湯亞飛, 何自福*, 佘小漫, 藍(lán)國(guó)兵

(1. 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 廣州 510640; 2. 廣東省植物保護(hù)新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣州 510640)

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實(shí)驗(yàn)方法與技術(shù)

辣椒黃脈病毒RT-LAMP快速檢測(cè)方法的建立

湯亞飛1,2, 何自福1,2*, 佘小漫1, 藍(lán)國(guó)兵1

(1. 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 廣州 510640; 2. 廣東省植物保護(hù)新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣州 510640)

辣椒黃脈病毒(Pepperveinyellowsvirus,PeVYV)是影響世界辣椒生產(chǎn)的重要病毒,也是廣東省辣椒上主要病原病毒之一。本研究根據(jù)PeVYV基因組P3蛋白基因序列設(shè)計(jì)了2對(duì)引物,建立了該病毒的反轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(reverse transcription loop mediated isothermal amplification,RT-LAMP)檢測(cè)方法。該方法70 min便可完成對(duì)PeVYV的檢測(cè),無需特殊的設(shè)備,靈敏度比普通RT-PCR高10倍,對(duì)田間疑似病樣的檢出結(jié)果與RT-PCR的結(jié)果一致。本研究建立的PeVYV RT-LAMP檢測(cè)方法具有快速、靈敏和操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn),適合于對(duì)PeVYV病樣快速、準(zhǔn)確檢測(cè)與鑒定。

辣椒黃脈病毒; RT-LAMP; 快速檢測(cè)

辣椒黃脈病毒(Pepperveinyellowsvirus,PeVYV)屬黃癥病毒科(Luteoviridae)馬鈴薯卷葉病毒屬(Polerovirus)成員,由蚜蟲以持久方式傳播,也可以嫁接傳播[1]。該病毒在日本[1-2]、西班牙[3]、突尼斯、土耳其[4]、印度、印度尼西亞、菲律賓、泰國(guó)[5]、蘇丹[6]和美國(guó)[7]等國(guó)家均有分布。我國(guó)的臺(tái)灣[5]、湖南[8]和山東[9]等省也先后報(bào)道了該病毒。辣椒感染黃脈病毒后主要表現(xiàn)為葉脈黃化、葉片卷曲、節(jié)間縮短等,其產(chǎn)量和品質(zhì)受到嚴(yán)重影響。

建立快速、靈敏和特異的檢測(cè)鑒定方法是植物病毒病診斷、防治和預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)的前提與基礎(chǔ)。目前,PeVYV的檢測(cè)主要采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)[6,9]。相對(duì)于血清學(xué)檢測(cè)方法,該方法較快速(6 h左右)、靈敏和特異,但需要高精度的PCR儀及較復(fù)雜的方法來檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物,使其在日常診斷中受到限制。日本學(xué)者Notomi等開發(fā)了一種新型的核酸擴(kuò)增方法——環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop mediated isothermal amplification,LAMP)技術(shù)[10]。該技術(shù)采用4條特異引物識(shí)別靶序列上6個(gè)特異區(qū)域,利用DNA 鏈置換聚合酶(BstDNA polymerase)在恒溫條件下對(duì)靶基因擴(kuò)增。RT-LAMP 方法是在LAMP 方法的基礎(chǔ)上添加了反轉(zhuǎn)錄酶(AMV),使反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增在同一溫度下進(jìn)行。相對(duì)RT-PCR來說,該技術(shù)更加簡(jiǎn)便、快速(70 min左右)、特異。該技術(shù)已被應(yīng)用于番茄[11-12]、柑橘[13-14]、香蕉[15]、水稻[16-17]、小麥[18]、馬鈴薯[19-21]、草莓[22]、蘭花[23]等多種作物的病毒病檢測(cè)。本文以PeVYV的P3蛋白基因序列為靶標(biāo)基因,設(shè)計(jì)了4 條特異性引物,建立了該病毒的RT-LAMP快速檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

感染PeVYV的辣椒病樣:采自廣東茂名市辣椒產(chǎn)區(qū),經(jīng)RT-PCR檢測(cè)驗(yàn)證,置于-80℃保存;健康辣椒材料:本實(shí)驗(yàn)室在防蟲溫室中培育的健康辣椒葉片;待檢材料:采自廣東省各辣椒產(chǎn)區(qū)疑似辣椒病葉。

Loopamp RNA 擴(kuò)增反應(yīng)試劑盒、Loopamp FD 熒光檢測(cè)試劑購(gòu)自日本Eiken Chemical 公司；RNA提取試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；一步法RT-PCR試劑盒購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；LA-320C 實(shí)時(shí)濁度儀由日本Eiken Chemical 公司提供。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

依據(jù)GenBank中已登錄的PeVYV基因組(GenBank序列登錄號(hào):AB594828.1、KP326573.1)的P3蛋白基因序列,應(yīng)用LAMP 引物設(shè)計(jì)軟件Primer Explorer V.4 (http:∥primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)設(shè)計(jì)外側(cè)引物對(duì)F3和B3以及內(nèi)側(cè)引物對(duì)FIP和BIP,將引物在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中Primer-BLAST模塊下進(jìn)行比對(duì)驗(yàn)證,最終選出用于RT-LAMP的引物組合(表1)。應(yīng)用PCR引物設(shè)計(jì)網(wǎng)站(http:∥primer3.ut.ee/),設(shè)計(jì)目的片段為562 bp的特異引物對(duì)P-F/P-R(表1)用于PeVYV的RT-PCR檢測(cè)。所有引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2.2 總RNA的提取

取辣椒病葉100 mg,應(yīng)用RNA提取試劑盒抽提其總 RNA,根據(jù)試劑盒說明書的步驟進(jìn)行操作,最終RNA沉淀溶解于40 μL DEPC處理的ddH2O中。

1.2.3 RT-LAMP反應(yīng)體系及最佳反應(yīng)溫度

按照Loopamp RNA 擴(kuò)增試劑盒的說明配制RT-LAMP反應(yīng)體系,即:2×反應(yīng)緩沖液12.5 μL,酶溶液1.0 μL,40 pmol/μL引物FIP 1.0 μL,40 pmol/μL引物BIP 1.0 μL,10 pmol/μL引物F3 0.5 μL,10 pmol/μL引物B3 0.5 μL,熒光目視檢測(cè)試劑1.0 μL,RNA模板1.0 μL,去離子水6.5 μL,反應(yīng)總體系為25 μL。反應(yīng)溫度分別設(shè)為59℃、61℃、63℃ 和65℃,反應(yīng)時(shí)間為60 min,之后加熱至80℃ 5 min使酶失活。擴(kuò)增反應(yīng)在實(shí)時(shí)濁度儀上進(jìn)行,根據(jù)60 min 內(nèi)出現(xiàn)擴(kuò)增曲線的最短時(shí)間確定最佳反應(yīng)溫度。反應(yīng)結(jié)束后,根據(jù)反應(yīng)液顏色進(jìn)行判斷,若顯綠色,則為陽(yáng)性反應(yīng);若顯橙色,則判斷為陰性反應(yīng)。進(jìn)一步通過電泳加以驗(yàn)證,取2 μL擴(kuò)增產(chǎn)物,在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%的瓊脂糖凝膠上100～125 V恒壓電泳30 min,然后在紫外檢測(cè)儀下觀察。

表1 RT-LAMP 和RT-PCR檢測(cè)PeVYV 的引物

1.2.4 RT-PCR

RT-PCR反應(yīng)參照一步法RT-PCR試劑盒說明操作,即:PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 2.0 μL,2×1 Step Buffer(Dye Plus)25.0 μL,10 μmol/L 引物P-F 2.0 μL,10 μmol/L 引物P-R 2.0 μL,RNA模板1.0 μL,去離子水18 μL,總體系為50 μL。反應(yīng)條件為:50℃反轉(zhuǎn)錄30 min;94℃預(yù)變性4 min,94℃變性30 min、52℃退火30 s、72℃延伸1 min,35個(gè)循環(huán),72℃最終延伸10 min,取 8 μL擴(kuò)增產(chǎn)物在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%的瓊脂糖凝膠上100～125 V恒壓電泳30 min,在紫外檢測(cè)儀下觀察并記錄結(jié)果。

1.2.5 靈敏度試驗(yàn)

將所提取的辣椒病葉片組織的總RNA按10-1～10-8進(jìn)行濃度梯度稀釋,以不同濃度的RNA作模板,分別進(jìn)行RT-LAMP和普通RT-PCR檢測(cè),比較兩者的檢測(cè)靈敏度。

1.2.6 PeVYV田間疑似病樣RT-LAMP檢測(cè)

從廣東省各辣椒產(chǎn)區(qū)采集疑似感染PeVYV的辣椒病樣6份,提取總RNA,分別用1.2.3的RT-LAMP方法檢測(cè),并用RT-PCR 方法加以驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-LAMP最佳反應(yīng)溫度

以感染PeVYV辣椒病葉組織的總RNA為模板,進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng),實(shí)時(shí)濁度儀輸出的擴(kuò)增時(shí)間曲線(圖1)表明:在59、61、63 和65℃的反應(yīng)溫度下,RT-LAMP反應(yīng)分別在約42、34、29 和27 min 時(shí)擴(kuò)增曲線開始上升。反應(yīng)結(jié)束后,肉眼觀察到各溫度處理反應(yīng)液均呈綠色,而空白對(duì)照呈橙色(圖2)。根據(jù)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)時(shí)間盡可能短的要求,確定65℃為最佳反應(yīng)溫度。

圖1 RT-LAMP各反應(yīng)溫度下的擴(kuò)增曲線Fig.1 Amplification curve of RT-LAMP assay at different temperatures

圖2 RT-LAMP各溫度處理的反應(yīng)液顏色變化Fig.2 Color change of RT-LAMP products at different temperatures

2.2 靈敏度檢測(cè)結(jié)果

將感染PeVYV的辣椒病葉片組織總RNA進(jìn)行10倍系列稀釋作為模板,分別進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)和RT-PCR反應(yīng)。應(yīng)用RT-LAMP方法,在模板稀釋倍數(shù)為10-4時(shí),反應(yīng)液呈明顯綠色(陽(yáng)性反應(yīng)),電泳時(shí)擴(kuò)增的目的條帶清晰;當(dāng)模板稀釋倍數(shù)為10-5時(shí),反應(yīng)液也呈現(xiàn)綠色,電泳時(shí)仍可見擴(kuò)增的條帶;但模板稀釋倍數(shù)為10-6時(shí),反應(yīng)液呈現(xiàn)橙色,電泳無目的條帶(陰性反應(yīng))(圖3～4)。應(yīng)用RT-PCR方法,在模板稀釋倍數(shù)為10-4時(shí),電泳時(shí)擴(kuò)增的目的條帶已經(jīng)非常弱;當(dāng)模板稀釋倍數(shù)為10-5時(shí),RT-PCR已不能擴(kuò)增出目的條帶(圖5)。因此,檢測(cè)PeVYV,RT-LAMP方法比RT-PCR方法靈敏度高10倍。

2.3 疑似病樣的RT-LAMP檢測(cè)結(jié)果

對(duì)來自廣東省不同辣椒產(chǎn)區(qū)的6份疑似感染PeVYV病樣,采用RT-LAMP方法進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示(圖6),疑似病樣1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)、5號(hào)為陽(yáng)性,4號(hào)和6號(hào)為陰性。進(jìn)一步應(yīng)用RT-PCR加以驗(yàn)證,其檢測(cè)結(jié)果(圖7)與RT-LAMP結(jié)果一致,兩者的符合率為100%。這表明所建立的PeVYV RT-LAMP 檢測(cè)方法能夠?qū)崿F(xiàn)田間病樣的快速、準(zhǔn)確檢測(cè)與診斷。

3 討論

本研究建立的PeVYV RT-LAMP 檢測(cè)方法快速、簡(jiǎn)便、靈敏和特異。應(yīng)用該方法可在70 min內(nèi)完成對(duì)PeVYV的檢測(cè),而常規(guī)的RT-PCR檢測(cè)則需要6 h左右,大幅度縮短了檢測(cè)時(shí)間。整個(gè)擴(kuò)增過程可在恒溫水浴鍋或烘箱中進(jìn)行,反應(yīng)結(jié)果可以通過肉眼直接觀察擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物的顏色變化進(jìn)行判定,檢測(cè)方法簡(jiǎn)便,克服了RT-PCR檢測(cè)方法在實(shí)際應(yīng)用中的局限與不足。在靈敏度方面,RT-LAMP的檢測(cè)靈敏度比RT-PCR高10倍。另外,由于RT-LAMP所利用的引物需要識(shí)別靶序列上6個(gè)特異性區(qū)域,而常規(guī)的RT-PCR方法引物只識(shí)別靶序列上2個(gè)特異性區(qū)域,因此RT-LAMP具有更高的特異性。

圖4 RT-LAMP靈敏度試驗(yàn)電泳結(jié)果Fig.4 Electrophoresis result of sensitivity assay of RT-LAMP detection

圖5 RT-PCR靈敏度試驗(yàn)電泳結(jié)果Fig.5 Electrophoresis result of sensitivity assay of RT-PCR detection

圖6 田間辣椒病樣的RT-LAMP檢測(cè)結(jié)果Fig.6 Detection results of pepper samples from fields by RT-LAMP

由于RT-LAMP技術(shù)靈敏度高、產(chǎn)物擴(kuò)增量大,微量的污染(如空氣中的陽(yáng)性氣溶膠微粒)都有可能導(dǎo)致假陽(yáng)性,因此操作過程中一定要保證試驗(yàn)環(huán)境、器具以及試劑等免受RNA或擴(kuò)增產(chǎn)物的污染,檢測(cè)的各個(gè)環(huán)節(jié)要嚴(yán)格分區(qū)進(jìn)行;同時(shí)操作過程盡量減少開蓋操作次數(shù)等。本研究所建立的PeVYV RT-LAMP 檢測(cè)方法將所有的反應(yīng)成分及熒光目視檢測(cè)試劑一次性加入到反應(yīng)管中進(jìn)行反應(yīng),中間不再開蓋,待反應(yīng)結(jié)束后直接觀察反應(yīng)液的顏色來判斷結(jié)果,大幅度降低了假陽(yáng)性產(chǎn)生的可能性。

圖7 田間辣椒病樣的RT-PCR檢測(cè)Fig.7 Detection results of pepper samples from fields by RT-PCR

PeVYV是辣椒上重要病毒之一。自1995年Yonaha等在日本首次報(bào)道發(fā)現(xiàn)PeVYV以來[1],近幾年，亞洲、非洲、歐洲、美洲的多個(gè)國(guó)家陸續(xù)報(bào)道發(fā)生該病毒。2013年我國(guó)臺(tái)灣首次報(bào)道發(fā)現(xiàn)該病毒[5],隨后在山東和湖南等省份也檢測(cè)到該病毒[8-9]。本團(tuán)隊(duì)對(duì)廣東省辣椒病毒病發(fā)生情況進(jìn)行了調(diào)查,發(fā)現(xiàn)疑似辣椒黃脈病毒病,應(yīng)用小RNA測(cè)序技術(shù)及RT-LAMP方法對(duì)其病毒種類進(jìn)行鑒定與檢測(cè),發(fā)現(xiàn)PeVYV在廣東省主要辣椒產(chǎn)區(qū)均有分布,疑似病樣的檢測(cè)陽(yáng)性率為38.3%,且常與甜椒脈斑駁病毒(Pepperveinalmottlevirus,PVMV)、辣椒葉脈斑駁病毒(Chilliveinalmottlevirus,ChiVMV)、黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus,CMV)等病毒復(fù)合侵染或混合發(fā)生,說明PeVYV是引起廣東辣椒病毒病的主要病原病毒之一。需要進(jìn)一步弄清其分布、發(fā)生規(guī)律及辣椒品種的抗性水平,為預(yù)防與控制該病毒病的發(fā)生提供科學(xué)依據(jù)。

[1] Yonaha T, Toyosato T, Kawano S, et al.Pepperveinyellowsvirus, a novel luteovirus from bell pepper plants in Japan [J]. Annals of the Phytopathological Society of Japan, 1995, 61(3): 178-184.

[2] Murakami R, Nakashima N, Hinomoto N, et al. The genome sequence ofPepperveinyellowsvirus(familyLuteoviridae, genusPolerovirus)[J]. Archives of Virology, 2011, 156(5): 921-923.

[3] Villanueva F, Castillo P, Font M I, et al. First report ofPepperveinyellowsvirusinfecting sweet pepper in Spain[J]. Plant Disease, 2013, 97(9): 1261-1262.

[4] Buzkan N, Arpaci B B, Simon V, et al. High prevalence of poleroviruses in field-grown pepper in Turkey and Tunisia [J]. Archives of Virology, 2013, 158(4): 881-885.

[5] Knierim D, Tsai W S, Kenyon L.Analysis of sequences from field samples reveals the presence of the recently describedPepperveinyellowsvirus(genusPolerovirus) in six additional countries [J]. Archives of Virology, 2013, 158(6): 1337-1341.

[6] Alfaro-Fernández A, ElShafie E E, Ali M A, et al. First report ofPepperveinyellowsvirusinfecting hot pepper in Sudan[J]. Plant Disease, 2014, 98(10): 1446.

[7] Alabi O J, Rwahnih M Al, Jifon J L, et al. First report ofPepperveinyellowsvirusinfecting pepper (Capsicumspp.) in the United States [J]. Plant Disease, 2015, 99(11): 1656.

[8] Zhang S B, Zhao Z B, Zhang D Y, et al. First report ofPepperveinyellowsvirusinfecting red pepper in mainland China[J]. Plant Disease, 2015, 99(8): 1190.

[9] Tan W P, Dong Y Z, Sun X H, et al. The first identification ofPepperveinyellowsvirusin Shandong Province, China [J].Plant Disease, 2015, 99(9): 1288.

[10]Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA [J]. Nucleic Acids Research, 2000, 28(12): e63.

[11]Zhao Liming, Li Gang, Gao Ying, et al. Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay for detectingTomatochlorosisvirus[J]. Journal of Virological Methods, 2015, 213: 93-97.

[12]Fukuta S, Ohishi K, Yoshida K, et al. Development of immunocapture reverse transcription loop-mediated isothermal amplification for the detection ofTomatospottedwiltvirusfrom chrysanthemum [J]. Journal of Virological Methods, 2004, 121(1): 49-55.

[13]劉科宏, 陳洪明, 周彥, 等. 柑橘黃化脈明病毒RT-LAMP檢測(cè)方法的建立[J]. 園藝學(xué)報(bào), 2015, 42(5): 997-1002.

[14]王永江, 周彥, 李中安, 等. 柑橘衰退病毒RT-LAMP快速檢測(cè)方法的建立[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013, 46(3): 517-524.

[15]Peng Jun, Shi Minjing, Xia Zihao, et al. Detection ofCucumbermosaicvirusisolates from banana by one-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification [J]. Archives of Virology, 2012, 157(11): 2213-2217.

[16]周彤, 杜琳琳, 范永堅(jiān), 等. 水稻黑條矮縮病毒RT-LAMP快速檢測(cè)方法的建立[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 45(7): 1285-1292.

[17]Le D T, Netsu O, Uehara-Ichiki T, et al. Molecular detection of nine rice viruses by a reverse-transcription loop-mediated isothermal amplification assay[J]. Journal of Virological Methods, 2010, 170: 90-93.

[18]Zhao Kun, Liu Yan, Wang Xifeng. Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification of DNA for detection ofBarleyyellowdwarfvirusesin China [J]. Journal of Virological Methods, 2010, 169(1): 211-214.

[19]劉洪義, 辛言言, 劉忠梅, 等. 馬鈴薯A病毒RT-LAMP檢測(cè)方法的建立[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2015, 31(11): 143-147.

[20]Nie Xianzhou. Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification of DNA for detection ofPotatovirusY[J]. Plant Disease, 2005, 89(6): 605-610.

[21]Tsutsumi N, Yanagisawa H, Fujiwara Y, et al. Detection ofPotatospindletuberviroidby reverse transcription loop-mediated isothermal amplification[J]. Research Bulletin of the Plant Protection Service, Japan, 2010, 46: 61-67.

[22]陳柳, 尚巧霞, 陳笑瑜, 等. 草莓輕型黃邊病毒RT-LAMP檢測(cè)方法的建立[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015, 48(3): 613-620.

[23]Lee M S, Yang M J, Hseu Y C, et al. One-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay for rapid detection ofCymbidiummosaicvirus[J]. Journal of Virological Methods, 2011, 173(1): 43-48.

(責(zé)任編輯:楊明麗)

Development of RT-LAMP for rapid detection of Pepper vein yellows virus

Tang Yafei1,2, He Zifu1,2, She Xiaoman1, Lan Guobing1

(1. Plant Protection Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510640, China;2. Guangdong Provincial Key Laboratory of High Technology for Plant Protection, Guangzhou 510640, China)

Pepperveinyellowsvirus(PeVYV) is an important virus of pepper worldwide. It is also one of the main pathogenic viruses infecting pepper in Guangdong Province. By using primer explorer software, two pairs of primers were designed according to the P3 gene sequence of PeVYV.The reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) detection method of PeVYV was developed. The PeVYV detection could be finished within 70 min by using this method and needs no special equipment. Its sensitivity was 10 times higher than that of ordinary RT-PCR.The detection result of suspected samples collected from fields by the method was consistent with that by RT-PCR.The advantages of RT-LAMP detection method for PeVYV were rapid, sensitive and simple. Hence,the method is suitable for rapid and accurate detection and identification of PeVYV.

Pepperveinyellowsvirus; RT-LAMP; rapid detection

Experimental Method & Technology

2015-12-16

2016-02-04

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201303028); 廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013B020309003; 2014B070706017)

S 436.418

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.06.017

* 通信作者 E-mail: hezf@gdppri.com