孫曉東, 李富恒, 閻 偉, 李朝緒, 呂朝軍, 覃偉權(quán)*

(1. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院椰子研究所, 文昌 571339; 2. 東北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院, 哈爾濱 150030)

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椰子織蛾高毒力金龜子綠僵菌菌株的篩選

孫曉東1,2, 李富恒2, 閻 偉1, 李朝緒1, 呂朝軍1, 覃偉權(quán)1*

(1. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院椰子研究所, 文昌 571339; 2. 東北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院, 哈爾濱 150030)

椰子織蛾是為害熱帶地區(qū)棕櫚科植物的重要害蟲,本試驗對從海南省陵水縣采集的椰子織蛾僵蟲上分離得到的4株金龜子綠僵菌進行了分子生物學鑒定,并測定了其對椰子織蛾3齡幼蟲的室內(nèi)生物活性,篩選出了高毒力菌株LS-Y1。試驗結(jié)果表明,經(jīng)NCBI BLAST比對,4株菌株的rDNA-ITS序列與GenBank中已知基因序列相似性分別為99%、100%、99%、99%。菌株LS-Y1 處理椰子織蛾3 齡幼蟲后6 d 的LC50為4.41×106個/mL。6.25×106、1.25×107、2.5×107、5×107和1×108個/mL 濃度處理下,金龜子綠僵菌LS-Y1 對椰子織蛾3齡幼蟲的 LT50分別為5.77、4.88、4.43、3.82和3.36 d。該菌株對椰子織蛾幼蟲具有較高毒力,具有較好的生防潛力。

金龜子綠僵菌; 椰子織蛾; 分子鑒定; 毒力

椰子織蛾(OpisinaarenosellaWalker)(又稱椰子木蛾、黑頭履帶蟲、椰蛀蛾、食葉履帶蟲[1]),屬鱗翅目(Lepidoptera)織蛾科(Oecophoridae),英文名coconut black headed caterpillar,是一種嚴重為害椰子、檳榔、蒲葵、中東海棗、大王棕等棕櫚作物的外來入侵有害生物[2],目前主要分布于印度、泰國、印度尼西亞、馬來西亞、斯里蘭卡、孟加拉、緬甸、巴基斯坦等地[3]。椰子織蛾幼蟲取食葉片,嚴重時整個樹冠被啃食從而導致植株發(fā)育緩慢、果實產(chǎn)量大幅減少甚至絕產(chǎn)[4]。近年來棕櫚作物作為經(jīng)濟作物和園林景觀植物從國外大量引入并在我國南方大面積種植,導致椰子織蛾在我國暴發(fā)的可能性越來越大[5],目前海南、廣西、廣東三省已有大面積為害的報道[6]。2014年3月椰子織蛾被列為全國林業(yè)危險性有害生物。

目前椰子織蛾主要還是依靠化學防治[4, 7],化學藥劑雖然在一定程度上可以快速控制該蟲,但是其引起的殘留、抗性與再猖獗等問題嚴重影響到自然環(huán)境與人類的健康。利用寄生蜂防控椰子織蛾在印度、斯里蘭卡等國取得了一定的效果,但是國內(nèi)尚未有效開展優(yōu)質(zhì)寄生蜂品種引進與大面積飼養(yǎng)、釋放[3, 8],因此如何結(jié)合國內(nèi)現(xiàn)有研究基礎(chǔ)尋找更加科學有效的控制椰子織蛾為害的生物防治手段顯得尤為重要。金龜子綠僵菌(Metarhiziumanisopliae)寄主范圍廣泛,能寄生直翅目、膜翅目、同翅目、雙翅目、鱗翅目、鞘翅目以及半翅目等7個目、42個科、約200余種昆蟲、線蟲及螨類[12]。金龜子綠僵菌是在生物防治上使用最為廣泛的昆蟲病原真菌之一,在森林、農(nóng)作物以及公共衛(wèi)生害蟲防控方面都進行了應(yīng)用效果的評估。如張澤華等人利用金龜子綠僵菌生防制劑成功防控蠐螬[11]、蝗蟲[10]、葉蟬[12]等害蟲,Amerasan等[9]發(fā)現(xiàn)金龜子綠僵菌對瘧疾的主要媒介昆蟲伊蚊有著十分明顯的防控效果。金龜子綠僵菌作為一種重要的生防真菌具有寄生物種多、適應(yīng)性強、致病周期短、靶標性強、對人類和牲畜不會造成毒害以及環(huán)境友好的特點。目前利用金龜子綠僵菌防控椰子織蛾尚未見相關(guān)報道。

本文針對椰子織蛾在海南省南部市縣為害嚴重的現(xiàn)狀,因地制宜地收集了對椰子織蛾有毒力的金龜子綠僵菌菌株,進行了高致病性金龜子綠僵菌菌株篩選與分子生物學鑒定,旨在提供優(yōu)良菌株用于生產(chǎn)防治棕櫚科植物的菌劑,為椰子織蛾的生物防控提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基[11]與SDAY選擇性培養(yǎng)基(4%葡萄糖、1%蛋白胨、1%酵母粉、2%瓊脂、100 μg/mL鏈霉素、100 μg/mL青霉素、多菌靈0.8 μg/mL)。

1.1.2 引物

由生工生物工程股份有限公司(廣州)合成真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)引物ITS 4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′),ITS 5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)[13]擴增致病菌的ITS 1-5.8S-ITS 2 rDNA區(qū)。

1.1.3 菌株

供試菌株分離自海南省陵水縣椰子織蛾幼蟲僵蟲。剝開椰子卷曲葉片,收集椰子織蛾幼蟲僵蟲并進行保濕培養(yǎng)和菌株的分離,然后轉(zhuǎn)接到SDAY選擇性培養(yǎng)基上進行篩選,經(jīng)顯微形態(tài)學鑒定為綠僵菌后進行純化培養(yǎng),共分離得到4株金龜子綠僵菌菌株,對照菌株R3是由紅棕象甲僵蟲中分離得到的金龜子綠僵菌[16],相關(guān)信息參見表1。

表1 供試金龜子綠僵菌菌株編號、寄主信息、采集時間與采集地

1.1.4 主要試蟲

椰子織蛾由本實驗室人工飼養(yǎng),飼料為新鮮椰子葉片,恒溫氣候箱中飼養(yǎng)條件:溫度為(28±1)℃,RH為飽和濕度,光周期為L∥D=12 h∥12 h。

1.1.5 主要試劑

2×TaqMix、凝膠回收試劑盒均購自TaKaRa公司;真菌基因組DNA快速抽提試劑盒購自Sangon Biotech 公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離純化

取采集的椰子織蛾僵蟲樣品,先用70%乙醇消毒1 min,無菌水清洗后再用0.1%的氯化汞表面消毒30 s,無菌水清洗3次,挑取少許僵蟲組織接種于SDAY選擇性培養(yǎng)基上,于(28±1)℃恒溫氣候箱中倒置培養(yǎng)3～4 d,選取單孢子接種于PDA培養(yǎng)基進行純化,每皿3點,呈三角形排列,石蠟?zāi)っ芊?0℃保存。

1.2.2 金龜子綠僵菌基因組DNA的提取與鑒定

將純化后的金龜子綠僵菌接種在PDA培養(yǎng)基上,26℃恒溫條件下培養(yǎng)72 h,無菌條件下刮取菌體并用紗布抽濾收集菌絲,使用真菌基因組提取試劑盒提取基因組DNA,將DNA沉淀溶解于300 μL無菌水中,加入RNA酶(終濃度50 μg/mL)處理溶液,使DNA充分溶解,-20℃保存?zhèn)溆谩TS鑒定PCR反應(yīng)體系參見Song Zhangyong[14]。PCR產(chǎn)物由生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序,采用Vector NTI 11軟件的AlignX進行rDNA-ITS同源性分析。

1.2.3 實驗室殺蟲活性測定

將純化的綠僵菌菌株在PDA培養(yǎng)基上畫線,28℃培養(yǎng)10 d后,無菌條件下刮取菌體,然后使用滅菌去離子水制備成菌懸浮液(含0.1%吐溫-80),將椰子葉片用清水洗凈晾干,選取鮮嫩一致的椰子葉片切成15 cm的葉段,在各個濃度的混合均勻的菌懸液(含0.1%吐溫-80)中浸泡5 min,晾干,放入生測瓶中,每瓶接椰子織蛾3齡幼蟲30頭,每個處理重復3次,28℃生化培養(yǎng)箱中保溫,培養(yǎng)2 d后調(diào)查死、活蟲數(shù),并觀察幼蟲取食情況,調(diào)查至第6天。

2 結(jié)果與分析

2.1 5株菌株的分子水平鑒定

LS-Y1、LS-Y6、LS-G2、LS-G3、R3 rDNA-ITS序列經(jīng)NCBI BLAST比對后與GenBank中已注冊序列JN377427.1、NR132017.1、FJ545278.1、FJ545294.1、GU909512.1的相似性最高，分別為99%、100%、99%、99%、98%,在分子水平鑒定5株菌株均為金龜子綠僵菌,具體結(jié)果見表2。

表2 菌株的序列比對結(jié)果與對椰子織蛾幼蟲的毒力1)

1) 表中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤,同列數(shù)據(jù)后不同字母者表示在0.05水平上差異顯著(DMRT 法)。Data were mean±SE, values in same column followed by different letters were significantly different at 0.05 level by DMRT.2.2 5株金龜子綠僵菌菌株對椰子織蛾的毒力

經(jīng)金龜子綠僵菌不同菌株配制的1.0×108個/mL孢子懸浮液處理后,椰子織蛾3齡幼蟲均有死亡,第4天的累計死亡率見表2。不同金龜子綠僵菌菌株對椰子織蛾的致病性存在很大差異,菌株LS-Y1、LS-Y6、R3對椰子織蛾的毒力較高,菌株LS-Y1對椰子織蛾的致病力最高,侵染后第4天,校正死亡率為66.67%,與菌株LS-G2、LS-G3差異顯著(P<0.05);菌株LS-G2對椰子織蛾的毒力最低,為17.22%。

2.3 綠僵菌菌株LS-Y1對椰子織蛾的毒力

生物測定結(jié)果顯示菌株LS-Y1對椰子織蛾幼蟲具有高殺蟲活性,第2天中毒的椰子織蛾陸續(xù)開始死亡,死亡蟲體色不變,但失去光澤,身體僵硬失去彈性。第3天部分蟲體長出白色菌絲;第4天部分蟲體全身長滿菌絲,且有淡綠色孢子產(chǎn)生;第5天橄欖綠色孢子覆蓋幼蟲全身(圖1a);而對照試蟲表現(xiàn)食量較大,蟲活躍,發(fā)育正常(圖1b)。

圖1 椰子織蛾3齡期染菌幼蟲與健康幼蟲比較Fig.1 Comparison of the diseased 3rd instar larvae of Opisina arenosella with the healthy larvae

利用IBM-SPSS 21.0軟件對椰子織蛾3齡期幼蟲進行半致死濃度分析,金龜子綠僵菌LS-Y1不同濃度處理椰子織蛾3齡幼蟲的致死濃度回歸方程為Y=4.15+1.32X,表明其致死率與濃度成正比,LC50為4.41×106個/mL,95%置信區(qū)間為2.63×106～7.41×106個/mL。在6.25×106、1.25×107、2.5×107、5×107和1×108個/mL 孢子濃度處理下,金龜子綠僵菌LS-Y1對椰子織蛾3齡幼蟲的 LT50分別為5.77、4.88、4.43、3.82和3.36 d,LT50隨著孢子懸浮液濃度的增加而遞減(圖2)。

圖2 金龜子綠僵菌菌株LS-Y1 不同濃度處理的椰子織蛾3齡幼蟲逐日累計死亡率Fig.2 The daily accumulative mortalities of the 3rd instar larvae of Opisina arenosella treated with the strain LS-Y1 at different spores concentrations

3 討論

本研究中的5株金龜子綠僵菌菌株在1×108個/mL 孢子濃度處理下,對椰子織蛾的室內(nèi)毒力差異較大,其中分離自第一寄主椰子織蛾的菌株LS-G2與LS-G3對椰子織蛾毒力明顯低于分離自第二寄主的紅棕象甲菌株R3,表明金龜子綠僵菌的毒力高低與是否是分離自第一寄主并無直接聯(lián)系。同時,試驗發(fā)現(xiàn)分離自紅棕象甲僵蟲的菌株對椰子織蛾也有較高的毒力,基于棕櫚作物害蟲椰子織蛾、紅棕象甲有混合發(fā)生的實際情況[15],今后有必要開展以上菌株對紅棕象甲的致病性測定工作,以拓寬菌株的防治范圍。

采用本試驗篩選的金龜子綠僵菌菌株LS-Y1 1×108個/mL 孢子濃度處理椰子織蛾，4 d后累計死亡率接近66.67%,說明該菌株對椰子織蛾具有相對較高的毒力,但由于田間氣候條件復雜,尚需研究適合于田間應(yīng)用的金龜子綠僵菌菌劑、施用方法等,今后將就該菌株對椰子織蛾不同蟲態(tài)的毒力、不同劑型與環(huán)境的兼容性、與其他生防產(chǎn)品的協(xié)調(diào)防控等方面開展進一步的研究。

本試驗發(fā)現(xiàn)了一株對椰子織蛾幼蟲有較高毒力的綠僵菌菌株LS-Y1,這是首次報道金龜子綠僵菌對棕櫚科作物重要害蟲椰子織蛾幼蟲有生物活性,表明其具有較大的生防潛力。但是尚未測定該菌株對椰子織蛾成蟲的生物活性,下一步將優(yōu)化試驗方案進一步驗證該菌株對椰子織蛾成蟲的生物活性。

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(責任編輯:楊明麗)

Screening of highly toxic strains of Metarhizium anisopliae againstOpisinaarenosellaWalker

Sun Xiaodong1,2, Li Fuheng2, Yan Wei1, Li Chaoxu1, Lü Chaojun1, Qin Weiquan1

(1. Coconut Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Wenchang 571339, China;2. College of Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

OpisinaarenosellaWalker is an important insect pest on palm plants in the tropical area of China. In order to find efficient biocontrol agent againstO.arenosella, fourMetarhiziumanisopliaestrains with good cultural characters were obtained from dead overwinteringO.arenosellalarvae collected from Lingshui, Hainan Province. The strains were identified by molecular method and their toxicities against the 3rd instar ofO.arenosellawere investigated in laboratory. Strain LS-Y1 demonstrated high toxicity againstO.arenosella. NCBI BLAST with the rDNA-ITS fragments from the four tested strains revealed that the nucleotide sequences of these genes have the similarity of 99%, 100%, 99% and 99% with the sequences of JN377427.1, NR132017.1, FJ545278.1, FJ545294.1, respectively. LC50value of LS-Y1 on the 3rd instar larvae ofO.arenosellawas 4.41×106conidia/mL 6 days after treatment. The LT50values of LS-Y1 on the 3rd instar larvae ofO.arenosellaat the spores concentrations of 6.25×106, 1.25×107, 2.5×107, 5×107and 1×108conidia/mL were 5.77 d, 4.88 d, 4.43 d, 3.82 d and 3.36 d, respectively. These results showed that the strain LS-Y1 was highly toxic againstO.arenosellalarvae, which was the promising candidate in the biological control ofO.arenosella.

Metarhiziumanisopliae;Opisinaarenosella; molecular identification; toxicity

2015-12-03

2016-02-18

海南省重大科技項目(ZDZX2013008)；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項資金

S 436.67

B

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.06.039

* 通信作者 E-mail: qwq268@163.com