劉華威, 羅來鑫, 朱春雨, 梁超瓊, 劉鵬飛, 李健強(qiáng)*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)系, 種子病害檢驗(yàn)與防控北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100193; 2. 種苗健康北京市工程研究中心, 農(nóng)業(yè)部植物病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100193; 3. 農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所, 北京 100026)

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黃瓜綠斑駁花葉病毒病防治研究進(jìn)展

劉華威1,2, 羅來鑫1,2, 朱春雨3, 梁超瓊1,2, 劉鵬飛1,2, 李健強(qiáng)1,2*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)系, 種子病害檢驗(yàn)與防控北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100193; 2. 種苗健康北京市工程研究中心, 農(nóng)業(yè)部植物病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100193; 3. 農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所, 北京 100026)

黃瓜綠斑駁花葉病毒(Cucumbergreenmottlemosaicvirus, CGMMV)主要危害葫蘆科作物,已被世界上許多國家和地區(qū)列為檢疫性有害生物。CGMMV目前在我國23個省、市、區(qū)已有報道發(fā)生和危害,嚴(yán)重影響葫蘆科作物的生產(chǎn);近年來該病害在國內(nèi)外呈現(xiàn)迅猛擴(kuò)展的趨勢并對生產(chǎn)造成危害。本文綜述了防治該病害的種子處理、化學(xué)及生物防治、嫁接以及轉(zhuǎn)基因等分子生物學(xué)方法;分析了CGMMV與寄主黃瓜互作研究的最新進(jìn)展,對小分子RNA參與調(diào)控寄主對CGMMV病毒的防控策略提出了展望,并概述了下一代測序技術(shù)、基因編輯技術(shù)在植物新病毒的檢測、鑒定以及培育抗病新品種等方面的應(yīng)用。

黃瓜綠斑駁花葉病毒; 防治方法; 研究進(jìn)展

中國是世界上最大的蔬菜生產(chǎn)國,其中2013年的黃瓜產(chǎn)量為5 431.59萬t,占世界總產(chǎn)量的76%[1]。黃瓜作為重要的蔬菜之一,提高其產(chǎn)量和生產(chǎn)效益一直受到世界各國研究人員的重視。近年來,隨著黃瓜栽培面積的增加和栽培品種的多樣化,黃瓜上病害種類也隨之增加,其中黃瓜綠斑駁花葉病毒(Cucumbergreenmottlemosaicvirus, CGMMV)由于傳播迅速且目前無法徹底根除,已逐漸成為嚴(yán)重危害葫蘆科作物生產(chǎn)的病毒病害之一。目前,物理方法、化學(xué)藥劑、生物防治、農(nóng)事操作以及生物學(xué)技術(shù)已被廣泛用于防治CGMMV,并取得了一定的防治效果。2014年,農(nóng)業(yè)部頒布了該病毒病的防控技術(shù)規(guī)程[2]。但由于CGMMV在種子等傳播材料中存在方式的隱秘性、持久性,以及其傳播途徑的多樣性,使得如何有效防治黃瓜綠斑駁病毒、探索合理而穩(wěn)定的防治措施來控制該病害成為各國農(nóng)業(yè)研究人員亟待解決的問題。

1 CGMMV病原生物學(xué)研究

CGMMV屬于煙草花葉病毒屬(Tobamovirus)成員,為正單鏈線狀RNA病毒,粒子大小約為18 nm×300 nm的螺旋狀結(jié)構(gòu),每3周含有49個亞基,螺距2.3 nm。位于核中心的RNA基因組長度6.4 kb左右[3],其編碼的17.3、29、129、186 kDa 4個蛋白,分別與CGMMV在寄主植株體內(nèi)的復(fù)制、移動相關(guān)[4]。另外,基因組5′和3′端分別含有帽子結(jié)構(gòu)和poly(A)尾巴及類似tRNA的結(jié)構(gòu)。5′端的帽子結(jié)構(gòu)可提高mRNA的穩(wěn)定性及增加翻譯效率,并保護(hù)RNA不受降解[5]。而3′端結(jié)構(gòu)可提供復(fù)制酶、核糖核酸結(jié)合蛋白識別和結(jié)合的位點(diǎn),與寄主細(xì)胞蛋白進(jìn)行競爭性結(jié)合[6]。研究表明,CGMMV的鈍化溫度在90～100℃之間,稀釋限點(diǎn)為10-6～10-7,病毒粒子在-20℃下仍可以存活[3]。

CGMMV自1935年首次被報道以來[7],目前在亞洲[8-18]、歐洲[19-29]、南美洲[30]、北美洲[31-32]和大洋洲[33]均有發(fā)生且造成不同程度的危害(表1),其中在中國境內(nèi)的23個省、市、自治區(qū)報道有發(fā)生且造成危害(表2)[10, 34-52]。CGMMV主要寄生于葫蘆科作物,如:黃瓜(Cucumissativus)、西瓜(Citrulluslanatus)、甜瓜(Cucumismelo)等,另外也可侵染莧色藜(Chenopodiumamaranticolour)、曼陀羅(Daturastramonium)、菟絲子(Cuscutachinensis)、本生煙(Nicotianabenthamiana)和珊西煙(Nicotianatabacum)等[3]。已有研究表明,CGMMV是典型的種傳病毒,主要寄生于種子的胚。根據(jù)對感病西瓜種子不同部位的檢測,其結(jié)果顯示子葉、外種皮以及內(nèi)種皮均被侵染,且其對應(yīng)部位帶毒量依次降低[53]。CGMMV侵染黃瓜后,病毒粒子可通過韌皮部對黃瓜植株體進(jìn)行系統(tǒng)性侵染[54]。因此,禁止感染CGMMV的帶毒種子在不同種植區(qū)運(yùn)輸是控制該病害長距離傳播的關(guān)鍵[55]。另外,農(nóng)事操作,如嫁接、汁液接觸、人工授粉、土壤帶毒、灌溉水以及菟絲子等也可造成CGMMV直接或間接地傳播[3, 56-57]。隨著檢測技術(shù)的發(fā)展,包括生物學(xué)、血清學(xué)和電鏡技術(shù)等已廣泛應(yīng)用于CGMMV檢測中,尤其是RT-PCR方法及其衍生技術(shù)包括熒光RT-PCR法、免疫捕獲RT-PCR和免疫磁珠RT-PCR方法均成熟應(yīng)用于CGMMV的檢測,并可成功檢測到黃瓜種子中含量為2 ng的CGMMV病毒粒子[58]。鑒于當(dāng)前的防治措施對處理存在于各種傳播材料中的CGMMV仍留有死角、并不足以徹底截止其傳播。因此在生產(chǎn)中除了將各種手段應(yīng)用于CGMMV的檢測、盡量降低其傳播的風(fēng)險外[59],研究具有實(shí)效的防治措施、杜絕CGMMV的發(fā)生與傳播,是病害管理的重中之重,亦可以間接減少種植者的投入并增加收益。

表1 黃瓜綠斑駁花葉病毒病在世界范圍內(nèi)的發(fā)生與危害

表2 黃瓜綠斑駁花葉病毒病在中國范圍內(nèi)的發(fā)生與危害

2 CGMMV侵染癥狀及危害

CGMMV侵染寄主后,造成植物組織內(nèi)的酚類物質(zhì)、碳水化合物濃度降低,葉綠體數(shù)量及葉綠素含量減少[60]。寄主葉部、果實(shí)表面通常會產(chǎn)生花葉、斑駁癥狀,隨著病情的發(fā)展進(jìn)一步形成濃綠色的褪綠斑或突起。嚴(yán)重時,造成植株矮化、開花延時,并最終導(dǎo)致作物減產(chǎn)至絕收。同時,西瓜被侵染后,感病植株的果實(shí)會形成瓤狀空洞、種子周圍的果肉呈纖維狀而失去食用價值[3]。

CGMMV的侵染對作物生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。1968年日本關(guān)東地區(qū)西瓜由于CGMMV的侵染危害,造成約9億日元的損失[8];1969年Fletcher報道英格蘭Lea Valley地區(qū)的黃瓜由于早期受到CGMMV侵染產(chǎn)量損失15%, 但后期侵染對產(chǎn)量影響不大[19];1978年印度德里地區(qū)甜瓜的受侵染率為70%～80%[9];1998年韓國被侵染作物達(dá)到463 hm2[11];2004年巴基斯坦部分地區(qū)葫蘆作物CGMMV發(fā)病率達(dá)46.9%[12]。2005年中國遼寧蓋州由于種子帶毒而導(dǎo)致大面積西瓜感染CGMMV,失去食用價值[10]。2011-2013年中國山東、江蘇、浙江均有報道CGMMV在西瓜上大面積發(fā)生[36-37, 39]。

3 CGMMV防治措施

根據(jù)以往研究報道,目前已有包括種子處理、化學(xué)防治、生物防治、嫁接以及分子育種技術(shù)等在內(nèi)的多種方法和手段被實(shí)際應(yīng)用于防治CGMMV。

3.1 種子處理

Kim報道,通過75℃處理72 h的方法,可以使種子中的CGMMV徹底失活, 而85℃處理24 h的種子仍存在45.8%的帶毒率[61]。隨后,他又通過電鏡觀察和RT-PCR的方法得知CGMMV基因組對溫度的敏感區(qū)域位于2～2.5 kb和4～4.8 kb,該區(qū)域易受溫度破壞而造成CGMMV失活[62]。然而,由于CGMMV寄藏部位的特殊性以及種殼的保護(hù),Reingold發(fā)現(xiàn)溫度(72℃處理72 h)處理、磷酸三鈉(10%)處理,或者同時采用兩種方法處理種子后,結(jié)合ELISA和PCR檢測,結(jié)果顯示種子仍可能帶有病毒,這些處理措施效率不高且不穩(wěn)定[63]。

3.2 化學(xué)防治

目前,實(shí)際生產(chǎn)中已開發(fā)出對多種作物病毒病有防治效果的化學(xué)制劑,其抗性機(jī)制主要是鈍化病毒外殼蛋白,影響病毒在寄主體內(nèi)的定殖或誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生抗病性,盡管已進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)、用于防治作物病毒病的藥物已有170個,但是卻仍未有針對CGMMV有防治效果的藥劑被開發(fā)出來(表 3)。其中,鹽酸嗎啉胍(moroxydine hydrochloride)作為最重要、最常用的化學(xué)成分之一,可以經(jīng)植物氣孔進(jìn)入植物體內(nèi)活細(xì)胞中,通過抑制或破壞核酸和外殼蛋白的形成,阻止病毒在植株體內(nèi)的復(fù)制,從而達(dá)到防治病毒病的目的[64]。鹽酸嗎啉胍除了單獨(dú)使用外(占防治作物病毒病害藥劑的10.28%),也可與乙酸銅復(fù)配使用,目前已成為防治作物病毒病害的主要藥劑(占防治作物病毒病害藥劑的40%)。另一種被廣泛應(yīng)用的藥劑是氨基寡糖素,它參與調(diào)節(jié)植物生長、發(fā)育的分子信號[65],并被證實(shí)有增強(qiáng)植物抗病能力的作用[66]。香菇多糖從藻類掌狀海帶(Laminariadigitata)中提取、純化得到,作為一個非特異性的激發(fā)子,通過預(yù)處理植物而引起寄主體內(nèi)PR蛋白積累、調(diào)節(jié)寄主免疫功能、刺激植物自身產(chǎn)生干擾素,從而使得寄主對病原微生物產(chǎn)生抗性[67-68]?；旌现舅峥赏ㄟ^誘導(dǎo)寄主體內(nèi)的抗病基因表達(dá)、提高病原相關(guān)蛋白、酶和細(xì)胞分裂素等含量,從而使得植物產(chǎn)生抗病能力[69]。

表3 我國目前應(yīng)用于蔬菜和作物病毒病害防治的登記藥劑目錄

3.3 生物防治

在CGMMV的生物防治策略中,Verma發(fā)現(xiàn)狹葉鉤粉草(Pseuderanthemumbicolor)葉子的提取物含有內(nèi)吸性的抗性誘導(dǎo)因子(systemic resistance inducer,SRIs),在溫室條件下,通過噴灑其提取物,可以提高黃瓜植株對CGMMV的抗病性[64]。隨后,Tewari采用13種蕨類植物提取物進(jìn)行防治CGMMV的試驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)Adiantumcaudatum,Dryopterisfilix-mas和Polypodiumparasiticum的提取物可有效抑制CGMMV在寄主體內(nèi)的復(fù)制[69]。最近,Ali利用弱毒株系CGMMV-SH33b預(yù)接種的方式開發(fā)出一種保護(hù)香瓜免受野生CGMMV進(jìn)一步侵染的防治方法[70-71]。另外,嫁接技術(shù)一直以來是葫蘆科作物在生產(chǎn)中普遍應(yīng)用的農(nóng)事操作技術(shù),也是防治病蟲害的有力措施之一[72-73]。然而,趙慧茹試驗(yàn)證明CGMMV可從西瓜砧木中運(yùn)輸?shù)狡浣铀胫?從而使得CGMMV通過嫁接傳播而潛在地成為田間的初侵染來源[49]。

3.4 抗病分子育種防治

由于CGMMV傳播途徑的多樣性,已采取的防治措施仍不足以徹底杜絕CGMMV的傳播,或者防治效率不高需要投入較多的防治費(fèi)用，因此,培育抗病性強(qiáng)、抗性穩(wěn)定的新品種是大勢所趨,而基于分子水平的抗病育種成為相對穩(wěn)定、長期、經(jīng)濟(jì)的有效策略。目前, 已嘗試在一些重要的經(jīng)濟(jì)作物上培育轉(zhuǎn)基因抗病性植株,盡管不同寄主的抗性信號以及病原侵染機(jī)制存在多樣性和復(fù)雜性,但基于內(nèi)源基因和外源基因介導(dǎo)培育抗性植株仍是常用的途徑之一[74]。Rajamony通過對大量不同香瓜品種的抗病性測定,成功地篩選到7個抗CGMMV的香瓜野生品種,并進(jìn)一步通過嫁接、雜交等手段將抗性基因轉(zhuǎn)移到其他葫蘆科栽培品種上,以此達(dá)到抗病、防病目的[75],而基于轉(zhuǎn)基因途徑防治CGMMV技術(shù)的應(yīng)用則進(jìn)一步拓展了對該病害的防治方法。1986年Abel試驗(yàn)驗(yàn)證了煙草花葉病毒(Tobaccomosaicvirus,TMV)外殼蛋白介導(dǎo)植株的抗性,結(jié)果表明由于外殼蛋白的介導(dǎo)作用,接種TMV的轉(zhuǎn)基因煙草植株發(fā)病時間延遲,且10%～60%接種植株上沒有產(chǎn)生癥狀[76]。隨后,Provvidenti發(fā)現(xiàn)由外殼蛋白介導(dǎo)產(chǎn)生的抗性在南瓜植株中也存在一定的廣譜性和遺傳性[77]。在已有的研究基礎(chǔ)上,De發(fā)表了由CGMMV復(fù)制酶基因介導(dǎo)產(chǎn)生抗性植株的專利方法[78];Park克隆了CGMMV外殼蛋白、并通過重組載體獲得了抗CGMMV的西瓜植株,并且在獲得的140株第一代轉(zhuǎn)基因植株中有10株具有抗性[79];2012年Ali克隆CGMMV移動蛋白后,通過基因重組和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法獲得抗CGMMV的甜瓜植株,進(jìn)一步由PCR和Southern blot的方法證明移動蛋白基因可穩(wěn)定遺傳至第三代植株體內(nèi)[80]。然而,植物病毒在自然條件下通常都是以復(fù)合侵染的形式存在[81],而基于外源基因產(chǎn)生的抗性植株往往存在抗病譜窄、僅抵抗同種病毒侵染等缺陷。因此,在田間條件下,隨著轉(zhuǎn)基因植株抗性壓力的不斷選擇和抗性的喪失,亟須培育多病毒基因片段介導(dǎo)的抗性植株[82-83]。2013年Lin通過農(nóng)桿菌介導(dǎo),將融合了西瓜銀斑病毒(Watermelonsilvermottlevirus,WSMoV)N基因和黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus,CMV)、西瓜花葉病毒(Watermelonmosaicvirus,WMV)和CGMMV的外殼蛋白基因的重組載體轉(zhuǎn)入西瓜栽培種‘Feeling’,并由Southern blot證明單個或多個基因拷貝被成功插入到西瓜基因組中,且在R0植株中存在對CGMMV的抗性[84]。Liu利用iTRAQ(isobaric tags for relative and absolute quantitation)技術(shù)在感染CGMMV的黃瓜植株體內(nèi)成功鑒定到38個差異表達(dá)蛋白, GO(Gene Ontology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)分析發(fā)現(xiàn)這些蛋白注釋有不同的功能,其中18個蛋白分別參與13個代謝通路中,這些代謝通路進(jìn)一步可融合形成3個相對獨(dú)立的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系調(diào)控圖,從而根據(jù)其相互調(diào)控關(guān)系,有目的地篩選合適的內(nèi)源病程相關(guān)基因來培育抗病植株防治CGMMV病害[85]。

4 防治策略展望

結(jié)合該病害的當(dāng)前防治現(xiàn)狀,作者對基于小分子RNA介導(dǎo)寄主抗病的途徑進(jìn)行了展望,并介紹了下一代測序技術(shù)、基因編輯技術(shù)在植物病毒病害防治措施中的應(yīng)用。

4.1 小RNA介導(dǎo)調(diào)控防治CGMMV

RNA沉默是真核生物通過核酸序列特異性的相互作用、在RNA水平抑制基因表達(dá)、抵抗外來核酸入侵的一種防御機(jī)制,這種機(jī)制被稱之為轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post transcriptional gene silencing, PTGS)[86]。

1928年Wingard記錄了感染煙草環(huán)斑病毒(Tobaccoringspotvirus)的煙草植株呈現(xiàn)壞死斑癥狀,而其上部新葉在第二次接種后對該病毒侵染呈免疫現(xiàn)象、且無壞死斑產(chǎn)生,從而開始最早的RNA沉默(RNA silencing)報道[87]。近年來,由siRNA(small interfering RNA)和miRNA(microRNA)介導(dǎo)調(diào)控的RNA干擾技術(shù)(RNA interference, RNAi)已經(jīng)成為改善作物生產(chǎn)的重要途徑?；趕iRNA的RNAi技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于作物增產(chǎn),增強(qiáng)對細(xì)菌、真菌、病毒、線蟲等有害微生物的抗性,以及改善作物的營養(yǎng)成分組成[88]。2007年,Kamachi發(fā)現(xiàn)獲得的7株轉(zhuǎn)CGMMV外殼蛋白擬南芥植株中的5株對CGMMV產(chǎn)生高抗,植株接種后無系統(tǒng)擴(kuò)展癥狀,RNA雜交表明轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)含有CP的特異干擾RNA,對CGMMV的復(fù)制具有較高的抑制率并對CGMMV的侵染有較強(qiáng)抗性,其抗性可穩(wěn)定遺傳至T2代[89]。但siRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因植株易受寄主、環(huán)境影響以及存在外源基因與寄主基因組易發(fā)生重組等潛在風(fēng)險。相對于siRNA的RNAi策略,由于miRNA具有更高的特異性和更可觀的預(yù)見性,以及其在調(diào)節(jié)植株生長、發(fā)育和應(yīng)答外界壓力時的優(yōu)異表現(xiàn)而日益受到重視[90]。尤其最近幾年,由于作物品種差異以及外界不同因子對寄主造成的壓力因素,大量的miRNA得到鑒定并挖掘出其調(diào)控的靶基因,為進(jìn)一步研究miRNA所調(diào)控的,遠(yuǎn)比自身數(shù)量更多的靶基因與生物物種或生物學(xué)多樣性之間的關(guān)聯(lián)性奠定基礎(chǔ)[91]。2011年,Martínez利用深度測序技術(shù)在感染啤酒花類病毒(Hopstuntviroid, HSVd)的黃瓜(Cucumissativus)植株內(nèi)獲得19個保守的miRNAs和7個新的特異性miRNAs,并通過Northern雜交進(jìn)一步得到驗(yàn)證,其所調(diào)控的靶基因分別參與寄主蛋白-蛋白/RNA互作、組織發(fā)育、調(diào)節(jié)次生代謝等生物過程[92]。Mao結(jié)合高通量測序和降解組測序的方法從黃瓜(C.sativus‘Jinchun No.2’)葉和根組織中鑒定出64個miRNA,發(fā)現(xiàn)部分miRNA只在特定組織中表達(dá)。其中, 21個首次在黃瓜中鑒定到的已知miRNA調(diào)控的靶基因分別參與黃瓜發(fā)育、抗氧化、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等功能[93]。Li通過黃瓜(Cucumissativus‘9930’)和南瓜(C.moschata‘Jinxin No.5’)之間的嫁接,在其葉和根部組織中鑒定出112個已知的和48個新的miRNAs,并由生物學(xué)分析明確嫁接操作可直接導(dǎo)致miRNA及其靶基因的表達(dá)變化,反之,也間接證明miRNA可以通過介導(dǎo)靶基因而顯著影響嫁接苗的生理過程[94]。Liu從感染CGMMV的黃瓜植株(C.sativus‘中農(nóng)16’)體內(nèi)獲得8個新的miRNA,其調(diào)控的多個靶基因分別參與黃瓜的細(xì)胞分化、生長發(fā)育、次級代謝、生物或非生物應(yīng)答、光合作用以及作物產(chǎn)量相關(guān)的生物過程[95]。鑒于miRNA在植物的抗逆生理和生長發(fā)育過程中出眾的調(diào)控能力,尤其在基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵點(diǎn)所起的作用,以及所調(diào)控靶基因之間的相互關(guān)系,極其有助于在基因轉(zhuǎn)錄水平挖掘更多的病程相關(guān)基因,從而使得利用miRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因植株或利用其所調(diào)控的病程相關(guān)基因培育抗病品種的研究具有較大的發(fā)展?jié)摿90]。

4.2 下一代測序技術(shù)和基因編輯技術(shù)在防治CGMMV中的應(yīng)用

在實(shí)際生產(chǎn)中,防治病害的前提是準(zhǔn)確發(fā)現(xiàn)、鑒定該病害,并通過進(jìn)一步分析病害與寄主植物的互作關(guān)系及其各自基因組的特點(diǎn),從而根據(jù)其特性去制定相應(yīng)的防治策略。

CGMMV作為一種系統(tǒng)侵染的典型種傳病害,缺乏準(zhǔn)確、高效的檢測手段是其近年來快速傳播的重要因素。2009年,隨著下一代測序技術(shù)(next generation sequencing,NGS)在病毒、類病毒基因組測序、病害檢測、診斷、病害流行學(xué)以及抗性基因挖掘中的普及應(yīng)用[96],基于其高通量測序數(shù)據(jù)的結(jié)果、且不需提供特異性病毒檢測試劑的特點(diǎn),再結(jié)合CLC Genomics Workbench (QIAGEN,USA,http:∥www.clcbio.com/products/clc-genomics-workbench/#)軟件在病原物鑒定及其生物信息學(xué)中的強(qiáng)大分析能力,從而使得NGS逐漸成為病害診斷的常規(guī)方法,也進(jìn)一步使得各種侵染或隱藏于傳播材料或寄主體內(nèi)的病毒越來越易于被發(fā)現(xiàn)[97]。目前,基于NGS技術(shù)鑒定病害的方法,已從植物體內(nèi)成功鑒定出49個新的RNA、DNA病毒和4個類病毒/類病毒RNAs[98]。隨后,Witek等[99]通過研究野生馬鈴薯近緣種少花龍葵(Solanumamericanum)攜帶的抗性基因,結(jié)合SMRT(單分子實(shí)時測序)和RenSeq(抗性基因ENrichment SEQuencing)的新一代測序技術(shù)SMRT RenSeq成功分離出對枯萎病有廣泛抗性的Rpi-amr3基因。這些新測序技術(shù)的應(yīng)用最大可能地快速發(fā)現(xiàn)并鑒定植物材料中攜帶的病毒,并且極大地縮短了分離抗性基因的時間,間接地減少了作物因病害造成的損失。最近幾年,相對于ZEN[100](zinc-finger nuclease)和TALEN[101](transcription activator-like effector nuclease)基因編輯技術(shù)的繁瑣費(fèi)時,高效穩(wěn)定的第三代基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR-associated genes)逐漸受到研究人員的青睞[102]。CRISPR是最初在E.coli體內(nèi)被發(fā)現(xiàn),形成于細(xì)菌與病毒的互作過程中、由病毒的部分DNA片段嵌入細(xì)菌基因組而形成的DNA(脫氧核糖核酸)片段區(qū)域[103]。因此,當(dāng)病毒再次侵染時,由于Cas蛋白酶對病毒基因組的識別、切割而使得寄主產(chǎn)生免疫應(yīng)答,從而達(dá)到保護(hù)寄主的目的[104]。目前,該技術(shù)已經(jīng)被成功地應(yīng)用于改善植物的生物學(xué)性狀,或利用其特性來增加植物抵御病蟲害的能力[105]。例如: Feng通過利用CRISPR/Cas系統(tǒng)定點(diǎn)突變雙子葉植物擬南芥的BRI1、JAZ1、GAI基因,結(jié)果表明該系統(tǒng)可以準(zhǔn)確地造成特定位點(diǎn)DNA雙鏈斷裂,且獲得效率較高的T1代純合突變體[106]。Ali證明在本生煙(N.benthamiana)中表達(dá)CRISPR/Cas9可有效地推遲或減少番茄黃化曲葉病毒(Tomatoyellowleafcurlvirus, TYLCV)的積累,從而消除或減輕寄主植物被感染的癥狀[107]。不同于CRISPR/Cas系統(tǒng)中RNA引導(dǎo)的DNA剪切,最近由Gao剛發(fā)現(xiàn)的NgAgo-gDNA基因編輯技術(shù)中DNA引導(dǎo)的DNA剪切,由于其更加高效精確以及具有更大的靈活性而更加有潛力地具有廣泛的應(yīng)用前景[108]。隨著基因編輯技術(shù)越來越成熟地成功應(yīng)用于精準(zhǔn)農(nóng)業(yè)生產(chǎn),侵染雙子葉葫蘆科作物的CGMMV病毒病害將有望得到有效、徹底的控制。

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[108]Gao Feng, Shen Xiao, Jiang Feng, et al. DNA-guided genome editing using theNatronobacteriumgregoryiArgonaute[J]. Nature Biotechnology, 2016, doi:10.1038/nbt.3547.

(責(zé)任編輯:田 喆)

Research progress in management of Cucumber green mottle mosaic virus

Liu Huawei1,2, Luo Laixin1,2, Zhu Chunyu3, Liang Chaoqiong1,2, Liu Pengfei1,2, Li Jianqiang1,2

(1. Department of Plant Pathology, China Agricultural University, Beijing Key Laboratory of Seed Disease Testing and Control (BKL-SDTC), Beijing 100193, China; 2. Beijing Engineering Research Center of Seed and Plant Health (BERC-SPH), Key Laboratory of Plant Pathology, Ministry of Agriculture of P.R China,Beijing 100193, China; 3. Institute for the Control of Agrochemicals, Beijing 100026, China)

Cucumbergreenmottlemosaicvirus(CGMMV) causes devastating disease on cucurbits, and it has been listed as quarantine pathogen in many countries in the world. It was reported in at least 23 provinces in China, causing substantial yield losses and lower market value of cucurbits. This review summarized the current control methods of CGMMV and tried to explore the novel control strategies, including next-generation sequencing (NGS) and gene-editing technology for viral diagnostics and identification, and miRNA mediated-resistance to CGMMV infection.

Cucumbergreenmottlemosaicvirus; management method; research progress

2016-03-24

2016-05-27

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201303028)；國家自然科學(xué)基金(31371910)

S 436.42

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.06.004

* 通信作者 E-mail: lijq231@cau.edu.cn