由書妍, 劉紅霞, 于瑞君, 鄭麗君, 范詩言, 李紅葉

(1.大連市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院, 大連 116036; 2. 浙江大學(xué)生物技術(shù)研究所, 杭州 310058)

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柑橘綠霉病菌木聚糖酶基因(PdXY2)功能初步研究

由書妍1, 劉紅霞1, 于瑞君1, 鄭麗君1, 范詩言1, 李紅葉2*

(1.大連市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院, 大連 116036; 2. 浙江大學(xué)生物技術(shù)研究所, 杭州 310058)

柑橘綠霉病菌(Penicilliumdigitatum)是引起柑橘儲藏期腐爛最主要的病原之一,嚴(yán)重影響了柑橘產(chǎn)業(yè)發(fā)展。本試驗克隆了柑橘綠霉病菌的木聚糖酶基因(PdXY2),對其表達(dá)進(jìn)行研究,在柑橘發(fā)病過程中,PdXY2的表達(dá)顯著升高,至48 h達(dá)到最高,其表達(dá)量為對照的4倍。為進(jìn)一步明確PdXY2基因功能,構(gòu)建了PdXY2基因缺失突變株(ΔPdXY2),ΔPdXY2突變株的致病性與野生型相比沒有明顯差異。由此我們推斷,在柑橘綠霉病菌侵染柑橘的過程中PdXY2有一定的作用,但是單一缺失木聚糖酶PdXY2基因不能影響其致病性。

柑橘綠霉病菌; 木聚糖酶; 基因表達(dá); 基因突變

植物病原菌侵入寄主時必須先破壞寄主的細(xì)胞壁,這個過程主要有兩方面作用:一方面破壞寄主的天然屏障,使病原物能侵入寄主,建立侵染關(guān)系;另一方面降解的產(chǎn)物能夠為病原物提供營養(yǎng)物質(zhì)。在細(xì)胞壁的降解過程中,細(xì)胞壁水解酶起到了重要的作用[1-2]。已有研究表明細(xì)胞壁水解酶對致病性至關(guān)重要,如在黃曲霉(Aspergillusflavus)中,內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶突變株對棉鈴的致病性降低[3];在灰葡萄孢(Botrytiscinerea)中,內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶突變株對番茄的致病性降低[4],果膠甲酯酶突變株對多種作物的致病性均有所下降[5];在稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)中,角質(zhì)酶突變株對水稻和大麥的致病性下降[6];在膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)中,果膠裂解酶突變株對牛油果的致病性下降[7-8];紫麥角菌(Clavicepspurpurea)中,多聚半乳糖醛酸酶基因突變株對黑麥的致病性下降[9]。因此,研究細(xì)胞壁水解酶對探索病原菌的致病性有重要意義。

柑橘是我國最主要的水果之一,而儲藏期柑橘腐爛病對柑橘的經(jīng)濟(jì)效益造成了嚴(yán)重的影響,通常造成的損失達(dá)到20%～30%,而其中90%以上是由柑橘綠霉病菌(P.digitatum)引起的[10-11]。在柑橘綠霉病菌中,內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶對致病性有非常重要的作用[12]。為明確柑橘綠霉病菌中其他水解酶的作用,本試驗克隆柑橘綠霉病菌的木聚糖酶基因,并對其表達(dá)及功能進(jìn)行分析,以闡明其在柑橘綠霉病菌致病過程中的作用,增加對柑橘綠霉病菌致病機(jī)制的了解。

1 材料與方法

1.1 材料

柑橘綠霉病菌野生型菌株P(guān)d01(CBS 130525)分離于浙江[13],保存于本實驗室;根癌農(nóng)桿菌AGL-1、大腸桿菌DH5α保存于本實驗室;質(zhì)粒pTFCM含有T-DNA插入臂序列,其潮霉素基因由構(gòu)巢曲霉強(qiáng)啟動子PtrpC啟動,由強(qiáng)終止子TtrpC終止,保存于本實驗室;Real-time RT-PCR采用7300 real-time PCR系統(tǒng);本試驗使用到的引物見表1,由上海桑尼公司合成。

表1 試驗中使用的引物

1.2 方法

1.2.1 柑橘綠霉病菌木聚糖酶PdXY2基因克隆

根據(jù)基因組信息設(shè)計擴(kuò)增木聚糖酶基因的引物PdXY2-F和PdXY2-R(表1),以柑橘綠霉病菌野生型Pd01基因組DNA為模板擴(kuò)增PdXY2基因的片段,PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后,利用AxyPrepTMDNA Gel Extration Kit (Axygen,杭州)回收目的條帶,將目的片段連接到克隆載體pMD18-T(TaKaRa,大連)上并送到Invitrogen公司進(jìn)行測序。

1.2.2 柑橘綠霉病菌PdXY2在侵染過程中的表達(dá)分析

從市場上購買成熟溫州蜜柑(Citrusnobilis),經(jīng)0.1%次氯酸浸泡5～10 min后吹干待用;用無菌水洗脫P(yáng)DA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d的野生型菌株P(guān)d01孢子,并將孢子稀釋到1.0×106個/mL,取3 μL孢子懸浮液接種于柑橘果實的傷口上(用針簇在果皮上刺1～2 mm深的傷口),25℃保濕培養(yǎng),分別在接種后間隔12 h提取發(fā)病組織的總RNA(Xygen),并反轉(zhuǎn)錄成cDNA(TaKaRa),使用SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒(TaKaRa)進(jìn)行real-time RT-PCR,用PdXY2-qF與PdXY2-qR引物擴(kuò)增木聚糖酶基因,以γ-Actin基因(GenBank登錄號:AB030227)作為內(nèi)參,Actin-qF和Actin-qR引物擴(kuò)增內(nèi)參基因,相對表達(dá)量的計算方法參考文獻(xiàn)[14]。

1.2.3 柑橘綠霉病菌PdXY2突變體構(gòu)建

采用同源重組原理構(gòu)建PdXY2基因敲除質(zhì)粒,基本過程如圖1:以柑橘綠霉病菌野生型菌株P(guān)d01的基因組DNA為模板,用引物PdXY2D(含XhoI酶切位點)和PdXY2C(含SpeI酶切位點)擴(kuò)增PdXY2基因3′端側(cè)翼0.75 kb的序列,產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶XhoI和SpeI消化后連接到質(zhì)粒pTFCM的hph的3′端;用引物PdXY2B(含SacI酶切位點)和PdXY2A(含KpnI酶切位點)擴(kuò)增PdXY2基因5′端側(cè)翼0.82 kb的序列,產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶SacI和KpnI消化回收后連接到質(zhì)粒pTFCM中hph基因的5′端。PCR鑒定選擇成功連接的單菌體,堿法小量抽提質(zhì)粒,得到新的質(zhì)粒pTFCM-XY2,將質(zhì)粒電擊到農(nóng)桿菌AGL-1中。

圖1 PdXY2功能缺失突變株的構(gòu)建Fig.1 Construction of PdXY2 knock-out mutant

1.2.4 柑橘綠霉病菌轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子的分析

農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的方法參考文獻(xiàn)[15]。挑取含有潮霉素抗性的單菌落轉(zhuǎn)入含有潮霉素的PDB培養(yǎng)基中,28℃培養(yǎng)5 d后取部分菌絲提取基因組DNA,用引物PdXY2jd-F和PdXY2jd-R進(jìn)行PCR鑒定。利用Southern雜交分析PdXY2基因缺失突變株中外源插入潮霉素抗性基因的拷貝數(shù),其步驟是用限制性內(nèi)切酶HindⅢ消化野生型Pd01和ΔPdXY2的基因組DNA 10 μg,在37℃的水浴條件下酶切24 h,將經(jīng)過酶切處理后的基因組DNA在1%瓊脂糖凝膠中電泳12 h(電壓20 V),將電泳后的基因組DNA經(jīng)毛細(xì)管法轉(zhuǎn)移到尼龍膜(Millipore)上,再以地高辛標(biāo)記的潮霉素基因片段為探針,用DIG High Primer DNA Labeling and Detection Starter Kit II(Roche)試劑盒進(jìn)行雜交,具體的操作方法詳見使用說明書。

1.2.5 ΔPdXY2突變株菌絲生長及產(chǎn)孢能力

野生型Pd01和ΔPdXY2的菌碟制作方法見文獻(xiàn)[16],將菌碟放在PDA中培養(yǎng)7 d后測量菌落直徑,并用無菌水或者5%吐溫洗脫孢子,將孢子稀釋后用血球計數(shù)板計數(shù)孢子量,每次試驗3個重復(fù),整個試驗重復(fù)3次。

1.2.6 ΔPdXY2突變株致病性分析

柑橘準(zhǔn)備方法同上,在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)野生型菌株P(guān)d01和ΔPdXY2突變株7 d,再用無菌水洗脫孢子并稀釋到1.0×106個/mL,接種方法同上,25℃保濕培養(yǎng),觀察發(fā)病情況,每個菌株接種約20～30個果實,整個試驗重復(fù)3次以上。

2 結(jié)果與分析

2.1PdXY2基因的克隆

利用引物PdXY2-F和PdXY2-R擴(kuò)增柑橘綠霉病菌的基因組,得到一條2 611 bp的核苷酸序列,將該序列在NCBI官方網(wǎng)站上進(jìn)行比對,發(fā)現(xiàn)與其他物種的木聚糖酶基因具有較高的一致性;根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)測序該基因cDNA全長651 bp,含有1個大小為58 bp的內(nèi)含子,能夠編碼出含有216個氨基酸的多肽,在NCBI中登錄PdXY2基因序列,登錄號為JX495171。

2.2 PdXY2蛋白分析

將柑橘綠霉病菌PdXY2編碼的蛋白在NCBI進(jìn)行BLAST,結(jié)果表明該蛋白與其他絲狀真菌中水解酶/內(nèi)切木聚糖酶有較高的一致性(圖2),與Ophiostomapiliferum中內(nèi)切木聚糖酶(AFR33048)的一致性為91%,與Penicilliumcamemberti中糖苷水解酶(CRL24571)的一致性為90%,與Penicilliumcanescens內(nèi)切木聚糖酶(ACP27610)的一致性為81%。

圖2 PdXY2蛋白與其他同源蛋白比較Fig.2 Comparison of PdXY2 with other homologous proteins

2.3PdXY2重組轉(zhuǎn)化子的分析

將獲得的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR鑒定,結(jié)果(圖3a)表明,在野生型Pd01中擴(kuò)增出了一條1.4 kb的條帶,而在重組突變株中擴(kuò)增出一條2.4 kb的條帶(2 kb潮霉素抗性基因取代了PdXY2基因及其啟動子區(qū)1 kb片段)。取其中一個轉(zhuǎn)化子(ΔPdXY2A)進(jìn)行Southern雜交鑒定,結(jié)果如圖3b所示,在野生型中潮霉素標(biāo)記的探針沒有雜交出條帶,而在ΔPdXY2突變株中則會出現(xiàn)一條約4.5 kb的條帶,結(jié)果表明獲得的重組突變株只有一條潮霉素基因序列,不存在異位插入,可以進(jìn)行后續(xù)研究。

圖3 ΔPdXY2突變株的PCR鑒定結(jié)果(a)和Southern鑒定結(jié)果(b)Fig.3 Identification of PdXY2-disrupted mutant by PCR (a)and Southern blot (b)

2.4PdXY2基因的表達(dá)分析

在接種柑橘的發(fā)病過程中,PdXY2基因的表達(dá)情況如圖4所示,侵染初期,PdXY2基因的相對表達(dá)量呈現(xiàn)出一個升高趨勢,在接種后48 h達(dá)到高峰,此時的相對表達(dá)量為對照的4倍,隨后其表達(dá)量逐漸下降,至84 h與對照差異不大,可見在侵染過程中,PdXY2基因表現(xiàn)出了先升高后下降的趨勢。

圖4 在侵染柑橘過程中PdXY2的表達(dá)Fig.4 Expression of PdXY2 during infection

2.5 ΔPdXY2突變株生長及產(chǎn)孢分析

菌絲生長試驗結(jié)果表明,ΔPdXY2突變株與野生型菌株生長速度相似,生長速率均為1.0～1.2 cm/d。產(chǎn)孢試驗結(jié)果顯示,ΔPdXY2突變株與野生型菌株的產(chǎn)孢量相似,在PDA平板上培養(yǎng)7 d后其孢子量均可達(dá)到1×108,因此,ΔPdXY2突變株與野生型菌株在菌落生長和產(chǎn)孢方面沒有明顯差異。

2.6 ΔPdXY2突變株致病性分析

致病性試驗結(jié)果(圖5)顯示,ΔPdXY2突變株能夠侵染柑橘果實,接種后培養(yǎng)24 h,ΔPdXY2和野生型Pd01均出現(xiàn)了腐爛,且病斑擴(kuò)展速度差異不大,由此可見,ΔPdXY2突變株對柑橘綠霉病菌的致病性與野生型相比沒有明顯差異。

圖5 野生型(WT)與ΔPdXY2突變株接種84 h后發(fā)病情況Fig.5 Virulence of the wild type (WT) and ΔPdXY2 mutant after 84 h of incubation

3 討論

柑橘綠霉病菌是造成柑橘采后腐爛的最主要病原,對柑橘產(chǎn)業(yè)造成了嚴(yán)重的損失,為了增加對柑橘綠霉病菌致病分子機(jī)制的了解,本研究對柑橘綠霉病菌中的木聚糖酶基因(PdXY2)進(jìn)行研究,表達(dá)分析表明PdXY2在侵染柑橘的過程中明顯升高,可能起到一定的作用。ΔPdXY2突變株的致病性與野生型相比沒有明顯的差異,可見單一突變PdXY2基因?qū)Ω涕倬G霉病菌的致病性影響不大,可能與其他同源基因相關(guān)。細(xì)胞壁水解酶含有很多同源基因,很多單一水解酶功能缺失不會引起致病性的下降[17-18]。如在赤球叢赤殼(Nectriahaematococca)中,雙突變果膠裂解酶A基因和果膠裂解酶D基因能夠降低致病性,然而單一突變其中任何一個基因都對致病性沒有影響[19];內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶對柑橘鏈格孢(Alternariacitri)引起的柑橘黑腐病致病性有影響,但是對鏈格孢(A.alternata)引起的褐斑病沒有影響[20];在稻瘟病菌(M.oryzae)中,突變內(nèi)切木聚糖酶對致病性沒有影響[21];在尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)中,突變外切多聚半乳糖醛酸酶對致病性沒有影響[22];在玉米圓斑病菌(Cochlioboluscarbonum)中,雙突變胞外多聚半乳糖醛酸酶可導(dǎo)致酶活下降,但是致病性與野生型差異不大[23]。此外還有一些報道也同樣表明單一的突變對致病性沒有影響[24-26]。

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(責(zé)任編輯:田 喆)

Preliminary study on the function of PdXY2 in Penicillium digitatum

You Shuyan1, Liu Hongxia1, Yu Ruijun1, Zheng Lijun1, Fan Shiyan1, Li Hongye2

(1. Dalian Academy of Agricultural Sciences, Dalian 116036, China;2. Institute of Biotechnology, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China)

Penicilliumdigitatumis one of the most important pathogen causing green mold disease which impedes the development of citrus industry. In this study, we cloned a xylanase genePdXY2 and characterized its functions via knock-out strategy. The expression ofPdXY2 was up-regulated during the primary stage of infection, and reached a peak at 48 h. However,PdXY2-disrupted mutant (ΔPdXY2) showed no reduction in virulence. Taken together, our results demonstrated thatPdXY2 may play an important role in infection and single knock-out ofPdXY2 showed no reduction in virulence.

Penicilliumdigitatum; Xylanase; gene expression; gene disruption

2015-12-24

2016-02-24

國家自然科學(xué)基金(31371961); 國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-27)

S 436.66

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.06.016

* 通信作者 E-mail:hyli@zju.edu.cn