于設計”（Quality by Design, QbD）的制劑研發(fā)理念。

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In-depth evaluation of stability and in vivo pharmacokinetics of Ambroxol Hydrochloride Injections

Zhang Xiulei Qian Jianghui Ren Xiaoqing Sha Xianyi

Objective To deep evaluate stability and pharmacokinetics of four ambroxol hydrochloride injections at physiological pH.Methods pH 7.4 phosphate buffer solution (PBS) was used to simulate physiological pH of blood, and the content and pH change of four preparations were measured after mixed with pH7.4 PBS at different dosages. The plasma concentration of ambroxol hydrochloride was determined by HPLC-MS/MS,and pharmacokinetics of four ambroxol hydrochloride preparations in beagle dogs were investigated by randomized,self-crossed design.Results In pH 7.4 PBS,A and B two ambroxol hydrochloride water injection were relatively stable;for C and D two powder injection of ambroxol hydrochloride for injection, content decreased at low-dose, and decreased more than 10% at high-dose.The buffering ability of four preparations was obviously different,and buffering ability of water injection was obviously stronger than that of powder injection.The bioavailability of C and D preparations in medium and high doses was significantly lower than that of A preparation, suggesting that differences in formulation of ambroxol hydrochloride injection may affect bioavailability of drug.The biological half-life t1/2of four preparations changed with increasing dose, and AUC(0-∞)showed a nonlinear increased trend with increasing dose,indicating that pharmaco- kinetics of drug may be nonlinear pharmacokinetic processes.Conclusion The stability of ambroxol hydrochloride in PBS was enhanced by addition of buffer system in formulation of ambroxol hydrochloride injection,which was beneficial to improve in vivo stability of drug.

Buffer capacity;HPLC-MS/MS;Bioavailability;Quality evaluation

R927.11

A 【DOI】10.12010/j.issn.1673-5846.2016.11.002

復旦大學，上海 201203

張秀磊（1993-），碩士研究生。研究方向：藥物新劑型與新制劑。E-mail：15211030022@fudan.edu.cn

沙先誼（1976-），博士，副教授。研究方向：藥物新劑型與新制劑。E-mail：shaxy@fudan.edu.cn