陳 靜，丘宏強（1.泉州醫(yī)學高等專科學校藥學系，福建泉州 36000；.福建醫(yī)科大學附屬協(xié)和醫(yī)院藥學部，福州 350001）

高效液相色譜-電化學法測定人尿液中兒茶酚胺的濃度

陳 靜1＊，丘宏強2（1.泉州醫(yī)學高等?？茖W校藥學系，福建泉州 362000；2.福建醫(yī)科大學附屬協(xié)和醫(yī)院藥學部，福州 350001）

目的：建立測定人尿液中兒茶酚胺濃度的方法。方法：尿液樣品經(jīng)氧化鋁提取后，以3，4-二羥基芐胺為內標，采用高效液相色譜-電化學法測定，色譜柱為Shim-Pack C18，流動相為混合溶液[每500 ml混合溶液中含離子對試劑（辛烷磺酸鈉）0.5 mmol、甲醇10 ml、0.06 mmol/L二正丁胺50 μl、無水乙酸鈉2.0 g、檸檬酸5.5 g、乙二胺四乙酸二鈉60 mg和氯化鈉584.4 mg，pH＝3.5]，流速為0.8 ml/min，柱溫為30℃，電化學檢測器檢測電壓為750 mV，進樣量為40 μl。結果：去甲腎上腺素和腎上腺素的尿藥濃度均在3.125～100 ng/ml范圍內線性關系良好（r分別為0.998 5和0.999 2），定量下限均為3.125 ng/ml；日內、日間RSD均＜10%；方法回收率分別為99.2%～101.6%、98.9%～100.5%，提取回收率分別為63.8%～66.8%、60.5%～62.6%。結論：本方法特異性強、靈敏度較高、檢測成本低，可用于人尿液中兒茶酚胺濃度的測定。

兒茶酚胺；去甲腎上腺素；腎上腺素；高效液相色譜法；電化學檢測器；尿液

去甲腎上腺素（Norepinephrine，NE）和腎上腺素（Epinephrine，E）是人體內重要的兒茶酚胺類（Catecholamines，CAs）物質，與人們的健康和疾病有著密切的關系[1]。人體內CAs水平不僅可作為嗜鉻細胞瘤的診斷依據(jù)，也有助于原發(fā)性高血壓的鑒別診斷[2]；此外，嗜鉻細胞瘤患者在藥物麻醉、分娩及手術等情況下可能發(fā)生高血壓或休克[3]，故檢測此類患者體內CAs水平具有重要的臨床意義。目前，對體內CAs水平的檢測多采用血液樣本，而血液中兒茶酚胺的質量濃度易受多種因素（如緊張、應激及低血糖等）的影響，且采血時靜脈穿刺引起的疼痛也可導致患者CAs血藥濃度升高[4]。因此，臨床通過檢測患者CAs的尿藥濃度，可獲得更為穩(wěn)定、可靠的結果[5]。本試驗在此基礎上，建立了一種適用于臨床且操作簡便的CAs尿藥濃度檢測方法，以期為臨床提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-20A型高效液相色譜（HPLC）儀，包括LC-20AB型溶劑泵、SIL-20A型自動進樣器、CTO-10Asvp型柱溫箱及DGU-20AB型自動脫氣裝置（日本島津公司）；Waters 2465型電化學檢測器（美國Waters公司）；CP 114型精密分析天平（奧豪斯儀器上海有限公司）；TGL-16G型高速臺式離心機（上海安亭科

學儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

NE對照品（批號：1001474257，純度≥98%）、E對照品（批號：12325621，純度≥98%）、3，4-二羥基芐胺對照品（DHBA，內標，批號：858781-250GM，純度≥98%）均購自美國Sigma公司；離子對試劑[辛烷磺酸鈉（IPR-B8），日本梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司，批號：5324845]；氧化鋁[上海阿拉丁化學試劑公司（堿性，200～300目）]；無水乙酸鈉、檸檬酸、氯化鈉、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na2）、硫代硫酸鈉、鹽酸、乙酸乙酯、二正丁胺等均為分析純，甲醇為色譜純，水為去離子水。健康尿液由本實驗室工作人員（即健康志愿者）提供。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Shim-Pack C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：混合溶液（每500 ml混合溶液中含IPR-B8 0.5 mmol、甲醇10 ml、0.6 mmol/L二正丁胺50 μl、無水乙酸鈉2.0 g、檸檬酸5.5 g、EDTA-Na260 mg、氯化鈉584.4 mg，pH＝3.5）；流速：0.8 ml/min；柱溫：30℃；電化學檢測器檢測電壓：750 mV；進樣量：40μl。

2.2 溶液的配制

分別精密稱取NE對照品8.0 mg、E對照品2.0 mg，用0.02 mol/L鹽酸（含0.1%硫代硫酸鈉）溶解并稀釋，分別配制成NE、E質量濃度分別為0.80、0.20 mg/ml的對照品貯備液。

精密稱取內標對照品400 mg，用0.02 mol/L鹽酸溶解并稀釋，配制成質量濃度為400 ng/ml的內標溶液。

上述溶液均置于冰箱（2～8℃）中避光保存，備用。

2.3 氧化鋁的活化

取氧化鋁10 g，加入2 mol/L鹽酸50 ml，加熱至100℃，攪拌45 min，靜置1.5 min后棄去黃綠色上清液與細顆粒；于70℃下，加入2 mol/L鹽酸25 ml，攪拌10 min，靜置，棄去上清液，重復上述操作1次；于50℃下，加入2 mol/L鹽酸50 ml，攪拌10 min，冷卻，棄去上清液及懸浮顆粒；最后，用去離子水反復沖洗，至pH接近7.0，于200℃下烘烤4 h，冷卻后干燥保存，備用[6]。

2.4 尿液樣品收集與處理

將健康尿液在堿性條件（pH＝10）下于100℃煮沸，再用0.1 mol/L鹽酸調節(jié)pH至4.0，即得空白尿液。取尿液5 ml，加入乙酸乙酯15 ml，振搖5 min，靜置分層。取下層有機相0.5 ml至離心管中，依次加入內標溶液150 μl、0.1%硫代硫酸鈉50 μl、1 mol/L三羥甲基氨基甲烷（Tris）500 μl和已活化的氧化鋁60 mg，振蕩5 min，以離心半徑6 cm、轉速10 000 r/min離心2 min，棄去上清液；沉淀依次用2 mol/L乙酸鈉溶液2 ml洗滌1次、去離子水2 ml洗滌2次后，以離心半徑6 cm、轉速10 000 r/min離心2 min，棄去上清液；沉淀用吸水紙吸干，加入0.1 mol/L高氯酸200 μl，振蕩5 min，以離心半徑6 cm、轉速13 000 r/min離心3 min后，吸取上清液40 μl進樣分析。

2.5 專屬性考察

在“2.1”項色譜條件下，內源性雜質對待測物無干擾，NE、E及內標的保留時間分別為6.818、8.709和11.638 min。HPLC圖見圖1。

2.6 標準曲線的制備

圖1 高效液相色譜圖A.空白尿樣；B.空白尿樣+NE+E+內標；C.健康志愿者尿樣+內標；1. NE；2.E；3.內標Fig 1 HPLC chromatogramsA.blank urine；B.blank urine+NE+E+internal standard；C.urine sample from healthy volunteer+internal standard；1.NE；2.E；3.internal standard

精密吸取NE、E對照品貯備液及空白尿液各適量，配制成NE、E質量濃度均為100、50、25、12.5、6.25、3.125 ng/ml的系列尿液樣品，按“2.4”項下方法處理后，進樣分析，記錄色譜圖。以待測物與內標的峰面積比值（y）為縱坐標、待測物質量濃度（x）為橫坐標進行線性回歸，得NE、E的回歸方程分別為：yNE＝0.062 3xNE+0.097 6（r＝0.998 5）、yE＝0.041 8xE+0.076 2（r＝0.999 2）。結果表明，NE、E尿藥濃度均在3.125～100 ng/ml范圍內線性關系良好，定量下限均為3.125 ng/ml。

2.7 精密度與回收率試驗

2.7.1 精密度 分別配制NE低、中、高質量濃度（4、40、80 ng/ml，下同）的尿液樣品和E低、中、高質量濃度（4、40、80 ng/ml，下同）的尿液樣品，各5份，按“2.4”項下方法處理后，進樣分析。于1日內分別測定5次，考察日內RSD；連續(xù)測定5 d，考察日間RSD。結果顯示，兩者日內、日間RSD＜10%。精密度試驗結果見表1。

表1 精密度與回收率試驗結果（s，n＝5）Tab 1 Results of precision and recovery tests（s ，n＝5）

表1 精密度與回收率試驗結果（s，n＝5）Tab 1 Results of precision and recovery tests（s ，n＝5）

理論質量濃度，ng/ml待測物方法回收率，%提取回收率，% NE 4 E 40 80 4 40 80日內精密度實測質量濃度，ng/ml 3．91±0．15 38．58±1．24 82．36±3．71 3．85±0．10 38．62±1．43 78．58±3．30 RSD，% 3．8 3．2 4．5 2．6 3．7 4．2日間精密度實測質量濃度，ng/ml 3．85±0．14 37．27±1．53 78．69±4．80 3．75±0．12 37．62±1．62 77．98±3．74 RSD，% 3．4 4．1 6．1 3．1 4．3 4．8 99．5 99．2 101．6 99．6 98．9 100．5 63．8 65．2 66．8 62．6 61．3 60．5

2.7.2 方法回收率 分別配制NE及E低、中、高質量濃度的尿液樣品，各5份，按“2.4”項下方法處理后，進樣分析，按當日標準曲線計算兩者的實測質量濃度，與理論質量濃度比較，考察方法回收率。結果顯示，NE、E的方法回收率分別為99.2%～101.6%、98.9%～100.5%。方法回收率試驗結果見表1。

2.7.3 提取回收率 分別配制NE及E低、中、高質量濃度的尿液樣品，各5份，按“2.4”項下方法處理后，進樣分析，得峰面積A；另取空白尿液0.5 ml，各5份，按“2.4”項下方法處理后，分別加入NE、E對照品貯備液各適量，使最終質量終濃度與前者對應，進樣分析，得峰面積B。提取回收率＝A/B×100%。結果顯示，NE、E的提取回收率分別為63.8%～66.8%、60.5%～62.6%。提取回收率試驗結果見表1。

2.8 穩(wěn)定性試驗

分別配制NE及E低、高質量濃度的尿液樣品，考察其在室

溫（25℃）及4℃下放置的穩(wěn)定性。各樣品于室溫25℃下避光保存，分別于0、1、3、6、12 h按“2.4”項下方法處理后，進樣分析，重復操作3次；各樣品于4℃冰箱中放置，隔日取出，室溫融化，按“2.4”項下方法處理后，進樣分析，重復操作3次，連續(xù)測定7 d。以0 h（25℃）或0 d（4℃）時NE或E的尿藥濃度為100%，計算各樣品中NE或E的相對百分含量，評價其穩(wěn)定性。結果顯示，在室溫（25℃）下，各樣品中NE和E的相對百分含量隨時間的延長而明顯下降，12 h后兩者的相對百分含量均低于90%（NE、E分別降至85.2%和89.7%）；而在4℃條件下，NE和E的相對百分含量雖有下降趨勢，但5 d后兩者的相對百分含量仍＞95%，但放置7 d后，NE和E的相對百分含量分別降至94.2%和93.6%，提示各樣品不宜在室溫條件下保存，且在4℃冰箱中放置不宜超過5 d。

3 討論

目前，多采取HPLC法檢測人體內CAs水平，檢測器多選用電化學檢測器、熒光檢測器和紫外檢測器[7-8]。熒光、紫外檢測器信號強度和靈敏度相對較低，而電化學檢測器利用CAs可氧化的特性，通過電流信號放大，可檢測出其他檢測器無法監(jiān)測到的物質，具有特異性強、靈敏度較高、檢測成本低等特點。因此，高效液相色譜-電化學法被廣泛應用于臨床CAs質量濃度的監(jiān)測[9]。

本實驗在流動相中加入了離子對試劑（500 ml混合溶液中含0.5 mmol的IPR-B8），對NE和E具有良好的保留作用[10]。在流動相篩選過程中筆者發(fā)現(xiàn)，若減少了IPR-B8的加入量，NE色譜峰處會出現(xiàn)倒置的干擾峰，且難以通過調整流動相比例來消除其干擾，極大地影響了NE的定量分析。此外，若流動相中甲醇的比例過高，目標峰與雜質峰難以有效分離；而甲醇的比例過低，則會導致分析時間過長。故最終確定每500 ml混合溶液中甲醇的加入量為10 ml。

本試驗采用氧化鋁吸附提取尿液中的CAs，氧化鋁的來源、粒徑、酸堿性和干燥程度等均可影響CAs的提取效率[9]。筆者在前期試驗中比較了不同來源氧化鋁[天津市福晨化學試劑廠（中性，未注明目數(shù)）、西隴化工股份有限公司（中性，未注明目數(shù)）、上海阿拉丁化學試劑公司（堿性，100～200目或200～300目）]的提取效率，以選擇最優(yōu)類型氧化鋁及其最佳用量。結果顯示，上海阿拉丁化學試劑公司的堿性氧化鋁（200～300目）的提取回收率最高（NE、E的提取回收率分別為65.2%、61.3%）；當氧化鋁用量為60 mg時，提取回收率最高（NE、E的提取回收率分別為65.7%、63.3%）。氧化鋁的提取回收率雖不及文獻報道的陽離子交換柱（可達90%）[10-11]，但其在滿足定量檢測的基礎上，成本較陽離子交換柱（僅可使用1次）低了很多。故本研究最終選擇阿拉丁試劑公司的堿性氧化鋁，并將其用量確定為60 mg。此外，在試驗過程中，應注意保持氧化鋁的干燥，防止其吸潮，影響提取效率。

尿液樣品的pH會影響氧化鋁的吸附活性，也會影響CAs的穩(wěn)定性。氧化鋁在pH為8.2～8.5條件下吸附CAs的能力最強，而CAs在堿性條件下卻不穩(wěn)定，兩者存在矛盾[10]。前期試驗以Tris緩沖液作為堿性媒介，對其濃度進行考察。結果顯示，當Tris緩沖液濃度為1 mol/L時，提取回收率最高。此外，Tris緩沖液應盡快加入，以避免CAs在堿性條件下發(fā)生降解。

本研究考察了尿液樣本常溫下放置12 h和4.冰箱中放置7 d的穩(wěn)定性。結果顯示，室溫放置12 h，尿液中的NE、E的相對百分含量分別降至85.2%和89.7%。4℃冰箱保存5 d后，NE、E的相對百分含量無明顯變化，均維持在95%以上；而7 d后，NE、E的相對百分含量則下降至94.2%和93.6%。提示臨床樣本采樣完畢后，應盡快送檢，在冰箱中冷藏放置的時間也不宜超過5 d。

目前，采用尿液中CAs作為嗜鉻細胞瘤的診斷標準并不統(tǒng)一。Lenders JW等[12]提出以24 h尿液中NE＞198μg、E＞31 μg作為確診嗜鉻細胞瘤的標準，而國內則以NE＞100μg、E＞50μg作為診斷標準[13]。本研究顯示，NE及E的尿液濃度的線性范圍均為3.125～100 ng/ml，以正常人平均24 h尿量1 000～2 000 ml計算，本方法可基本滿足臨床檢測的要求。雖然本方法操作步驟較為煩瑣，氧化鋁也需定期活化，但本方法特異性強、靈敏度較高、檢測成本低，適用于CAs尿藥濃度監(jiān)測。

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（編輯：張元媛）

Concentration Determination of Catecholamine in Human Urine by HPLC-Electrochemistry

CHEN Jing1，QIU Hongqiang2（1.Dept.of Pharmacy，Quanzhou Medical College，F(xiàn)ujian Quanzhou 362000，China；2.Dept.of Pharmacy，F(xiàn)ujian Medical University Union Hospital，F(xiàn)uzhou 350001，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the concentration determination of catecholamines in human urine.METHODS：After extracted by aluminum oxide，using 3，4-dihydroxybenzylamine as internal standard，HPLC-electrochemistry was performed on the column of Shim-Pack C18with mixed solution[every 500 ml mixed solution containing ion-pairing reagents（octane sulfonate）0.5 mmol，methanol 10 ml，0.06 mmol/L Di-n-butylamine 50 μl，sodium acetate anhydrous 2.0 g，citric acid 5.5 g，EDTA-Na260 mg and sodium chloride 584.4 mg，pH＝3.5]at a flow rate of 0.8 ml/min，column temperature was 30℃，detection voltage was 750 mV，and injection volume was 40 μl.RESULTS：The linear ranges were 3.125-100 ng/ml for both norepinephrine（r＝0.998 5）and epinephrine（r＝0.999 2），lower limits of quantitation were 3.125 ng/ml；RSDs of within days and daytime were lower than 10%，method recoveries were 99.2%-101.6%and 98.9%-100.5%，extraction recoveries were 63.8%-66.8%and 60.5%-62.6%.CONCLUSIONS：The method shows strong specificity，high sensitivity and low detection cost，and can be used for the concentration determination of catecholamines in human urine.

Catecholamines；Norepinephrine；Epinephrine；HPLC；Electrochemical detector；Urine

R917

A

1001-0408（2016）26-3627-03

2015-12-23

2016-06-04）

＊講師，碩士。研究方向：藥理學。電話：0595-22783475。E-mail：825649654@qq.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.26.08