馬宇欣, 李世訪

(中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所, 北京 100193)

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特約稿件

高通量測序技術(shù)在鑒定木本植物雙生病毒中的應用

馬宇欣, 李世訪*

(中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所, 北京 100193)

高通量測序技術(shù)(next-generation sequencing, NGS)平臺提供了一種高效、快速、低成本、深度測序DNA的解決方案,2009年該技術(shù)開始被應用于植物病毒學領域,包括新病毒的發(fā)現(xiàn),病害病原的鑒定,病毒基因組多樣性及進化的研究,顯著加快了植物病毒學的發(fā)展進程。迄今,應用高通量測序技術(shù)已經(jīng)成功鑒定了上百種新的植物病毒和類病毒。雙生病毒是一類對多種作物造成毀滅性危害的DNA病毒,多發(fā)生于草本作物。然而利用高通量測序技術(shù),從柑橘、葡萄、蘋果和桑樹等多種多年生木本植物中檢測到了新的雙生病毒,顯示出了高通量測序技術(shù)所獨有的、傳統(tǒng)檢測技術(shù)所不具備的優(yōu)勢。本文圍繞高通量測度技術(shù)在植物病毒學領域的應用進行概述,重點闡述NGS用于檢測木本植物雙生病毒的幾個實例。

高通量測序; 雙生病毒; 植物病毒診斷; 木本植物

1 高通量測序技術(shù)

1.1 高通量測序平臺的建立及應用

2005年,傳統(tǒng)的桑格測序技術(shù) (Sanger sequencing)遭遇了革命性的沖擊,更準確、更快速的高通量測序技術(shù)誕生了[1]。美國羅氏公司的Roche 454測序平臺的推出,開創(chuàng)了高通量測序的先河,此后,美國Illumina公司和ABI公司相繼推出Solexa[2]和SOLiD[3-4]測序技術(shù)。高通量測序技術(shù)的誕生是基因組學領域一個具有里程碑意義的事件[5-7],為現(xiàn)代生命科學的研究提供了前所未有的機遇[8]。

與傳統(tǒng)的桑格測序相比,高通量測序技術(shù)在測序速度和通量上有了巨大提高,測序成本也大大降低。以人類基因組計劃為例,2001年,人類基因組草圖發(fā)表,宣告人類基因組計劃初步完成,這項研究耗時15年,花費了近30億美元[9]。而如今應用最新的HiSeq X 測序平臺,能夠在一天內(nèi)測序45個人類基因組,并且每個基因組測序僅需1 000美元。相比傳統(tǒng)測序方法有了量的提高和質(zhì)的飛躍,這將推動更多物種遺傳信息的解密,跨入基因組信息的大數(shù)據(jù)時代。

目前,高通量測序技術(shù)在分子生物學領域的應用包括:全基因組測序 (whole-genome sequencing)[10-12],外顯子組測序 (exome sequencing)[13-14],目標區(qū)域測序 (targeted regions sequencing, TRS),未知基因組的從頭測序 (denovosequencing),總RNA和mRNA測序 (RNA-Seq),小RNA和非編碼RNA測序[15],以及表觀基因組學領域的DNA甲基化測序[16],核糖體圖譜和ChiP測序[17]等,為遺傳信息的揭示和基因表達調(diào)控等基礎生物學的研究提供了重要的數(shù)據(jù)信息[8]。

1.2 高通量測序平臺的比較

在過去的10年里,高通量測序技術(shù)平臺經(jīng)歷了不斷的改進,美國Illumina和Roche等生物科技公司相繼推出不同原理、不同應用特性、功能更強大的測序儀,單次測序反應數(shù)據(jù)量也由2005年的1G增長至1T,提高了1 000倍[18](表1)。依據(jù)測序原理的不同,目前常用的測序方法有連接法測序(sequencing by ligation, SBL)及使用合成法測序 (sequencing by synthesis, SBS)的循環(huán)可逆終止法(cyclic reversible termination, CRT)和單核糖核酸增加法(single-nucleotide addition, SNA)[19]。對各大測序平臺比較發(fā)現(xiàn)[19],NGS研究最常用的是Illumina平臺, Illumina的產(chǎn)品覆蓋了從低通量的Mini-Seq到超高通量的HiSeq X系列,其中HiSeq X系列最多可以在一年內(nèi)產(chǎn)生1 800多個30×覆蓋度的人類基因組數(shù)據(jù)量。目前Illumina測序儀能測得的最長讀長為300 bp,并且運行穩(wěn)定、數(shù)據(jù)可靠、性價比高,這些優(yōu)勢決定了其在短讀長測序上的廣泛應用。Roche 454平臺和Ion Torrent平臺能夠提供較長的讀長,大約為700 bp與400 bp,因而在基因組結(jié)構(gòu)較為復雜的研究上應用相對較多,然而與Illumina平臺相比,其高昂的費用,低通量等缺點限制了它們的廣泛應用。以連接測序法為原理的SOLiD 5500測序平臺能夠測得75 bp的讀長,準確率雖高,但由于讀長太短,運行時間太長等硬傷限定了其實用性。同樣測序原理的華大基因的BGISEQ-500平臺,采用探針錨定聚合技術(shù) (cPAS)能夠進行單、雙端測序,提供一站式測序體驗,測得的最長讀長達100 bp,快速、靈活、可拓展是該平臺的優(yōu)勢。Qiagen的GeneReader是專為臨床診斷設計的,主要應用于腫瘤基因上,應用面較窄(表1)。

表1 第二代測序技術(shù)平臺的比較[19]1)

Table 1 Comparison of NGS platforms[19]

平臺Platform讀長/bpReadlength通量/RunThroughput運行時間Runtime錯誤率/%Errorprofile每Gb費用/＄CostperGb優(yōu)勢Advantage局限性Limitation連接法測序Sequencingbyligation，SBLSOLiD5500Series50/75(SE)160～320Gb～10d≤0．170準確率高讀長短運行時間長BGISEQ?50050～100(SE，PE)40～200Gb24h≤0．1NA一站式速度快通量高讀長短合成法測序Sequencingbysynthesis，SBS?循環(huán)可逆終止法(Cyclicreversibletermination，CRT)IlluminaMiniSeqHighoutput75～150(PE)1．6～7．7Gb7～24h≤1200～300IlluminaMiSeqv375～300(PE)3．3～15Gb21～56h0．10110～250IlluminaNextSeq500/55075/150(PE)16～120Gb15～29h<140通量高運行速度快費用低性價比高讀取高AT或CG富集片段時，錯誤率高IlluminaHiSeq2500v2Rapidrun50～250(PE)25～150Gb16～60h0．1040～90IlluminaHiSeq250050～125(PE)135～500Gb2．5～11d0．1030～58IlluminaHiSeq3000/400075/150(PE)325～750Gb1～3．5d0．1020～30IlluminaHiSeqX150(PE)800～900Gb<3d0．107QiagenGeneReaderNA12gene；1250mutationsNA400～600/panel全流程平臺費用合理應用范圍窄

續(xù)表1 Table 1(Continued)

平臺Platform讀長/bpReadlength通量/RunThroughput運行時間Runtime錯誤率/%Errorprofile每Gb費用/＄CostperGb優(yōu)勢Advantage局限性Limitation合成法測序(Sequencingbysynthesis，SBS)?單核糖核酸增加法(Single?nucleotideaddition，SNA)454GSJuniorSystem400～1000(SE，PE)35～70Mb10～18h119500～40000讀長長精確度高通量低價格昂貴454GSFLX450～1000(SE，PE)450～700Mb10～23h19500～15500IonPGMTMSystem200～400(SE)30Mb～1Gb3～23h125～1000IonProtonTMSystem200(SE)10Gb2～4h180靈活快速費用低單向測序限制其應用IonS5System200～400(SE)600Mb～15Gb2．5～4h1300～2400

1) SE: 單端測序; PE: 雙端測序。

SE: Single-end sequencing; PE: Pair-end sequencing.

2 高通量測序技術(shù)在植物病毒檢測領域的應用

植物病毒病是影響作物生產(chǎn)的重要病害,不同于真菌和細菌病害,病毒病害由于缺少有效的防控藥劑,使得其防治十分困難。而且隨著國際交流日益頻繁,貿(mào)易全球化,植物繁殖材料和種子的運輸?shù)榷紩斐刹《竞皖惒《驹趪H間迅速傳播。因此,盡可能地掌握病毒的發(fā)生及分布情況,建立快速、準確的檢測技術(shù),做好植物材料入境檢驗檢疫工作,對于植物病毒病害的防控尤為重要。傳統(tǒng)的植物病毒檢測方法包括:生物學測定法、血清學檢測法、電子顯微鏡檢測法、分子生物學檢測法等，這些方法在過去的幾十年里發(fā)揮著巨大作用,是植物病毒檢測的有力手段。然而,以上方法的實施必須對病原物有預先的了解,包括基因組結(jié)構(gòu)特性,核酸序列,血清學特性等等,并且耗時較長、靈敏度不高,更加無法有效檢測未知的新病毒和類病毒,高通量測序的誕生及其在植物病毒檢測方面的應用,克服了上述植物病毒傳統(tǒng)檢測方法的弊端,帶來了檢測技術(shù)上的革命。

2009年,高通量測序技術(shù)開始應用于植物病毒學領域[20-22],包括發(fā)現(xiàn)新的病毒及類病毒、鑒定已知病害的病原、分析基因組多樣性和進化及病害流行學等[23]。高通量測序技術(shù)在未知病毒的發(fā)現(xiàn)與鑒定研究中發(fā)揮了巨大優(yōu)勢,迄今已鑒定了100種以上新的植物病毒和類病毒[24-27],不僅包括從主要農(nóng)作物上鑒定的,還包括從野生植物或雜草中鑒定的多種病毒[26,28-29],顯著加快了新病毒的發(fā)現(xiàn)歷程,錢亞娟等[30]曾對高通量測序技術(shù)及其在植物病毒發(fā)掘中的應用研究和前景進行了詳細的概述和展望。

高通量測序技術(shù)的高靈敏度及非序列依賴性的優(yōu)勢也被充分應用于植物的進出口檢驗檢疫過程中。例如:2014年,在法國蒙彼利埃,Candresse等[31]利用高通量測序技術(shù)從一批進口甘蔗中檢測到了一種新的雙生病毒-甘蔗白條紋病毒 (Sugarcanewhitestreakvirus, SWSV),然而,常規(guī)的檢測方法卻未能檢測到該病毒,躲過了入境檢驗。與之類似,在美國,利用NGS成功從進口的油桃樹中檢測到了一種新的黃矮病毒 (Luteovirus)和一種新的玉米雷亞朵非納病毒 (Marafivirus)[32]。因此,在不久的將來,隨著檢測成本的降低和技術(shù)的進步,高通量測序技術(shù)將有可能成為常規(guī)的檢測技術(shù),應用于植物進出口的檢驗檢疫,顯著減少可能蒙混過關的未知病毒的數(shù)量,有效控制病毒病在不同區(qū)域間的傳播和擴散。

3 高通量測序技術(shù)檢測植物病毒的測序模板

高通量測序技術(shù)用于檢測植物病毒的主要流程包括:1)樣品的制備;2)文庫構(gòu)建;3)上機測序;4)數(shù)據(jù)分析等[30]。其中,樣品的制備過程中核酸的高質(zhì)量提取是關鍵步驟,它將直接影響文庫的構(gòu)建,進而影響測序的深度。然而,與寄主植物基因組相比,病毒基因組的含量是極低的,如何高效地提取病毒來源的核酸,以便在測序反應中測得更多來自于病毒本身的序列,這是眾多研究者正在探索的問題。盡可能地富集病毒來源的序列,選擇合適的測序平臺,提高測序的深度和檢測的靈敏度,顯得尤為關鍵。目前,依據(jù)不同的原理,高通量測序常用的測序核酸包括以下幾種:1)總RNA或總DNA (total RNA or DNA)；2)雙鏈RNA (double stranded RNA, dsRNA)；3)病毒粒子相關核酸(virion-associated nucleic acids，VANA)；4)sRNA (small RNA)。

3.1 總RNA或總DNA

研究感病植物中病毒種類的最直接的方法就是測序總核酸,提取總RNA或者總DNA,進行高通量測序,理論上可以檢測到所有RNA或者DNA病毒,對病毒的群體進行研究。Rwahnih 和Adams等[20-21]最早于2009年通過提取總RNA進行高通量測序的方法,成功從葡萄和觀賞植物蛇鞭菊中檢測到新的病毒。以總RNA和總DNA為測序靶標,已發(fā)現(xiàn)了約34種新病毒[26]。然而,這種方法最大的弊端是測序測得的90%以上序列來自于寄主基因組,而非病毒基因組,在這種復雜序列背景下,含量低的植物病毒會檢測不到。

3.2 雙鏈RNA

多數(shù)RNA病毒在復制過程或基因組組裝過程中會產(chǎn)生雙鏈形態(tài)的RNA(double stranded RNA,dsRNA), 這是病毒所特有的形態(tài),因此以dsRNA為測序模板,能夠更高效地獲得病毒特異性序列,在無寄主基因組序列干擾的情況下,提高了測序深度,降低了測序成本[33-34]。Rwahnih在鑒定葡萄西拉病毒1(GrapevineSyrahvirus-1)時,分別測序了總RNA和dsRNA,結(jié)果發(fā)現(xiàn)dsRNA作為測序模板會獲得更多病毒來源的reads,靈敏度更高。并且,以dsRNA為測序模板能夠有效地檢測真菌病毒及雙鏈RNA病毒,Roossinck等在這個研究領域取得了很多成果。2010年,Roossinck建立了以dsRNA為測序模板,通過高通量測序研究病毒群體的測序流程[33],為了能在數(shù)據(jù)量有限的前提下,最大可能地測得病毒來源的序列,他們將來源不同的植物樣品混合成一個測序樣品 (pooled samples)進行測序,每個植物樣品在cDNA制備過程中都帶有4堿基的序列標簽,使得測得的序列結(jié)果可以追溯到相對應的寄主植物,在顯著降低測序成本的同時,可以對病毒種群多樣性及生態(tài)學進行研究,意義重大[26]。然而,這種測序方法的缺點是不能有效地檢測負義單鏈RNA病毒和DNA病毒,而且雙鏈RNA的制備目前多采用CF-11特異性結(jié)合dsRNA的方法提取[35],耗時長,操作復雜。

3.3 病毒粒子相關核酸

最初,通過提取病毒的粒子,從中提取病毒相關的核酸進行測序,這種策略被用于檢測動物和人體組織中的RNA和DNA病毒[36-38]。直到2006年,Zhang等[39]在對人類糞便的病毒種群研究中發(fā)現(xiàn):糞便樣品中絕大多數(shù)RNA病毒序列與多種植物RNA病毒相似,其中數(shù)量最多的是辣椒輕斑駁病毒(Peppermildmottlevirus, PMMoV),令人震驚的是,從人類糞便中分離出來的類PMMoV 病毒片段能夠感染健康的辣椒植株,從中能夠重新檢測到 PMMoV,這是利用VANA檢測植物病毒的首個實例[39]。常規(guī)的步驟包括以下幾步:通過超速離心或過濾的方法分離病毒粒子,然后利用 RNA酶和DNA酶降解無包裹的核酸,超速離心獲得純化的病毒粒子,最后提取病毒粒子內(nèi)的核酸分子[26]。制備好VANA后,結(jié)合RT-PCR和klenow長片段擴增,可以同時檢測RNA病毒和DNA病毒[31]。采用這種方法,現(xiàn)已檢測并鑒定了近10種新病毒[26],其中包括雙生病毒科的兩種新病毒Euphorbiacaput-medusaelatentvirus和Sugarcanewhitestreakvirus,分別屬于Capulavirus屬和玉米線條病毒屬 (Mastrevirus)。通過純化VANA檢測病毒的優(yōu)勢在于,它能夠去除寄主基因組序列,消除無關序列干擾,達到最大化地富集病毒序列的目的。可能的缺點是無法檢測無蛋白外殼或無穩(wěn)定外殼包裹的病毒和類病毒,并且樣品制備過程冗長、復雜。

3.4 Small RNA

當病毒侵入寄主細胞后,植物會啟動RNA沉默機制來抵抗病毒的侵入和危害,這是一種廣泛存在于植物體的抗病毒機制。病毒在復制、轉(zhuǎn)錄過程中會產(chǎn)生雙鏈形態(tài)的RNA,被寄主的核酸內(nèi)切酶(dicer-like protein)切割成小干擾RNA分子(small interfering RNAs, siRNAs),借助于RNA誘導沉默復合體(RNA-induced silencing complex, RISC),siRNA會序列特異性地結(jié)合并降解病毒基因組RNA或mRNA,從而達到清除病毒的目的。Kreuze等[22]最早利用siRNA進行NGS測序,通過序列組裝,從感病樣品中同時檢測到了ssRNA病毒、ssDNA病毒和dsDNA病毒等不同基因組類型的病毒。迄今,應用該方法已經(jīng)成功發(fā)現(xiàn)30多種新病毒[26],其中雙生病毒有11種,分別來自于甘薯、柑橘、葡萄、蘋果、桑樹等作物[32, 40-46]。由此可見,測序siRNA來檢測雙生病毒是十分有效的。

4 雙生病毒

雙生病毒是一類對多種作物造成毀滅性危害的DNA病毒[47],其寄主范圍十分廣泛。過去20年里,雙生病毒已對番茄、棉花、辣椒、木薯、玉米、小麥、朱槿、哈密瓜等多種主要農(nóng)作物造成了嚴重的危害,給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成很大損失[47-52]。

雙生病毒科(Geminiviridae)病毒是一類具有孿生顆粒形態(tài)的單鏈環(huán)狀 DNA 病毒。其粒子呈雙聯(lián)體形態(tài),大小約 22 nm×38 nm,無包膜。根據(jù)寄主范圍、傳毒介體、基因組結(jié)構(gòu)和序列相似性的不同[53],國際病毒分類委員會在2014年建議將雙生病毒科劃分為7個屬,包括原有的4個屬:玉米線條病毒屬(Mastrevirus)、菜豆金色花葉病毒屬(Begomovirus)、番茄偽曲頂病毒屬(Topocuvirus)、甜菜曲頂病毒屬(Curtovirus)和新增的3個屬:伊朗甜菜曲頂病毒屬(Becurtovirus)、畫眉草條紋病毒屬(Eragrovirus)和蕪菁曲頂病毒屬(Turncurtovirus)[54]。2013年,Bernardo等[42]從大戟科孔雀球中分離到一個新的雙生病毒,其基因組結(jié)構(gòu)與已知雙生病毒有較大差異,因此作者建議成立一個新的屬:Capulavirus。同樣的,Poojari等[43]從葡萄中也分離到一個與已知雙生病毒差異較大的新病毒,他建議成立一個名為Graingemvirus的新屬。已劃分的7個屬中,除菜豆金色花葉病毒屬的病毒含有單組分或雙組分基因組外,其余6個屬的病毒都含有單組分基因組。部分單組分的菜豆金色花葉病毒屬病毒伴隨有衛(wèi)星 DNA分子。

4.1 木本植物中的雙生病毒

目前,已分類的雙生病毒有371種,其中的大多數(shù)病毒是從草本植物中分離出來的,這種現(xiàn)象似乎暗示了雙生病毒只能侵染草本植物。然而近年來,應用傳統(tǒng)檢測方法或高通量測序技術(shù),多種木本植物上的新雙生病毒被鑒定和報道[41-42, 45, 55-58]。例如,采用滾環(huán)擴增法(rolling circle amplification, RCA),Polston等[55]從佛羅里達州的麻風樹屬珊瑚花中分離到了新的雙生病毒麻風樹花葉病毒(Jatrophamosaicvirus, JaMV);2015年,Basso等[56]同樣利用滾環(huán)擴增的方法從巴西的蘋果、梨和葡萄中分離出同一種新的雙生病毒——溫帶水果腐爛相關病毒(temperate fruit decay-associated virus, TFDaV)。然而,借助于高通量測序技術(shù),通過測序sRNA、DNA或dsRNA,研究人員相繼從柑橘[41]、葡萄[40, 57]、蘋果[45]、桑樹[58]等多種木本植物中分離到基因組結(jié)構(gòu)獨特的新的雙生病毒,且多與類病毒發(fā)生混合侵染(表2)。由此可見,雙生病毒不僅在經(jīng)濟作物、草本植物上有發(fā)生,在觀賞植物、木本植物上也有發(fā)生,高通量技術(shù)在新的雙生病毒,尤其是木本植物上的雙生病毒的鑒定上十分占優(yōu)勢。同時,雙生病毒寄主范圍之廣泛應當引起全世界的高度重視,也促使人們積極開展抗雙生病毒的研究,尋找防治該病毒的新策略。

表2 應用高通量測序技術(shù)從木本植物中檢測到的雙生病毒1)

1) CCDaV:Citruschloroticdwarf-associatedvirus; GRBaV:Grapevineredblotch-associatedvirus; AGV:Applegeminivirus; MMDaV:Mulberrymosaicdwarf-associatedvirus; CEVd:Citrusexocortisviroid; CDVd:Citrusdwarfingvirus; HpSVd:Hopstuntviroid; GLRaV:Grapevineleafroll-associatedvirus; GRSPaV:Grapevinerupestrisstempitting-associatedvirus; ASSVd:Applescarskinviroid; GLVd:Grapevinelatentviroid; MscVd: Mulberry small circular viroid-like RNA.

4.1.1 柑橘褪綠矮縮相關病毒(Citrus chlorotic dwarf-associated virus, CCDaV)

柑橘褪綠矮縮病(Citrus chlorotic dwarf disease, CCDD)是一種嫁接傳染病, 1980年于土耳其首次報道,該病害會導致葉片卷曲、皺縮、反卷和畸形,有的葉片會表現(xiàn)褪綠斑駁,幼苗感染該病毒會表現(xiàn)叢生和矮化癥狀,嚴重影響柑橘的產(chǎn)量和品質(zhì)[32]。因此,在土耳其,柑橘褪綠矮縮病被認為是柑橘上最嚴重的病害[59-61],因其病原未知,該病害一直沒能得到有針對性的防治。

近年來,Loconsole等利用高通量測序技術(shù),對該病害的病原進行了研究。通過測序其siRNA和DNA,從中鑒定出一種新的雙生病毒,該病毒可通過嫁接傳染,與病害的發(fā)生具有相關性,故將其命名為柑橘褪綠矮縮相關病毒(Citrus chlorotic dwarf associated virus, CCDaV)。柑橘褪綠矮縮相關病毒CCDaV的基因組為單鏈環(huán)狀DNA,全長3 640 nt,基因組結(jié)構(gòu)與其他雙生病毒相似,含有雙生病毒保守的一個基因間隔區(qū)(intergenic region),包括雙生病毒復制和轉(zhuǎn)錄所必需的結(jié)構(gòu)域以及莖環(huán)結(jié)構(gòu),環(huán)中具有 9 堿基保守序列“TAATATTAC”; 預測含有5個開放閱讀框(open reading frame, ORF),病毒鏈含有3個閱讀框(V1, V2, V3),分別編碼病毒外殼蛋白(coat protein, CP)和運動相關蛋白(movement protein, MP),互補鏈含有兩個閱讀框(C1, C2),編碼與病毒復制相關的蛋白(replication-associated protein, Rep)。

不同于其他的雙生病毒:1)柑橘褪綠矮縮相關病毒的基因組(3 640 nt)是目前已知最長的;2)其病毒鏈含有3個開放閱讀框, V3可能編碼與細胞間運動相關的蛋白(MP),這與甜菜曲頂病毒屬病毒的結(jié)構(gòu)類似,但兩者的V3閱讀框的位置不同;3)另外,其互補鏈存在一個內(nèi)含子區(qū)(圖2),長度為113 nt,轉(zhuǎn)錄時可能會發(fā)生內(nèi)含子的剪切從而表達融合蛋白Rep[58],然而這種剪切策略通常發(fā)生在玉米線條病毒屬(Mastrevirus)病毒的表達過程[62]。鑒于柑橘褪綠矮縮相關病毒的基因組結(jié)構(gòu)的特殊性,Loconsole提議將其列為雙生病毒科新屬的成員[41]。

2015年,在我國云南省,首次從感病的‘尤力克’檸檬(‘Eureka’ lemon)中檢測到柑橘褪綠矮縮相關病毒,研究發(fā)現(xiàn)該病毒可通過嫁接方式傳染大紅橘(C.tangerinaHort.exTanaka)和柚子不同品種。其中，酸檸檬(C.aurantifolia)、塔希提酸橙(C.×latifolia)和‘水晶’蜜柚及‘洪玉仙’蜜柚等感染該病毒后表現(xiàn)明顯的病害癥狀,‘琯溪’蜜柚無明顯癥狀表現(xiàn)[63]。在調(diào)查病害發(fā)生情況的同時,研究人員收集感病‘尤力克’檸檬樹上的成年柑橘粉虱[Dialeurodescitri(Ashmead)],通過PCR試驗從柑橘粉虱體內(nèi)中檢測到了CCDaV,并且柑橘粉虱發(fā)生量大的果園該病害也越嚴重,由此推測,柑橘粉虱可能是該病毒的傳毒介體之一[63]。

4.1.2 葡萄紅斑相關病毒(Grapevine red blotch-associated virus, GRBaV)

葡萄紅斑病最早發(fā)現(xiàn)于加利福尼亞的納帕山谷(Napa Valley)[64],感病葡萄葉片的邊緣和葉脈變紅,葉片出現(xiàn)紅斑,感病果實中糖分含量降低,嚴重影響果實品質(zhì)[57]。因此,2008年,科學家開始對紅斑病進行研究,探究其病原。2013年, Al Rwahnih等人通過宏基因組測序技術(shù),結(jié)合滾環(huán)擴增技術(shù)RCA和傳統(tǒng)PCR技術(shù),從感病葡萄品種‘Cabernet Franc’,‘Cabernet Sauvignon’和‘Zinfandel’中分離到了一種新的雙生病毒,該病毒基因組為單鏈環(huán)狀DNA分子,單組分,全長3 206 nt,含有6個開放閱讀框,正義鏈含有3個閱讀框(V1～V3), 互補鏈含有3個閱讀框(C1～C3),在互補鏈存在一個內(nèi)含子,閱讀框C1和C2表達融合蛋白-復制相關蛋白Rep。并且該病毒可通過嫁接傳染,與病害癥狀的發(fā)生相關,因此將其命名為葡萄紅斑相關病毒(Grapevine red blotch-associated virus, GRBaV)。

與此同時,美國的研究者Krenz等人在紐約州也發(fā)現(xiàn)了這種新病毒,將其命名為Grapevine cabernet franc virus (GCFV)[40];同樣的,2013年,Poojari等人報道了華盛頓地區(qū)葡萄紅葉相關病毒(Grapevine redleaf associated virus，GRLaV)的發(fā)生。然而以上3個不同名字的病毒,雖然分離自美國不同的地區(qū),但卻是同一種病毒,最終定名為葡萄紅斑相關病毒GRBaV。Poojari的介體傳播試驗證明:在溫室培養(yǎng)條件下,該病毒能夠通過弗吉尼亞五葉地錦葉蟬(ErythroneuraziczacWalsh)在葡萄植株間傳播[43]。2014年,Krenz等[44]建立了GRBaV的多重PCR檢測技術(shù),2015年的病害調(diào)查數(shù)據(jù)顯示,該病毒廣泛發(fā)生于加利福尼亞州、華盛頓、俄勒岡州、佐治亞州、馬里蘭州、新澤西州等北美大部分州,且該病害的全面大暴發(fā)已經(jīng)對葡萄產(chǎn)業(yè)造成了巨大損失[65]。

4.1.3 蘋果雙生病毒(Apple geminivirus, AGV)

蘋果是我國栽培面積最大、總產(chǎn)量最高的水果(FAO, 2012),然而近年來,病毒病及類病毒病的發(fā)生嚴重影響蘋果產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

本實驗室利用高通量測序技術(shù)對蘋果樣品中的siRNA進行測序,從中鑒定出一種新病毒,含有雙生病毒的保守結(jié)構(gòu)特征,因此將其命名為蘋果雙生病毒(Apple geminivirus,AGV)[45]。蘋果雙生病毒基因組為單鏈環(huán)狀DNA分子,單組分,全長2 932 nt,含有6個開放閱讀框,正義鏈含有兩個開放閱讀框(V1, V2),互補鏈含有4個開放閱讀框(C1-C4),序列比對及結(jié)構(gòu)域預測顯示,C1和C2編碼與復制相關的蛋白Rep,V1可能編碼外殼蛋白CP,而V2編碼的蛋白質(zhì)功能尚未知。基于復制相關蛋白Rep構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示,蘋果雙生病毒可能是菜豆金色花葉病毒屬的成員,然而基于外殼蛋白CP的系統(tǒng)發(fā)育分析顯示該病毒可能是尚未知的新屬的成員[45]。

對山東、陜西、江蘇和遼寧的部分蘋果樣品進行該病毒的檢測發(fā)現(xiàn),該病毒能夠侵染‘富士’、‘嘎啦’和‘粉果子’等常見品種,但侵染率較低,僅為7.2%(12/165),常不表現(xiàn)癥狀[45]。利用蘋果雙生病毒的侵染性克隆進行生物學測定,顯示該病毒能夠侵染本氏煙、心葉煙和番茄,但也無明顯癥狀,據(jù)此推測該病毒可能尚不具有強致病性,至于是否侵染其他寄主,是否造成嚴重癥狀,以及傳毒的介體是什么等問題還需進一步研究。

4.1.4 ?；ㄈ~萎縮相關病毒(Mulberry mosaic dwarf associated virus, MMDaV)

?；ㄈ~型萎縮病(mulberry mosaic dwarf disease, MMDD)是一種困擾桑樹生產(chǎn)長達數(shù)十年的重要病害, 感病桑樹植株矮小,葉片卷曲、花葉,嚴重影響桑蠶產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[66-67]。因病原未明確,該病多年來一直沒能得到有效的防治。借助于高通量測序技術(shù),該病害的研究取得了重大進展。本實驗室從感病樣品中檢測到一種新的雙生病毒,該雙生病毒的侵染率高達92%,健康樣品侵染率為0,MMDaV與MMDD的發(fā)生具有極大的相關關系,因此將其命名為?；ㄈ~萎縮相關病毒(Mulberry mosaic dwarf associated virus, MMDaV)[58]。

MMDaV的基因組為單組分、單鏈環(huán)狀 DNA, 全長2 952 nt。除了具有雙生病毒科病毒保守的結(jié)構(gòu)之外,該病毒開放閱讀框的個數(shù)及位置不同于其他雙生病毒,病毒鏈含有5 個閱讀框(V1～V5),互補鏈含有 2 個閱讀框(C1～C2)。V1 可能編碼病毒的外殼蛋白CP; V3 編碼的蛋白含有一個跨膜結(jié)構(gòu)域,推測與跨膜運輸有關,行使運動蛋白的功能; C1 和 C2 編碼與復制相關的蛋白。與柑橘雙生病毒CCDaV類似,MMDaV的互補鏈相似位置也存在一個內(nèi)含子區(qū)(圖1),長度為101 nt,RT-PCR試驗驗證了其體內(nèi)剪切活性。與此同時,高通量測序數(shù)據(jù)中有136條reads是橫跨內(nèi)含子區(qū)域的,覆蓋剪切后的轉(zhuǎn)錄本(圖1),這分別是內(nèi)含子剪切的直接和間接證據(jù)。同時,對近期鑒定的一些雙生病毒進行內(nèi)含子的預測及分析,發(fā)現(xiàn)除了CCDaV和MMDaV外,在GRBaV和EcmLV的相似位置也存在內(nèi)含子,根據(jù)剪接方式和結(jié)構(gòu)判斷,這些內(nèi)含子都屬于U2 型的真核 mRNA 內(nèi)含子。剪接位點序列的高度一致且不同于其他雙生病毒,這一特性暗示MMDaV和CCDaV可能具有相似的特性和較近的親緣關系。然而,更加有力和直接的證據(jù)來自系統(tǒng)發(fā)育分析,結(jié)果顯示:MMDaV和CCDaV共同存在于一個單獨的分支,且未歸屬到任何已知的屬中, 因此,我們建議將這兩種病毒共同歸于一個新屬。

圖1 MMDaV和CCDaV互補鏈的內(nèi)含子序列Fig.1 Sequences of introns identified in the complementary sense transcripts of MMDaV and CCDaV

4.2 雙生病毒防治的新策略

目前,雙生病毒的防控策略主要包括:選育抗病品種,控制傳毒介體,利用植物的基因沉默機制等[68-73],然而,所有這些策略的功效甚微。近日,一些研究顯示CRISPR-Cas系統(tǒng)能夠[74-75]特異識別病毒和外源DNA,將該系統(tǒng)引入植物,在植物中建立一套DNA病毒防御體系。以甜菜嚴重曲頂病毒(Beet severe curly top virus, BSCTV)為模式病毒,分別選取模式植物本氏煙(Nicotianabenthamiana)和擬南芥(Arabidopsisthaliana)為寄主材料,利用本氏煙注射表達系統(tǒng),建立了高效的抗病毒sgRNA活性篩選體系,并在瞬時轉(zhuǎn)染植物及轉(zhuǎn)基因植物中同時證明:CRISPR/Cas系統(tǒng)能夠有效地抑制BSCTV在寄主植物中的積累[75]。2015年Ali等[74]利用sgRNA 靶向番茄黃化曲葉病毒(Tomatoyellowleafcurlvirus，TYLCV)的編碼區(qū)和非編碼區(qū),結(jié)果顯示sgRNA 靶向病毒基因間隔區(qū)(intergenic region，IR)能夠有效地降低病毒的含量并減弱病害癥狀,對病毒侵染抑制效果比靶向 CP 或者 Rep 編碼區(qū)的抑制效果更強。靶向IR區(qū)的SgRNA-Cas9系統(tǒng)也成功用于抑制其他兩種雙生病毒-甜菜曲頂病毒(Beetcurlytopvirus，BCTV)和魚黃草花葉病毒(Merremiamosaicvirus，MeMV)。

中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所高彩霞研究組的研究發(fā)現(xiàn):在 sgRNA 的引導下,Cas9 能夠引起植物病毒多個關鍵功能區(qū)(如 IR 區(qū))核苷酸序列的刪減或突變,研究還發(fā)現(xiàn)高效靶位點的選取與靶位點序列所在基因的功能無直接關系[76]。利用此方法培育抗病毒植物,不必基于病毒基因功能的深入了解,簡單易行,通用性強,因此,該研究對培育抗DNA病毒作物具有指導意義。

5 結(jié)語

高通量測序技術(shù)的誕生,為植物病毒的檢測帶來了新的方法和解決方案,極大地推進了植物病毒研究的進程。然而,高通量測序技術(shù)并非完美,存在著一系列待解決的問題。例如:NGS 在為我們提供海量數(shù)據(jù)的同時,其錯誤率也是比較高的(0.1%～15%),其測序質(zhì)量有待提高;讀長相對于傳統(tǒng)的桑格測序也較短,雖然第三代測序技術(shù)單分子實時測序法(single-molecule real-time sequencing, SMRT)能夠很好地解決讀長短的問題,然而其昂貴的費用及通量的限制成為其進一步廣泛推廣的障礙。

高通量測序技術(shù)在植物病毒診斷領域的應用,使得我們能夠更容易地鑒定更多數(shù)量的新病毒和新的類病毒。然而,這個過程卻需要更加嚴格的實驗操作和嚴謹?shù)目蒲袘B(tài)度。例如:高通量測序的高靈敏度使得測序過程中的污染問題十分普遍和棘手,這種錯誤或者污染常發(fā)生在樣品處理和制備過程中、上機測序甚至數(shù)據(jù)分析過程中,這將造成結(jié)果的不可信,處理起來極為麻煩。為了解決這個問題,除了操作過程更加嚴格外,Galan等[77]巧妙地在樣品提取過程中、cDNA制備過程中及測序過程中等都分別加入了空白對照,來排除各種可能存在的污染,設置相應的閾值對所有數(shù)據(jù)進行處理和篩選,去除不準確及錯誤的數(shù)據(jù),得到更為準確的結(jié)果。雖然這項研究是應用在16S rRNA的高通量測序中,但對于植物病毒的檢測,尤其是大樣本中病毒種群的研究來說具有很好的借鑒意義。再比如,借助于高通量的測序技術(shù),我們可以一步到位地得到病毒的遺傳信息,卻往往忽略了傳播方式和寄主范圍等重要的生物學信息,而這些信息在鑒定病害的病原及對新病毒進行分類時,都是不可或缺的。同時,傳統(tǒng)試驗技術(shù)手段的實施及柯赫氏法則的驗證都有利于佐證高通量測序的結(jié)果,使我們得到更準確的結(jié)論。但是,目前缺少快速靈敏有效的生物學測定方法,用于高通量方法發(fā)現(xiàn)的新病毒或者類病毒的驗證,這方面是擺在研究人員面前的一個難題。

在對植物病毒,尤其是雙生病毒的種類進行統(tǒng)計時發(fā)現(xiàn),大多數(shù)的病毒分離于草本植物,而從木本植物中分離的相對較少,分析可能的原因有以下幾點:1)木本植物中病毒的含量較低、不同組織間病毒分布不均;2)堅硬的葉片及植物組織中多糖和單寧含量較高對核酸的提取造成很大困難;3)發(fā)現(xiàn)新病毒后的生物學測定及科赫氏法則驗證都需要更長的試驗周期,難度也遠遠高于草本植物；4)從事木本植物病毒研究的人員和經(jīng)費相對較少。這種草本植物和木本植物間的偏向性同樣發(fā)生在主要農(nóng)作物與野生植物之間,這種偏向性不利于了解病毒在自然狀態(tài)下的真實發(fā)生情況,更加不利于病毒種群多樣性的研究,甚至可能錯失優(yōu)良的抗病毒植物資源。因此,未來對木本植物和野生植物上病毒的研究值得我們更多的關注。

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(責任編輯：田 喆)

Application of next-generation sequencing technology in identification of geminiviruses from woody plants

Ma Yuxin, Li Shifang

(Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China)

Next-generation sequencing (NGS) platforms provide highly efficient, rapid, low-cost high-throughput DNA sequencing. Since 2009, NGS has been applied to plant virology, including discovery of novel viruses, identification of pathogens and analysis of genome diversity and evolution, which speeds up the process of plant virology research. Over one hundred novel plant viruses and/or viroids have been successfully identified by NGS so far. Geminiviruses (FamilyGeminiviridae) with circular, single-stranded DNA genome have caused devastating effect on many crops. To our knowledge, most of them generally infect herbaceous plants. However, many new geminiviruses, recently identified by NGS, were detected from perennial woody plants like citrus, grapevine, apple and mulberry. These studies have shown the superiority of NGS technology over conventional detection protocols. This paper reviews the application of NGS in plant virology and mainly demonstrates its application in detection of geminiviruses from perennial woody fruit trees.

next-generation sequencing; geminiviruses; diagnosis of plant virus; perennial woody plant

Invited Paper

2016-10-08

2016-10-09

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201203076)

S 432.41

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.06.001

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