李天客 陳 中 包 陽 張素欣

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院口腔科，河北 石家莊 050071)

?

RNA干擾SBF2對(duì)人口腔癌細(xì)胞株SCC15增殖、凋亡及侵襲的影響

李天客 陳 中 包 陽 張素欣

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院口腔科，河北 石家莊 050071)

目的 探討RNA干擾SET結(jié)合因子2(SBF2)表達(dá)對(duì)人口腔癌細(xì)胞株SCC15增殖、凋亡及侵襲的影響。方法 根據(jù)SBF2的mRNA序列及siRNA設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)并合成3條靶向SBF2基因的siRNA(SBF2-siRNA1、SBF2-siRNA2、SBF2-siRNA3)，以陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine 2000為載體轉(zhuǎn)染取對(duì)數(shù)生長期SCC15細(xì)胞，同時(shí)設(shè)轉(zhuǎn)染不針對(duì)任何基因的隨機(jī)序列(siRNA-NC)。轉(zhuǎn)染48 h后采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)SBF2干擾效率，分別于轉(zhuǎn)染24、48、72 h采用WST-1法評(píng)價(jià)討RNA干擾SBF2對(duì)SCC15細(xì)胞增殖的影響，分別于轉(zhuǎn)染24、48 h后采用Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)流式細(xì)胞術(shù)和Transwell小室法檢測(cè)SCC15細(xì)胞的凋亡率及穿膜細(xì)胞數(shù)以評(píng)價(jià)RNA干擾SBF2對(duì)凋亡和侵襲能力的影響。結(jié)果 與僅行轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000處理的對(duì)照組相比，SBF2-siRNA1、SBF2-siRNA2和SBF2-siRNA3組SCC15細(xì)胞中SBF2 mRNA水平均降低(P<0.05)，且干擾率由高至低依次為SBF2-siRNA2>SBF2-siRNA3> SBF2-siRNA1，故選取干擾效率最高的SBF2-siRNA2用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。與對(duì)照組和siRNA-NC組相比，SBF2-siRNA組的增殖抑制率和凋亡率均升高，而穿膜細(xì)胞數(shù)降低，以上差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；對(duì)照組和siRNA-NC組以上指標(biāo)的無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)論 RNA靶向干擾SBF2表達(dá)可抑制人口腔癌細(xì)胞增殖及侵襲能力并誘導(dǎo)其凋亡。

RNA干擾；SET結(jié)合因子2；口腔癌；增殖；凋亡

口腔癌是頭部常見的惡性腫瘤，確切發(fā)病機(jī)制尚不清楚，臨床治療手段較局限且效果不理想〔1〕。惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多基因多途徑共同作用的結(jié)果，涉及多個(gè)基因的異常表達(dá)，故探討影響口腔癌惡性行為的關(guān)鍵基因?qū)τ谠摬〉姆乐斡兄匾饬x〔2〕。SET結(jié)合因子2(SBF2)是一個(gè)新近發(fā)現(xiàn)的與癌癥相關(guān)的一個(gè)因子，Wu等〔3〕發(fā)現(xiàn)SBF2基因與胰腺癌患者的生存有關(guān)，Long等〔4〕研究發(fā)現(xiàn)在胰腺癌細(xì)胞中靶向沉默SBF2可抑制胰腺癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，以上提示該基因在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中起一定作用，但目前SBF2基因在口腔癌中的作用效果及方式尚不清楚。為此，本研究設(shè)計(jì)了3條靶向針對(duì)SBF2的小干擾RNA(siRNA)，通過高效轉(zhuǎn)染常用的口腔癌細(xì)胞株SCC15以篩選干擾效果最強(qiáng)的siRNA，進(jìn)一步觀察對(duì)其增殖、凋亡及侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與試劑 人口腔癌細(xì)胞株SCC15購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，WST細(xì)胞增殖毒性分析試劑盒購自中國碧云天生物技術(shù)有限公司，胎牛血清(FBS)購自TBD公司，RPMI 1640培養(yǎng)基及Opti-MEM培養(yǎng)基購自Gibco BRL公司，Annexin-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購自晶美生物工程有限公司，胰蛋白酶購自 Promega公司，陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine 2000、Trizol及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Invitrogen公司，核酸染料SYBR Green I購自北京鼎國生物科技有限公司，Transwell小室購自美國Corning公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將SCC15細(xì)胞復(fù)蘇后，接種于含10% FBS、100 U/ml青霉素及100 μg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)瓶中，于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，48 h后首次更換培養(yǎng)液，棄去未貼壁細(xì)胞，此后每2～3 d換液1次，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，待達(dá)80%～90%融合后，胰酶消化傳代。

1.3 小干擾RNA引物設(shè)計(jì)及轉(zhuǎn)染 根據(jù)SBF2的mRNA序列(NM_030962.3)及特異性siRNA引物設(shè)計(jì)網(wǎng)站(http：//sidirect2.rnai.jp)設(shè)計(jì)3條靶向SBF2基因的siRNA(SBF2-siRNA1、SBF2-siRNA2、SBF2-siRNA3)，同時(shí)設(shè)計(jì)不針對(duì)任何基因的隨機(jī)序列(siRNA-NC)，以上序列均由上海吉瑪制藥有限公司合成。SBF2-siRNA1：5′-UUUGAAUUCCCAAUUGCUGGA-3′，SBF2-siRNA2：5′-AUUUUCCUGUAUUAAUUCCUG-3′，SBF2-siRNA3：5′-UAAAGAUCUCUACUACUUCUG-3′，siRNA-NC：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′ 。

1.4 siRNA轉(zhuǎn)染 于轉(zhuǎn)染24 h前將對(duì)數(shù)生長期SCC15細(xì)胞以2×105個(gè)/ml的濃度接種于6孔板，將50 μl含200 pmol 靶向SBF2 siRNA的Opti-MEM培養(yǎng)基及50 μl 含轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000的Opti-MEM培養(yǎng)基混合5 min，將以上混合物加入2 ml接種SCC15細(xì)胞的不含血清及抗生素的RPMI 1640培養(yǎng)基，4 h后采用含血清的培養(yǎng)基替換，培養(yǎng)48 h后采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)SBF2干擾效率。

1.5 qRT-PCR檢測(cè)SCC15細(xì)胞中SBF2 mRNA水平 采用Trizol試劑提取SCC15細(xì)胞中的總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄成為cDNA，采用SYBR Green I染料進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，條件：95℃變性3 min，(95 ℃ 30 s+60 ℃ 30 s)共40個(gè)循環(huán)，72℃ 30 s延伸。采用2-△△Ct進(jìn)行相對(duì)定量分析，計(jì)算SBF2相對(duì)于內(nèi)參的表達(dá)量。SBF2上游引物：5′-AAGGAGTCTGTATTTGGGAATGT-3′，下游引物：5′-GGCTAGAGACGTTTACATTGGG-3′；β-actin上游引物：5′-AGCGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，下游引物：5′-ACTCCTGCTTGCTGATCCACATC-3′。選取干擾率最高的siRNA進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，根據(jù)siRNA片段轉(zhuǎn)染情況將SCC15細(xì)胞共分為SBF2-siRNA組和siRNA-NC組，同時(shí)設(shè)僅行轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000處理的對(duì)照組。

1.6 WST-1法檢測(cè)細(xì)胞增殖 取3組轉(zhuǎn)染后的SCC15細(xì)胞，以每孔2×103個(gè)接種于96孔板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，分別于轉(zhuǎn)染24、48、72 h后向每孔加入WST-1工作液10 μl，繼續(xù)孵育3 h后，于450 nm波長下采用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光值(A)，根據(jù)公式計(jì)算RNA靶向干擾SBF2相對(duì)于對(duì)照組的增殖抑制率：抑制率(%)=(A對(duì)照組-A干擾組)/A對(duì)照組×100%。

1.7 Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡情況 收集3組轉(zhuǎn)染24、48 h的SCC15細(xì)胞1×106個(gè)，經(jīng)PBS緩沖液沖洗后，加入200 μl 1 ×Annexin V結(jié)合液懸浮細(xì)胞，加入10 μl Annexin-FITC，室溫避光反應(yīng)10 min后加入10 μl PI，避光反應(yīng)15 min后，采用FACSCalibur 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.8 Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞侵襲情況 將3組轉(zhuǎn)染后的SCC15細(xì)胞置于已經(jīng)Matrigel膠包被的Transwell上室，Transwell下室加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，24、48 h后用棉簽輕輕擦掉上室側(cè)未穿過膜的細(xì)胞以及基質(zhì)膠，下層侵襲的細(xì)胞經(jīng)4%多聚甲醛固定30 min，自然風(fēng)干后用1%結(jié)晶紫染色，高倍鏡下(×400)隨機(jī)選取5個(gè)具有代表性的視野計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS18.0軟件行單因素方差分析(one way ANOVA)，兩兩比較采用SNK法。

2 結(jié) 果

2.1 RNA干擾后SCC15細(xì)胞SBF2 mRNA水平變化 與僅行轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000處理的對(duì)照組相比，SBF2-siRNA1、SBF2-siRNA2和SBF2-siRNA3組SCC15細(xì)胞中SBF2 mRNA水平均降低(P<0.05)，且抑制率由高至低依次為SBF2-siRNA2>SBF2-siRNA3> SBF2-siRNA1，故選取干擾效率最高的SBF2-siRNA2用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。siRNA-NC組的SBF2 mRNA水平與對(duì)照組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 RNA干擾后SCC15細(xì)胞SBF2 mRNA水平變化及干擾率

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與SBF2-siRNA1組比較：2)P<0.05；與SBF2-siRNA2組比較：3)P<0.05；與SBF2-siRNA3組比較：4)P<0.05

2.2 RNA干擾SBF2對(duì)SCC15細(xì)胞增殖的影響 SBF2-siRNA組SCC15細(xì)胞的增殖抑制率均高于對(duì)照組和siRNA-NC組(P<0.05)，且對(duì)照組和siRNA-NC組增殖抑制率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表2。

表2 RNA干擾SBF2后SCC15細(xì)胞增殖抑制率變化

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與SBF2-siRNA組比較：2)P<0.05,下表同

2.3 RNA干擾SBF2對(duì)SCC15細(xì)胞凋亡的影響 SBF2-siRNA組SCC15細(xì)胞的凋亡率高于對(duì)照組和siRNA-NC組(P<0.05)，且對(duì)照組和siRNA-NC組凋亡率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表3。

表3 RNA干擾SBF2后SCC15細(xì)胞凋亡率變化

2.4 RNA干擾SBF2對(duì)SCC15細(xì)胞侵襲的影響 SBF2-siRNA組SCC15細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)低于對(duì)照組和siRNA-NC組(P<0.05)，且對(duì)照組和siRNA-NC組穿膜細(xì)胞數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表4。

表4 RNA干擾SBF2后SCC15細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)變化±s,個(gè),n=3)

3 討 論

SBF2位于11p15.4，盡管其具有一個(gè)非活動(dòng)性磷酸酶結(jié)構(gòu)域，但其可提高M(jìn)TMR2的催化活性并可能改變MTMR2的細(xì)胞定位〔5〕，而MTMR2在細(xì)胞內(nèi)的主要功能為磷脂酰肌醇-3-磷酸酶同時(shí)可拮抗某些磷脂酰肌醇-3激酶的活性〔6〕。此外，SBF2與MTMR2構(gòu)成的復(fù)合體可影響某些細(xì)胞表面受體的分揀和降解，如介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞生長的表皮生長因子受體的活性〔7〕，以上提示SBF2可能在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起到一定作用。然而SBF2與口腔癌細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲的關(guān)系目前尚不明確，故本研究設(shè)計(jì)靶向SBF2的siRNA并轉(zhuǎn)染常用的口腔癌SCC15細(xì)胞，采用體外研究的方法觀察干擾SBF2表達(dá)對(duì)SCC15細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲的影響。

本研究在轉(zhuǎn)染靶向SBF2的3條siRNA后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染后SCC15細(xì)胞中的SBF2 mRNA水平均降低，提示靶向干擾成功，可干擾SBF2表達(dá)。細(xì)胞的增殖及凋亡過程受到嚴(yán)格的調(diào)控，兩者的動(dòng)態(tài)失衡是腫瘤難以有效控制的關(guān)鍵，而對(duì)于口腔癌細(xì)胞，控制增殖及凋亡亦是關(guān)鍵點(diǎn)〔8，9〕。本研究發(fā)現(xiàn)，靶向SBF2 siRNA對(duì)SCC15細(xì)胞活性的抑制作用呈時(shí)間依賴性，也表明SBF2在SCC15細(xì)胞的增殖過程中發(fā)揮重要作用。與Long等〔4〕的研究一致，靶向干擾SBF2表達(dá)可抑制胰腺癌細(xì)胞PANC-1的增殖，提示該基因可能參與了惡性腫瘤細(xì)胞的增殖調(diào)控過程，推測(cè)可能原因?yàn)镾BF2可影響與腫瘤增殖相關(guān)受體的活性及表達(dá)，如表皮生長因子受體等〔6〕。Long等〔4〕亦發(fā)現(xiàn)SBF2干擾后PANC-1細(xì)胞的凋亡率亦升高，提示該基因同樣也參與了對(duì)凋亡通路的調(diào)節(jié)過程，下一步將重點(diǎn)研究沉默該基因?qū)χ匾蛲鐾返挠绊憽ong等〔4〕指出SBF2干擾可通過抑制TGF-β通路的活性，本研究推測(cè)SBF2有可能通過作用TGF-β通路來發(fā)揮對(duì)SCC15細(xì)胞增殖及凋亡的影響。

鑒于復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移至頸部淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處器官是口腔癌治療失敗的主要原因〔10，11〕，故抑制其復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有重要臨床意義，因此本研究探索干擾SBF2表達(dá)對(duì)SCC15細(xì)胞侵襲的影響。本文結(jié)果提示靶向轉(zhuǎn)染SBF2可能成為預(yù)防口腔癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的新靶點(diǎn)，更表明SBF2對(duì)癌細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)換的影響是多個(gè)方面的。

1 Siegel RL，Miller KD，Jemal A.Cancer statistics，2016〔J〕.CA Cancer J Clin，2016；66(1)：7-30.

2 翟 越，趙海豐.黃芩素對(duì) SCC15口腔癌細(xì)胞增殖和 Caspase-3活性的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2015；35(1)：139-41.

3 Wu C，Kraft P，Stolzenberg-Solomon R，etal.Genome-wide association study of survival in patients with pancreatic adenocarcinoma〔J〕.Gut，2014；63(1)：152-60.

4 Long J，Liu Z，Wu X，etal.siRNA-mediated SBF2 silencing may inhibit pancreatic cancer cells via attenuation of the TGF-β signaling pathway〔J〕.Technol Cancer Res Treat，2016；15(2)：308-13.

5 Senderek J，Bergmann C，Weber S，etal.Mutation of the SBF2 gene，encoding a novel member of the myotubular in family，in Charcot-Marie-Tooth neuropathy type 4B2/11p15〔J〕.Hum Mol Genet，2003；12(3)：349-56.

6 Berger P，Tersar K，Ballmer-Hofer K，etal.The CMT4B disease-causing proteins MTMR2 and MTMR13/SBF2 regulate AKT signaling〔J〕.J Cell Mol Med，2011；15(2)：307-15.

7 Tersar K，Boentert M，Berger P，etal.Mtmr13/Sbf2-deficient mice：an animal model for CMT4B2〔J〕.Hum Mol Genet，2007；16(24)：2991-3001.

8 萬英明.重組人乳鐵蛋白對(duì)口腔癌Tca8113細(xì)胞周期及周期調(diào)控因子cyclinD1、p19和 p27基因表達(dá)的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2015；35(5)：1323-4，1325.

9 強(qiáng) 璐，柴楣才.PPAR-γ對(duì)口腔癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響及其機(jī)制〔J〕.山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012；43(11)：817-21.

10 陳國棟，卿安蓉.近距離腔內(nèi)照射聯(lián)合外照射治療控制口腔癌術(shù)后復(fù)發(fā)的臨床效果評(píng)價(jià)〔J〕.醫(yī)學(xué)綜述，2015；21(6)：1144-5，1150.

11 李莎莎，周 旋，張瀏陽，等.口腔舌癌與口底癌患者預(yù)后的比較研究〔J〕.天津醫(yī)藥，2013；41(6)：523-6.

〔2015-10-19修回〕

(編輯 徐 杰)

張素欣(1974-)，女，副主任醫(yī)師，博士，主要從事口腔癌的綜合治療研究。

李天客(1983-)，男，主治醫(yī)師，碩士，主要從事口腔癌的綜合治療研究。

R73

A

1005-9202(2016)21-5260-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.21.020