付 麗, 曲健祿, 武海斌, 翟 浩, 李曉軍, 范 昆

(山東省果樹研究所, 泰安 271000)

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蘋果輪紋病菌抗戊唑醇突變體UV-TS1-10的生理生化特性

付 麗, 曲健祿, 武海斌, 翟 浩, 李曉軍, 范 昆*

(山東省果樹研究所, 泰安 271000)

利用蘋果輪紋病菌敏感菌株TS1和抗戊唑醇突變體UV-TS1-10進(jìn)行了苯丙氨酸解氨酶(PAL)、過氧化物酶(POD)活力、可溶性蛋白含量及酯酶同工酶圖譜等生理生化特性的測(cè)定。經(jīng)不同濃度藥劑處理0～24 h,抗性突變體UV-TS1-10體內(nèi)PAL活性一直高于敏感菌株TS1,兩者都呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),并在1.5 h達(dá)到最高值;抗藥突變體UV-TS1-10體內(nèi)POD活力也高于TS1,一直處于上升趨勢(shì),24 h達(dá)到最高值時(shí)兩菌株活力差異最大;UV-TS1-10體內(nèi)可溶性蛋白含量為TS1的1.3倍,同一菌株在不同濃度戊唑醇處理后可溶性蛋白含量差異不大,穩(wěn)定性好;抗藥突變體UV-TS1-10比敏感菌株TS1的酯酶同工酶圖譜少了一條Rf=0.33的譜帶,多了Rf=0.14的特征性譜帶,表明抗戊唑醇突變體UV-TS1-10其生理生化特性發(fā)生了較大變化。本文以研究敏、抗菌株間生理生化特性的差異為基礎(chǔ),探討蘋果輪紋病菌對(duì)戊唑醇可能的抗性機(jī)制,為科學(xué)地指導(dǎo)生產(chǎn)用藥提供理論依據(jù)。

蘋果輪紋病菌; 戊唑醇; 抗性突變體; 生理生化特性

蘋果輪紋病(apple ring rot)是由葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)引起的一種世界性真菌病害,能夠侵染生長(zhǎng)期的果實(shí)、枝干,采后貯藏期也發(fā)生嚴(yán)重,是蘋果生產(chǎn)中一種重要病害[1]。該病原寄主范圍廣泛,能夠侵染蘋果[2]、梨[3]、開心果[4]、山核桃[5]、桉樹[6]、藍(lán)莓[7]等多種經(jīng)濟(jì)作物,帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。針對(duì)該病原菌,生產(chǎn)上多以化學(xué)藥劑進(jìn)行防治,如多菌靈、代森錳鋅和戊唑醇等,其中以戊唑醇的防治效果最好[8]。戊唑醇是三唑類殺菌劑,通過雜環(huán)上的氮原子與甾醇14α-去甲基化酶P450結(jié)合,抑制酶的活性,最終起到殺菌作用。由于其獨(dú)特的作用機(jī)制已廣泛應(yīng)用于水稻、小麥、玉米、葡萄[9-12]等多種農(nóng)作物病害的防治。但是目前,已有報(bào)道發(fā)現(xiàn)小麥葉枯病菌(Mycosphaerellagraminicola)[13]、草坪幣斑病菌(Sclerotiniahomoeocarpa)[14]、甜菜褐斑病菌(Cercosporabeticola)[15]、花生褐斑病菌(C.arachidicola)[16]、桃褐腐病菌(Moniliniafructicola)[17]等多種病原菌對(duì)戊唑醇出現(xiàn)了抗藥性。田間病原菌抗藥性的發(fā)展可能會(huì)帶來農(nóng)藥使用量的增加和農(nóng)藥殘留的超標(biāo),因此對(duì)于抗藥性的研究迫在眉睫。

在病原菌抗藥性產(chǎn)生的同時(shí),生理生化特性也會(huì)隨之變化,在前期的研究中,范昆等[18]發(fā)現(xiàn)蘋果輪紋病菌抗戊唑醇突變體和敏感菌株在菌絲生長(zhǎng)速率等生物學(xué)特性方面存在差異。目前尚未見關(guān)于蘋果輪紋病菌抗戊唑醇突變體生理生化特性的系統(tǒng)報(bào)道,而該特性對(duì)探明菌株的抗藥性機(jī)理及進(jìn)行抗性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估具有重要意義。本研究繼續(xù)以蘋果輪紋病菌敏感菌株TS1和抗戊唑醇突變體UV-TS1-10為試材,研究比較突變體在苯丙氨酸解氨酶(PAL)、過氧化物酶(POD)、可溶性蛋白含量及酯酶同工酶等方面的生理生化特性差異,分析敏感菌株與抗性菌株對(duì)戊唑醇的適應(yīng)性差異,為其更進(jìn)一步的研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

菌株:蘋果輪紋病菌敏感菌株TS1和抗性菌株UV-TS1-10,均由山東省果樹研究所植保室分離保存。敏感菌株TS1采自山東省泰山南天門未施用過戊唑醇的蘋果樹上;抗性菌株UV-TS1-10為通過敏感菌株TS1紫外誘導(dǎo)的抗戊唑醇突變體,抗性倍數(shù)達(dá)67.88[18]。

藥劑及試劑:98%戊唑醇(tebuconazole)原藥(江蘇常隆化工有限公司),用丙酮溶解并配成1×104μg/mL的母液,置4℃冰箱中備用。聚乙烯吡咯烷酮(PVP,進(jìn)口分裝)、L-苯丙氨酸(Solarbio,P0010)、乙酸-1-萘酯(Solarbio)、乙酸-2-萘酯(阿拉丁)、愈創(chuàng)木酚及其余試劑均為分析純,4×protein native PAGE loading buffer(TaKaRa,9175)。

主要儀器:Ultrospec 2100 pro紫外分光光度計(jì)(Amersham Biosciences);5810R高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf)、DYY-6D型電泳儀(北京市六一儀器廠);GXZ智能型光照培養(yǎng)箱(寧波江南儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 菌絲制備

將供試菌株TS1和UV-TS1-10在PDA培養(yǎng)基上于28℃黑暗培養(yǎng)3 d,于菌落邊緣打取直徑7 mm的菌餅,分別接入PDA平板,28℃黑暗條件培養(yǎng)5 d。刮取新鮮菌絲,經(jīng)重蒸水沖洗,真空抽濾后各稱取鮮菌絲2.0 g,分別放入含有質(zhì)量濃度為1.0、5.0、25.0 μg/mL的戊唑醇藥液的三角瓶中,于28℃恒溫、120 r/min下分別振蕩培養(yǎng)0、1.5、6和24 h。將各處理菌絲用重蒸水沖洗5次,真空抽濾后-80℃?zhèn)溆谩Ｒ?.1 μg/mL丙酮溶劑稀釋液為對(duì)照,每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.2 苯丙氨酸解氨酶(PAL)活力測(cè)定

參照Southerton等[19]的方法,略有改進(jìn)。反應(yīng)體系為:pH 8.7硼酸緩沖液2.0 mL、酶液0.5 mL、0.02 mol/L的L-苯丙氨酸1 mL。對(duì)照用0.5 mL硼酸緩沖液代替酶液。40℃水浴,反應(yīng)60 min后用0.5 mL 6 mol/L的鹽酸終止反應(yīng)。用分光光度計(jì)在290 nm處測(cè)定吸光度(A)的變化。重復(fù)3次。

1.2.3 過氧化物酶(POD)活力測(cè)定

采用愈創(chuàng)木酚比色法[20],并略加改進(jìn)。反應(yīng)體系為: pH 5.8磷酸緩沖液2.0 mL,3%H2O21 mL,0.05 mol/L愈創(chuàng)木酚1 mL、酶液1.0 mL。37℃水浴,反應(yīng)15 min后迅速轉(zhuǎn)入冰浴中,對(duì)照以緩沖液代替酶液。用紫外分光光度計(jì)在470 nm處測(cè)定反應(yīng)3 min時(shí)的吸光度(A)。每隔30 s記錄1次,共記錄6次,以每1 min內(nèi)A470變化0.01為1個(gè)酶活力單位(μmol/min)。重復(fù)3次。

1.2.4 可溶性蛋白含量測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)G-250法[21]。

1.2.5 酯酶同工酶電泳

參照夏曉明[22]的方法,但略有改進(jìn)。配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為7.5%的分離膠和3%的濃縮膠。吸取16 μL酶液,與4 μL Buffer混勻后分別注入點(diǎn)樣孔,于4℃下進(jìn)行恒壓電泳(電壓240 V,電泳時(shí)間3 h左右)。每個(gè)樣品重復(fù)3次。酯酶同工酶采用乙酸萘酯法染色[22],略有改動(dòng)。凝膠染色后測(cè)定溴酚藍(lán)與各酶帶在分離膠中的遷移距離。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

酶活力測(cè)定結(jié)果采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析,所得數(shù)據(jù)利用Duncan氏新復(fù)極差檢驗(yàn)法分析差異顯著性(α=0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 TS1和UV-TS1-10菌株的PAL活力

TS1和UV-TS1-10菌株經(jīng)不同濃度戊唑醇處理以后,菌株體內(nèi)PAL活力變化如圖1所示。經(jīng)1、5、25 μg/mL不同濃度戊唑醇處理后,敏感性和抗性菌株體內(nèi)的PAL活力變化均表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢(shì)。不同戊唑醇濃度處理下,抗性菌株UV-TS1-10的PAL活力均高于敏感菌株TS1。相同戊唑醇濃度處理下,PAL活力呈現(xiàn)先升高再下降的趨勢(shì),TS1和UV-TS1-10菌株體內(nèi)PAL活力都在1.5 h處理時(shí)達(dá)到最高值。UV-TS1-10的PAL活力變化幅度相較于TS1要高。試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn),對(duì)照樣品中,0～24 h期間敏感性和抗性菌株體內(nèi)的PAL活力也表現(xiàn)為先上升后下降的狀態(tài),最高值均僅為起始值的1.3倍,表明在丙酮稀釋液狀態(tài)下,PAL活性也會(huì)發(fā)生變化,只是變化的趨勢(shì)較緩。

圖1 不同濃度戊唑醇處理后TS1和UV-TS1-10菌株體內(nèi)PAL活力Fig.1 Comparison of the PAL activities of TS1 and UV-TS1-10 treated with different concentrations of tebuconazole

2.2 TS1和UV-TS1-10菌株的POD活力

不同濃度戊唑醇處理不同時(shí)間后,TS1和UV-TS1-10體內(nèi)過氧化物酶(POD)的活力變化見圖2。隨著戊唑醇處理濃度的升高，UV-TS1-10和TS1體內(nèi)的POD活力隨著處理時(shí)間的增加不斷升高,處理1.5 h和6 h之間上升趨勢(shì)均較緩,24 h的POD活性急劇增加。UV-TS1-10和TS1體內(nèi)的POD活性在戊唑醇濃度為25 μg/mL時(shí)達(dá)到最大值；由于0 h POD活力初始值較低,TS1菌株的POD活力0～24 h增長(zhǎng)倍數(shù)比UV-TS1-10菌株高;UV-TS1-10和TS1在各濃度藥劑處理下的POD活力均明顯高于無藥處理;在相同處理?xiàng)l件下,UV-TS1-10體內(nèi)POD活力明顯高于TS1。

2.3 TS1和UV-TS1-10菌株體內(nèi)可溶性蛋白含量比較

不同濃度戊唑醇處理不同時(shí)間后,TS1和UV-TS1-10體內(nèi)可溶性蛋白含量變化見圖3。處理和對(duì)照的TS1和UV-TS1-10體內(nèi)的可溶性蛋白含量均出現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì),處理6 h時(shí)達(dá)到最低值,為起始值的1/7;在處理24 h時(shí)TS1和UV-TS1-10體內(nèi)可溶性蛋白含量又稍有升高,但不及起始值的1/2。不同濃度戊唑醇處理的TS1和UV-TS1-10體內(nèi)可溶性蛋白含量變化不大,但UV-TS1-10的體內(nèi)可溶性蛋白含量在處理0/1.5 h時(shí)高于TS1,處理6 h和24 h時(shí)低于TS1,變化明顯。

圖2 不同濃度戊唑醇處理后TS1和UV-TS1-10菌株體內(nèi)POD活力Fig.2 Comparison of the POD activities of TS1 and UV-TS1-10 treated with different concentrations of tebuconazole

圖3 不同濃度戊唑醇處理后TS1和UV-TS1-10菌株體內(nèi)可溶性蛋白含量Fig.3 Comparison of soluble proteins of TS1 and UV-TS1-10 treated with different concentrations of tebuconazole

2.4 TS1和UV-TS1-10菌株酯酶同工酶電泳圖譜分析

TS1和UV-TS1-10菌株酯酶同工酶電泳圖譜見圖4。TS1和UV-TS1-10菌株酯酶同工酶電泳圖譜存在特異性差異,TS1(圖4中1～4)有兩條酶帶標(biāo)記為a、b,其Rf分別為0.33、0.43,酶帶a顏色較深,酶帶b顏色較淺;UV-TS1-10(圖4中5～8)有2條酶帶標(biāo)記為b、c,其Rf為0.43和0.14,酶帶b與TS1的酶帶b相似,酶帶c顏色較酶帶a深,為UV-TS1-10的特征性譜帶。

圖4 敏感菌株TS1和抗性菌株UV-TS1-10酯酶同工酶電泳圖譜Fig.4 Electrophoretic patterns of esterases of tebuconazole-resistant and-susceptible isolates of Botryosphaeria dothidea

3 討論

蘋果輪紋病的化學(xué)防治一直以來是蘋果生產(chǎn)中的重要方面,面對(duì)輪紋病抗藥性的不斷發(fā)展,我們對(duì)采集的菌株進(jìn)行了室內(nèi)篩選并誘導(dǎo)出穩(wěn)定的抗性菌株。2012年我們對(duì)敏感菌株TS1和抗性菌株UV-TS1-10進(jìn)行了生物學(xué)特性的研究[18],發(fā)現(xiàn)TS1和UV-TS1-10在致病力、適宜生長(zhǎng)溫度、適宜pH等方面差異不明顯,但是菌絲生長(zhǎng)速度及菌絲干重差異較大,所以本文以敏感菌株和突變菌株為材料,研究?jī)烧咧g生理生化特性的差異,以明確蘋果輪紋病菌對(duì)戊唑醇可能的抗性機(jī)制,為科學(xué)指導(dǎo)生產(chǎn)用藥提供理論依據(jù)。

當(dāng)生物體遭遇逆境時(shí),生物體內(nèi)的苯丙氨酸解氨酶(PAL)、過氧化物酶(POD)、可溶性蛋白和酯酶同工酶等會(huì)相應(yīng)地發(fā)生變化。一般認(rèn)為,PAL活力與植物的抗逆性息息相關(guān),當(dāng)植物遇到逆境時(shí)苯丙烷類代謝被激活,PAL活性迅速上升,并表現(xiàn)出規(guī)律性的變化,其下游途徑中的某些酶類的活性也升高[23]。對(duì)于絲狀真菌的研究也有相似的結(jié)果:陳彥等[24]發(fā)現(xiàn),葡萄白腐病菌的抗多菌靈菌株中的PAL活力始終高于敏感菌株,認(rèn)為逆境條件可誘導(dǎo)病原菌體內(nèi)的PAL活力升高。隨后姜莉莉等[25]對(duì)草莓枯萎病的研究發(fā)現(xiàn),抗多菌靈的菌株P(guān)AL活力也要高于敏感菌株。本研究中,蘋果輪紋病菌敏感菌株TS1和抗性突變菌株UV-TS1-10體內(nèi)的PAL活力隨著藥劑處理濃度的升高而升高,且抗性菌株的PAL活力均高于敏感菌株,與前人的研究相似;同時(shí)也表明了PAL這種胞內(nèi)誘導(dǎo)酶,隨著激發(fā)因子濃度增大,PAL基因的轉(zhuǎn)錄活性越高,PAL活力也更大[23]。對(duì)于本研究中,PAL活力在0～1.5 h表現(xiàn)為上升,1.5～24 h呈現(xiàn)下降的趨勢(shì),也與其他PAL活力研究結(jié)果相似:Song等[26]發(fā)現(xiàn)被叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi)侵染的番茄植株,其PAL活力在侵染后18～48 h表現(xiàn)出上升,48 h以后下降,總體表現(xiàn)為先上升后下降;張曉曉等[27]使用UV-C照射蘋果果實(shí),其抗蘋果灰霉病的能力提高的同時(shí)PAL活力也呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。究其原因可能與PAL是連接生物初級(jí)代謝和苯丙烷類代謝、催化苯丙烷類代謝第一步反應(yīng)的酶,所以在受到激發(fā)時(shí)PAL會(huì)首先作出反應(yīng),開啟苯丙烷類代謝,隨著時(shí)間的延長(zhǎng)生物體逐漸適應(yīng),所以PAL活力下降。以上結(jié)果證明PAL活力與蘋果輪紋病菌對(duì)戊唑醇的抗性相關(guān),但機(jī)理還需進(jìn)一步深入研究。

過氧化物酶(POD)是由微生物或植物產(chǎn)生的一類氧化還原酶,是以過氧化氫為電子受體催化底物氧化的酶,可催化過氧化氫氧化酚類和胺類化合物,具有消除過氧化氫和酚類、胺類毒性的雙重作用。本研究結(jié)果中,隨著戊唑醇對(duì)TS1和UV-TS1-10處理時(shí)間的延長(zhǎng),相同戊唑醇濃度下的POD活性呈現(xiàn)一直上升的趨勢(shì),且UV-TS1-10的POD活性比TS1的要高;相同處理時(shí)間下,戊唑醇濃度越高其POD活性越高,且抗性菌株P(guān)OD活力高于敏感菌株。該結(jié)果與禾谷絲核菌和草莓枯萎病的抗戊唑醇菌株生理生化研究結(jié)果一致[22,25]。表明菌體為了防止膜脂的過氧化,通過提高參與膜保護(hù)酶活性來減輕逆境對(duì)細(xì)胞的損傷,這種保護(hù)性的酶就包括過氧化物酶。POD活性越高,消除氧自由基的能力越強(qiáng),菌株抗逆性也越強(qiáng)。不斷有研究指出過氧化物酶體系與病原菌的致病性息息相關(guān)[27-29],而且POD在微生物體內(nèi)具有多種同工酶,POD同工酶的差異在一程度上反應(yīng)菌體個(gè)體之間基因的差異,因此把它用做鑒定的指標(biāo),具有很好的參考價(jià)值[30]。所以在菌體持續(xù)受到戊唑醇的作用時(shí),蘋果輪紋病菌的POD活力一直呈現(xiàn)上升的趨勢(shì),也表明POD活力與蘋果輪紋病菌株對(duì)戊唑醇的抗性有關(guān),具體的影響還有待試驗(yàn)。

可溶性蛋白是以小分子的狀態(tài)溶于水或其他溶劑的蛋白,其含量的增加是環(huán)境脅迫下菌絲滲透調(diào)節(jié)的重要手段。本研究中戊唑醇處理前期,蘋果輪紋病菌可溶性蛋白的含量比較高,后期降低的原因可能是在戊唑醇的脅迫下,相關(guān)基因表達(dá)增加了菌體內(nèi)的蛋白質(zhì)含量,這與植物在逆境中可溶性蛋白含量的變化一致。在脅迫條件下,植物體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生抗性蛋白,隨著脅迫強(qiáng)度和時(shí)間的增加,蛋白質(zhì)合成酶活性下降,分解酶活性上升,最終導(dǎo)致可溶性蛋白含量的降低[31-32]。圖3的結(jié)果也表明TS1和UV-TS1-10在不同濃度戊唑醇處理前后蛋白含量的變化不大,只是抗性菌株比敏感菌株的可溶性蛋白的含量高,也說明不同菌株可溶性蛋白的含量相對(duì)穩(wěn)定,是鑒別不同菌株的可靠方法。

酯酶同工酶是催化酯類化合物水解酶的酶系,可以水解大量非生理存在的酯類化合物,因此有解毒作用,與抗性相關(guān)[33]。酯酶同工酶電泳是進(jìn)行真菌分類、抗藥性菌株監(jiān)測(cè)及抗性機(jī)理研究的有效手段。前人研究發(fā)現(xiàn)[25],草莓枯萎病菌的抗戊唑醇突變體與敏感菌株的酯酶同工酶電泳圖譜中,Rf=0.24的主酶帶是抗性菌株中穩(wěn)定存在而敏感菌株所缺少的,認(rèn)為該酶帶與草莓枯萎病菌的抗藥性有關(guān)。夏曉明[22]在研究禾谷絲核菌時(shí)也有相似的結(jié)果。本研究在酯酶同工酶電泳圖譜中,UV-TS1-10比TS1少了Rf=0.33的酶帶,但是多了Rf=0.14的一條酶帶,且酶帶顏色最深,推測(cè)該酶帶與抗藥性可能存在相關(guān)性。與其他研究不同的是,本研究中酯酶同工酶電泳圖譜中酶帶數(shù)量很少,說明蘋果輪紋病菌中該酶的多樣性低,其主要原因還需進(jìn)一步研究。

總之,與敏感菌株TS1相比,抗戊唑醇菌株UV-TS1-10的生理生化特性發(fā)生了顯著變化,苯丙氨酸解氨酶、過氧化物酶、可溶性蛋白和酯酶同工酶等酶類的變化代表了蛋白質(zhì)水平的差異,這種差異又是由基因的變異引起的,所以蘋果輪紋病菌抗戊唑醇的抗性機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。室內(nèi)誘導(dǎo)的抗性菌株已經(jīng)出現(xiàn)抗藥性,生產(chǎn)中如果放任藥劑的過量使用,抗性菌株的出現(xiàn)只是時(shí)間問題,因此科學(xué)、合理的田間用藥是控制病原菌抗藥性產(chǎn)生的首要方式。

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(責(zé)任編輯:田 喆)

Physiological and biochemical characteristics of tebuconazole-resistant isolate ofBotryosphaeriadothideaUV-TS1-10

Fu Li, Qu Jianlu, Wu Haibin, Zhai Hao, Li Xiaojun, Fan Kun

(Shandong Institute of Pomology, Tai’an 271000, China)

A tebuconazole-resistant isolate ofBotryosphaeriadothidea, UV-TS1-10, was isolated by UV treatment of sensitive strain TS1, and its physiological and biochemical characteristics of phenylalanine ammonia lyase (PAL), peroxidase (POD), soluble protein contents and electrophoretic patterns of esterases were determined. The results showed that, when treated with different concentrations of tebuconazole for 0-24 h, the activity of PAL of UV-TS1-10 was higher than that of TS1 at all time．The value of PAL was increased firstly and peaked at 1.5 h, and then decreased. The values of POD in the two isolates were rising all the time, and reached the top at 24 h, and the difference between the two isolates reached the top at that time．The soluble protein content of UV-TS1-10 was 0.3 folds higher than that of TS1 and there was no difference for the same strain with different concentrations of tebuconazole. In the electrophoretic patterns of esterases, one characteristic band (Rf=0.33) was lost and a new one (Rf=0.14) was found in UV-TS1-10．As the result showed,the development of fungicide resistance was accompanied by the changes of the physiological and biochemical characteristics. The study of sensitive and resistant strains ofB.dothideahas great significance for formulating strategies of resistance management and monitoring resistance groups ofB.dothideain the field for the future.

Botryosphaeriadothidea; tebuconazole; resistant mutant; physiological and biochemical characteristics

2016-01-14

2016-03-07

山東省自然科學(xué)基金(ZR2013CQ040)；泰安市科技攻關(guān)項(xiàng)目(201540699)；山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年科研基金(2016YQN32)；山東省果樹研究所所長(zhǎng)基金

S 436.611.1

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.06.007

* 通信作者 E-mail：kunstage@163.com