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        H2松弛素對(duì)慢性阻塞性肺疾病大鼠支氣管平滑肌增殖的抑制作用

        2016-12-06 03:35:12潘炯偉
        中國(guó)老年學(xué)雜志 2016年21期
        關(guān)鍵詞:平滑肌肺泡阻塞性

        李 露 曹 卓 潘炯偉 王 潔

        (麗水市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科,浙江 麗水 321400)

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        H2松弛素對(duì)慢性阻塞性肺疾病大鼠支氣管平滑肌增殖的抑制作用

        李 露 曹 卓 潘炯偉 王 潔

        (麗水市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科,浙江 麗水 321400)

        目的 探討H2松弛素對(duì)慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠支氣管平滑肌增殖的抑制作用。方法 觀察正常對(duì)照組、COPD模型組及松弛素治療組大鼠肺組織的病理變化,比較各組大鼠支氣管壁及平滑肌厚度,檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-1、MMP-9、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)-1 表達(dá)水平及MMP-1/TIMP-1、MMP-9/TIMP-1比值。結(jié)果 與正常對(duì)照組大鼠相比,COPD模型組大鼠肺支氣管壁及平滑肌厚度顯著增厚,且松弛素治療組大鼠肺支氣管壁厚度及平滑肌厚度與COPD模型組大鼠相比顯著降低(P<0.05)。COPD模型組大鼠組織中MMP-1、MMP-9、TIMP-1的表達(dá)水平均高于正常對(duì)照組(P<0.05),且MMP-1/TIMP-1、MMP-9/TIMP-1比值與正常對(duì)照組相比,呈現(xiàn)明顯升高趨勢(shì)(P<0.05);而對(duì)比COPD模型組大鼠,松弛素治療組大鼠組織中MMP-1、MMP-9、TIMP-1的表達(dá)有所降低(P<0.05),且MMP-1/TIMP-1、MMP-9/TIMP-1比值與COPD模型組相比均降低(P<0.05)。結(jié)論 松弛素能抑制大鼠肺組織結(jié)構(gòu)病理變化,抑制COPD氣道平滑肌的增殖。

        松弛素;慢性阻塞性肺疾病(COPD);基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP);基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)-1

        慢性阻塞性肺疾病(COPD)的致病因素很多,其發(fā)病機(jī)制尚不明確〔1〕。國(guó)外研究〔2〕證實(shí),當(dāng)小鼠缺乏H2松弛素時(shí),會(huì)表現(xiàn)出肺部變性,質(zhì)量增加,生成大量膠原及纖維,肺泡產(chǎn)生病理改變,出現(xiàn)充血,可伴有水腫,同時(shí)支氣管上皮細(xì)胞出現(xiàn)增厚等病理變化,出現(xiàn)類似衰老的表現(xiàn),因此補(bǔ)充H2松弛素可使得上述病理變化出現(xiàn)逆轉(zhuǎn),且發(fā)現(xiàn)這一病理變化過(guò)程極有可能通過(guò)影響了肺及平滑肌中基質(zhì)金屬蛋白酶 (MMP)-1、MMP-9及MMP組織抑制劑(TIMP)-1的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)采用脂多糖(LPS)滴注大鼠氣道,聯(lián)合被動(dòng)吸煙法制備COPD的大鼠模型〔3〕,探討H2松弛素對(duì)COPD模型中大鼠的支氣管平滑肌增殖的抑制作用。

        1 材料與方法

        1.1 動(dòng)物分組及模型建立 選取鼠齡12 w、體質(zhì)量(200±20)g的 Wistar大鼠30只,隨機(jī)分為正常對(duì)照組、COPD模型組和松弛素治療組。COPD模型組和松弛素治療組分別于造模的第1以及第15天,向大鼠的氣道內(nèi)滴注一定量的LPS,濃度為200 μg/200 μl,正常對(duì)照組不作任何處理。造模第2天將COPD模型組和松弛素治療組大鼠放入有機(jī)玻璃熏箱內(nèi),每次吸煙10支,大約2 h,每天吸煙2次(上、下午各一次),每周吸煙6 d,共吸煙20 w。松弛素治療組在造模開(kāi)始第30天開(kāi)始每天皮下注射松弛素(0.25 mg·kg-1·d-1)15 d,正常對(duì)照組采用生理鹽水注射15 d。檢測(cè)模型制定成功的標(biāo)準(zhǔn):隨機(jī)選取COPD造模組大鼠,切取肺組織做病理分析,觀察其肺部組織是否出現(xiàn)類似COPD的病理變化。大鼠肺部的外周氣道、主支氣管及細(xì)支氣管以及血管壁均出現(xiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn),氣道損傷;鏡下可見(jiàn)黏液腺肥大增生,杯狀細(xì)胞增多;平滑肌以及肺小動(dòng)脈平滑肌均出現(xiàn)增生,膠原沉積進(jìn)而出現(xiàn)氣道腔縮小狹窄,導(dǎo)致氣道出現(xiàn)阻塞;出現(xiàn)細(xì)支氣管呼吸相擴(kuò)張、受損,肺泡因壓力導(dǎo)致增大,形成不規(guī)則的肺大泡。

        1.2 收集標(biāo)本 采用濃度(50 mg/kg)戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠后斷頭處死,取材部位為:心、右下肺葉,所有組織儲(chǔ)存于液氮罐中。向左側(cè)主支氣管注入4%多聚甲醛,致使大鼠出現(xiàn)輕度肺膨脹,按照0.5 cm厚度切取左側(cè)中下肺葉,浸泡于4%多聚甲醛液中固定24 h,采用石蠟垂直包埋,垂直于支氣管及細(xì)支氣管橫斷面、矢狀位切片。HE染色行病理學(xué)觀察。同時(shí)測(cè)量各組大鼠支氣管壁及平滑肌的厚度。

        1.3 檢測(cè)大鼠組織中MMP-1、MMP-9、TIMP-1的表達(dá) 采用免疫組織化學(xué)過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連結(jié)法(SP)測(cè)定。鏡下結(jié)果采用圖像分析系統(tǒng)統(tǒng)計(jì),隨機(jī)挑選鏡下6個(gè)畫面,當(dāng)細(xì)胞質(zhì)及胞膜出現(xiàn)棕褐色顆粒則計(jì)為陽(yáng)性表達(dá),采用平均吸光度值測(cè)定表達(dá)強(qiáng)度,吸光度值越高提示所測(cè)指標(biāo)含量越高。試劑盒采用美國(guó)Zymed公司SP試劑盒。

        1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差及LSD-t檢驗(yàn)。

        2 結(jié) 果

        2.1 各組大鼠肺-支氣管的病理學(xué)變化 正常對(duì)照組大鼠鏡下可見(jiàn)肺結(jié)構(gòu)大體正常,肺小葉結(jié)構(gòu)組織無(wú)明顯異常,支氣管未見(jiàn)明顯異常;COPD模型組大鼠細(xì)支氣管纖毛部分出現(xiàn)滑落,粘連,倒伏,黏液腺較正常大鼠增大,杯狀細(xì)胞及嗜酸性細(xì)胞浸潤(rùn)增多,管壁明顯增厚,管腔狹窄,伴有大量中性粒細(xì)胞、漿細(xì)胞及淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn),上皮細(xì)胞膨脹出現(xiàn)變形、細(xì)胞壞死傾向,肺泡間隔較正常肺泡變薄、部分出現(xiàn)斷裂,肺泡腔增大,甚至出現(xiàn)融合,松弛素治療組大鼠肺部組織也出現(xiàn)上述病理變化,但程度較COPD模型組大鼠病理改變減輕。

        2.2 各組大鼠肺支氣管壁及平滑肌厚度比較 與正常對(duì)照組大鼠相比,COPD模型組大鼠肺支氣管壁及平滑肌厚度顯著增厚,且松弛素治療組大鼠肺支氣管壁厚度及平滑肌厚度與COPD模型組大鼠相比顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

        2.3 各組大鼠組織中MMP-1、MMP-9、TIMP-1的表達(dá)水平 COPD模型組大鼠組織中MMP-1、MMP-9、TIMP-1三者的表達(dá)水平均高于正常對(duì)照組(P<0.05),且MMP-1/TIMP-1、MMP-9/TIMP-1的比值與正常對(duì)照組相比,呈現(xiàn)明顯升高趨勢(shì)(P<0.05);而對(duì)比COPD模型組大鼠,松弛素治療組大鼠組織中MMP-1、MMP-9、TIMP-1的表達(dá)有所降低(P<0.05),且MMP-1/TIMP-1、MMP-9/TIMP-1的比值與COPD模型組相比均降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

        表1 各組肺支氣管壁及平滑肌厚度、肺組織MMP-1、MMP-9、TIMP-1 表達(dá)水平比較±s,n=10)

        與正常對(duì)照組比較:1)P<0.05;與COPD模型組比較:2)P<0.05

        3 討 論

        MMPs是一組降解肺組織細(xì)胞外基質(zhì)的最主要的酶系,可降解肺泡壁中全部細(xì)胞外基質(zhì)成分,激活其他不同類型的MMPs等作用。TIMPs為一種內(nèi)源性抑制劑,可抑制MMPs的活化〔6〕。TIMPs可由上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等產(chǎn)生,是MMPs的內(nèi)源性抑制劑,具備生長(zhǎng)因子樣作用,可促使成纖維細(xì)胞增生,使細(xì)胞外基質(zhì)沉積并抑制其降解。TIMPs與MMPs兩者以共價(jià)鍵形式形成復(fù)合體,進(jìn)而阻止MMPs與相應(yīng)底物結(jié)合,而TIMPs與MMPs這種結(jié)合具有不可逆性〔7〕。MMPs/TIMPs的比例改變是導(dǎo)致COPD氣道重塑的主要機(jī)制之一,而當(dāng)COPD發(fā)生時(shí),肺組織結(jié)構(gòu)改變,如支氣管壁增厚,平滑肌增厚,從而導(dǎo)致功能下降,氣道發(fā)生不可逆改變,通氣功能下降,病理發(fā)現(xiàn),支氣管壁以及平滑肌中出現(xiàn)大量炎癥細(xì)胞,嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn),原有結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,膠原沉積,纖維化改變等,以上均是導(dǎo)致支氣管功能下降的主要因素。

        Comer等〔8〕研究顯示,在對(duì)比健康者和肺氣腫患者肺泡巨噬細(xì)胞中mRNA水平和蛋白酶的活性后發(fā)現(xiàn),吸煙者肺部間質(zhì)中膠原酶和巨噬細(xì)胞的明膠酶B表達(dá)增多,肺氣腫患者肺泡巨噬細(xì)胞的活性顯著增高。Segura-Valdez等〔7〕發(fā)現(xiàn)在肺氣腫患者肺組織中MMP-1高表達(dá),MMP-9的表達(dá)在吸煙相關(guān)的肺氣腫中也呈現(xiàn)明顯增高,Raulo等〔9〕發(fā)現(xiàn)COPD表現(xiàn)的馬的支氣管肺泡灌洗液中MMP-9的表達(dá)水平明顯高于健康馬,且與炎癥細(xì)胞呈正相關(guān)。TIMP-1廣泛存在于人體組織及血液中,具有較高的結(jié)合力,可與所有的MMPs家族成員形成復(fù)合物,從而抑制MMP-9的活性,進(jìn)而導(dǎo)致蛋白水解酶活性喪失。TIMP-1的表達(dá)是否異常關(guān)系到肺部組織結(jié)構(gòu)重塑〔10〕,研究發(fā)現(xiàn)TIMPs還具促細(xì)胞因子樣作用,促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)沉積并抑制降解,其過(guò)程與氣道修復(fù)、重塑相近。松弛素屬于胰島素類生長(zhǎng)激素家族的蛋白激素,其結(jié)構(gòu)和胰島素相似,分子大小約6 kD,含有A和B兩個(gè)肽鏈,由二硫鍵連接組成〔4〕。研究發(fā)現(xiàn),松弛素與其受體結(jié)合時(shí),可致使其受體發(fā)生構(gòu)象的改變,導(dǎo)致松弛素受體被激活,此激活途徑,進(jìn)一步引起受體內(nèi)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路出現(xiàn)激活〔5〕。目前發(fā)現(xiàn)的松弛素基因,分別為H1、H2和H3,而H2主要存在于其組織及血液循環(huán)系統(tǒng)中。當(dāng)松弛素與其受體結(jié)合時(shí),血管內(nèi)皮MMPs的活性可相應(yīng)增強(qiáng)。

        本研究提示COPD模型復(fù)制成功,大鼠出現(xiàn)肺部組織結(jié)構(gòu)破壞,支氣管壁及平滑肌厚度顯著增加,且修復(fù)重構(gòu)也同時(shí)進(jìn)行,此結(jié)果與目前研究認(rèn)為MMPs和TIMPs的動(dòng)態(tài)平衡與氣道及肺組織破壞與修復(fù)同時(shí)存在相一致的理論〔11〕。而MMPs和TIMPs表達(dá)是否平衡是導(dǎo)致大鼠肺部各組織結(jié)構(gòu)正常與否及維持細(xì)胞外基質(zhì)正常的基礎(chǔ)條件之一,兩者失衡會(huì)出現(xiàn)病理變化。MMPs/TIMPs比值增加提示組織破壞加劇,下降則提示組織纖維化氣道重塑。

        國(guó)外研究〔12〕證實(shí)松弛素缺失的小鼠會(huì)出現(xiàn)與衰老相關(guān)的膠原含量增加、肺組織質(zhì)量增加、肺泡充血和細(xì)支氣管壁增厚,平滑肌增厚功能下降,而通過(guò)H2松弛素的治療可以使過(guò)多的膠原沉積得到逆轉(zhuǎn)。本實(shí)驗(yàn)提示H2松弛素可能是通過(guò)抑制COPD氣道平滑肌的增殖,延緩COPD的進(jìn)展,進(jìn)而起到一定程度的治療作用。

        1 中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)慢性阻塞性肺疾病學(xué)組.慢性阻塞性肺疾病診治指南(2013年修訂版) 〔J〕.中華結(jié)核和呼吸雜志,2013;36(4):255-64.

        2 McGowan BM,Minnion JS,Murphy KG,etal.Central and peripheral administration of human relaxin-2 to adult male rats inhibits food intake 〔J〕.Diabetes Obes Metab,2010;12(12):1090-6.

        3 許三林,湯光宗,錢敏玉,等.實(shí)驗(yàn)性吸煙小鼠氣道上皮細(xì)胞凋亡與慢性阻塞性肺疾病發(fā)生機(jī)制的研究〔J〕.中華結(jié)核和呼吸雜志,2003;3(3):169-73.

        4 Teerlink JR,Cotter G,Davison BA,etal.Serelaxin,recombinant human relaxin-2,for treatment of acute heart failure (RELAX-AHF):a randomised,placebo-controlled trial〔J〕.Lancet.2013;381(9860):29-39.

        5 韓曙光,呂蓓麗,丁曉婧,等.H2型松弛素對(duì)慢性支氣管哮喘小鼠氣道重塑與肺組織組織周期蛋白D1表達(dá)的影響〔J〕.中華結(jié)核和呼吸雜志,2012;35(5):349-54.

        6 趙 華,趙 瑾,許西琳.COPD大鼠模型氣道MMP-9和TIMP-1表達(dá)的研究〔J〕.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2010;12(10):2244-6.

        7 Segura-Valdez L,Pardo A,Gaxiola M,etal.Up-regulation of gelatinases A and B,collagenases 1 and 2,and increased parenchymal cell death in COPD〔J〕.Chest,2000;117(3):684-94.

        8 Comer D,Kidney J,Ennis M,etal.Airway epithelial cell apoptosis and inflammation in COPD,smokers and non-smokers〔J〕.Eur Respir J,2012;9(9):1342-7.

        9 Raulo SM,Sorsa T,Tervahartiala T,etal.MMP-9 as a marker of inflammation in tracheal epithelial lining fluid (TELF) and in bronchoalveolar fluid (BALF)of COPD horses〔J〕.Equine Vet J,2001;33(2):128-36.

        10 Tanaka H,Miyazaki N,Oashi K,etal.Sputum matrix metalloproteinase-9:tissue inhibitor of metalloproteinase-1 ratio in acute asthma〔J〕.J Allergy Clin Immunol,2000;105(5):900-5.

        11 Mercer PF,Shute JK,Bhowmik A,etal.MMP-9,TIMP-1 and inflammatory cells in sputum from COPD patients during exacerbation〔J〕.Respir Res,2005;6(1):151.

        12 Lee JH,Lee DS,Kim EK,etal.Simvastatin inhibits cigarette smoking induced emphysema and pulmonary hypertension in rat lungs〔J〕.Am J Respir Crit Care Med,2005;172(8):987-93.

        〔2015-07-19修回〕

        (編輯 趙慧玲/曹夢(mèng)園)

        李 露(1987-),女,住院醫(yī)師,主要從事肺部感染、肺癌研究。

        R56

        A

        1005-9202(2016)21-5251-03;

        10.3969/j.issn.1005-9202.2016.21.016

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