李 露 曹 卓 潘炯偉 王 潔

(麗水市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，浙江 麗水 321400)

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H2松弛素對(duì)慢性阻塞性肺疾病大鼠支氣管平滑肌增殖的抑制作用

李 露 曹 卓 潘炯偉 王 潔

(麗水市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，浙江 麗水 321400)

目的 探討H2松弛素對(duì)慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠支氣管平滑肌增殖的抑制作用。方法 觀察正常對(duì)照組、COPD模型組及松弛素治療組大鼠肺組織的病理變化，比較各組大鼠支氣管壁及平滑肌厚度，檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-1、MMP-9、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)-1 表達(dá)水平及MMP-1/TIMP-1、MMP-9/TIMP-1比值。結(jié)果 與正常對(duì)照組大鼠相比，COPD模型組大鼠肺支氣管壁及平滑肌厚度顯著增厚，且松弛素治療組大鼠肺支氣管壁厚度及平滑肌厚度與COPD模型組大鼠相比顯著降低(P<0.05)。COPD模型組大鼠組織中MMP-1、MMP-9、TIMP-1的表達(dá)水平均高于正常對(duì)照組(P<0.05)，且MMP-1/TIMP-1、MMP-9/TIMP-1比值與正常對(duì)照組相比，呈現(xiàn)明顯升高趨勢(shì)(P<0.05)；而對(duì)比COPD模型組大鼠，松弛素治療組大鼠組織中MMP-1、MMP-9、TIMP-1的表達(dá)有所降低(P<0.05)，且MMP-1/TIMP-1、MMP-9/TIMP-1比值與COPD模型組相比均降低(P<0.05)。結(jié)論 松弛素能抑制大鼠肺組織結(jié)構(gòu)病理變化，抑制COPD氣道平滑肌的增殖。

松弛素；慢性阻塞性肺疾病(COPD)；基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)；基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)-1

慢性阻塞性肺疾病(COPD)的致病因素很多，其發(fā)病機(jī)制尚不明確〔1〕。國(guó)外研究〔2〕證實(shí)，當(dāng)小鼠缺乏H2松弛素時(shí)，會(huì)表現(xiàn)出肺部變性，質(zhì)量增加，生成大量膠原及纖維，肺泡產(chǎn)生病理改變，出現(xiàn)充血，可伴有水腫，同時(shí)支氣管上皮細(xì)胞出現(xiàn)增厚等病理變化，出現(xiàn)類似衰老的表現(xiàn)，因此補(bǔ)充H2松弛素可使得上述病理變化出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)，且發(fā)現(xiàn)這一病理變化過(guò)程極有可能通過(guò)影響了肺及平滑肌中基質(zhì)金屬蛋白酶 (MMP)-1、MMP-9及MMP組織抑制劑(TIMP)-1的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)采用脂多糖(LPS)滴注大鼠氣道，聯(lián)合被動(dòng)吸煙法制備COPD的大鼠模型〔3〕，探討H2松弛素對(duì)COPD模型中大鼠的支氣管平滑肌增殖的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組及模型建立 選取鼠齡12 w、體質(zhì)量(200±20)g的 Wistar大鼠30只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、COPD模型組和松弛素治療組。COPD模型組和松弛素治療組分別于造模的第1以及第15天，向大鼠的氣道內(nèi)滴注一定量的LPS，濃度為200 μg/200 μl，正常對(duì)照組不作任何處理。造模第2天將COPD模型組和松弛素治療組大鼠放入有機(jī)玻璃熏箱內(nèi)，每次吸煙10支，大約2 h，每天吸煙2次(上、下午各一次)，每周吸煙6 d，共吸煙20 w。松弛素治療組在造模開(kāi)始第30天開(kāi)始每天皮下注射松弛素(0.25 mg·kg-1·d-1)15 d，正常對(duì)照組采用生理鹽水注射15 d。檢測(cè)模型制定成功的標(biāo)準(zhǔn)：隨機(jī)選取COPD造模組大鼠，切取肺組織做病理分析，觀察其肺部組織是否出現(xiàn)類似COPD的病理變化。大鼠肺部的外周氣道、主支氣管及細(xì)支氣管以及血管壁均出現(xiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，氣道損傷；鏡下可見(jiàn)黏液腺肥大增生，杯狀細(xì)胞增多；平滑肌以及肺小動(dòng)脈平滑肌均出現(xiàn)增生，膠原沉積進(jìn)而出現(xiàn)氣道腔縮小狹窄，導(dǎo)致氣道出現(xiàn)阻塞；出現(xiàn)細(xì)支氣管呼吸相擴(kuò)張、受損，肺泡因壓力導(dǎo)致增大，形成不規(guī)則的肺大泡。

1.2 收集標(biāo)本 采用濃度(50 mg/kg)戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠后斷頭處死，取材部位為：心、右下肺葉，所有組織儲(chǔ)存于液氮罐中。向左側(cè)主支氣管注入4%多聚甲醛，致使大鼠出現(xiàn)輕度肺膨脹，按照0.5 cm厚度切取左側(cè)中下肺葉，浸泡于4%多聚甲醛液中固定24 h，采用石蠟垂直包埋，垂直于支氣管及細(xì)支氣管橫斷面、矢狀位切片。HE染色行病理學(xué)觀察。同時(shí)測(cè)量各組大鼠支氣管壁及平滑肌的厚度。

1.3 檢測(cè)大鼠組織中MMP-1、MMP-9、TIMP-1的表達(dá) 采用免疫組織化學(xué)過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連結(jié)法(SP)測(cè)定。鏡下結(jié)果采用圖像分析系統(tǒng)統(tǒng)計(jì)，隨機(jī)挑選鏡下6個(gè)畫面，當(dāng)細(xì)胞質(zhì)及胞膜出現(xiàn)棕褐色顆粒則計(jì)為陽(yáng)性表達(dá)，采用平均吸光度值測(cè)定表達(dá)強(qiáng)度，吸光度值越高提示所測(cè)指標(biāo)含量越高。試劑盒采用美國(guó)Zymed公司SP試劑盒。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差及LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠肺-支氣管的病理學(xué)變化 正常對(duì)照組大鼠鏡下可見(jiàn)肺結(jié)構(gòu)大體正常，肺小葉結(jié)構(gòu)組織無(wú)明顯異常，支氣管未見(jiàn)明顯異常；COPD模型組大鼠細(xì)支氣管纖毛部分出現(xiàn)滑落，粘連，倒伏，黏液腺較正常大鼠增大，杯狀細(xì)胞及嗜酸性細(xì)胞浸潤(rùn)增多，管壁明顯增厚，管腔狹窄，伴有大量中性粒細(xì)胞、漿細(xì)胞及淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)，上皮細(xì)胞膨脹出現(xiàn)變形、細(xì)胞壞死傾向，肺泡間隔較正常肺泡變薄、部分出現(xiàn)斷裂，肺泡腔增大，甚至出現(xiàn)融合，松弛素治療組大鼠肺部組織也出現(xiàn)上述病理變化，但程度較COPD模型組大鼠病理改變減輕。

2.2 各組大鼠肺支氣管壁及平滑肌厚度比較 與正常對(duì)照組大鼠相比，COPD模型組大鼠肺支氣管壁及平滑肌厚度顯著增厚，且松弛素治療組大鼠肺支氣管壁厚度及平滑肌厚度與COPD模型組大鼠相比顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.3 各組大鼠組織中MMP-1、MMP-9、TIMP-1的表達(dá)水平 COPD模型組大鼠組織中MMP-1、MMP-9、TIMP-1三者的表達(dá)水平均高于正常對(duì)照組(P<0.05)，且MMP-1/TIMP-1、MMP-9/TIMP-1的比值與正常對(duì)照組相比，呈現(xiàn)明顯升高趨勢(shì)(P<0.05)；而對(duì)比COPD模型組大鼠，松弛素治療組大鼠組織中MMP-1、MMP-9、TIMP-1的表達(dá)有所降低(P<0.05)，且MMP-1/TIMP-1、MMP-9/TIMP-1的比值與COPD模型組相比均降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組肺支氣管壁及平滑肌厚度、肺組織MMP-1、MMP-9、TIMP-1 表達(dá)水平比較±s,n=10)

與正常對(duì)照組比較：1)P<0.05；與COPD模型組比較：2)P<0.05

3 討 論

MMPs是一組降解肺組織細(xì)胞外基質(zhì)的最主要的酶系，可降解肺泡壁中全部細(xì)胞外基質(zhì)成分，激活其他不同類型的MMPs等作用。TIMPs為一種內(nèi)源性抑制劑，可抑制MMPs的活化〔6〕。TIMPs可由上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等產(chǎn)生，是MMPs的內(nèi)源性抑制劑，具備生長(zhǎng)因子樣作用，可促使成纖維細(xì)胞增生，使細(xì)胞外基質(zhì)沉積并抑制其降解。TIMPs與MMPs兩者以共價(jià)鍵形式形成復(fù)合體，進(jìn)而阻止MMPs與相應(yīng)底物結(jié)合，而TIMPs與MMPs這種結(jié)合具有不可逆性〔7〕。MMPs/TIMPs的比例改變是導(dǎo)致COPD氣道重塑的主要機(jī)制之一，而當(dāng)COPD發(fā)生時(shí)，肺組織結(jié)構(gòu)改變，如支氣管壁增厚，平滑肌增厚，從而導(dǎo)致功能下降，氣道發(fā)生不可逆改變，通氣功能下降，病理發(fā)現(xiàn)，支氣管壁以及平滑肌中出現(xiàn)大量炎癥細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，原有結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，膠原沉積，纖維化改變等，以上均是導(dǎo)致支氣管功能下降的主要因素。

Comer等〔8〕研究顯示，在對(duì)比健康者和肺氣腫患者肺泡巨噬細(xì)胞中mRNA水平和蛋白酶的活性后發(fā)現(xiàn)，吸煙者肺部間質(zhì)中膠原酶和巨噬細(xì)胞的明膠酶B表達(dá)增多，肺氣腫患者肺泡巨噬細(xì)胞的活性顯著增高。Segura-Valdez等〔7〕發(fā)現(xiàn)在肺氣腫患者肺組織中MMP-1高表達(dá)，MMP-9的表達(dá)在吸煙相關(guān)的肺氣腫中也呈現(xiàn)明顯增高，Raulo等〔9〕發(fā)現(xiàn)COPD表現(xiàn)的馬的支氣管肺泡灌洗液中MMP-9的表達(dá)水平明顯高于健康馬，且與炎癥細(xì)胞呈正相關(guān)。TIMP-1廣泛存在于人體組織及血液中，具有較高的結(jié)合力，可與所有的MMPs家族成員形成復(fù)合物，從而抑制MMP-9的活性，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白水解酶活性喪失。TIMP-1的表達(dá)是否異常關(guān)系到肺部組織結(jié)構(gòu)重塑〔10〕，研究發(fā)現(xiàn)TIMPs還具促細(xì)胞因子樣作用，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)沉積并抑制降解，其過(guò)程與氣道修復(fù)、重塑相近。松弛素屬于胰島素類生長(zhǎng)激素家族的蛋白激素，其結(jié)構(gòu)和胰島素相似，分子大小約6 kD，含有A和B兩個(gè)肽鏈，由二硫鍵連接組成〔4〕。研究發(fā)現(xiàn)，松弛素與其受體結(jié)合時(shí)，可致使其受體發(fā)生構(gòu)象的改變，導(dǎo)致松弛素受體被激活，此激活途徑，進(jìn)一步引起受體內(nèi)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路出現(xiàn)激活〔5〕。目前發(fā)現(xiàn)的松弛素基因，分別為H1、H2和H3，而H2主要存在于其組織及血液循環(huán)系統(tǒng)中。當(dāng)松弛素與其受體結(jié)合時(shí)，血管內(nèi)皮MMPs的活性可相應(yīng)增強(qiáng)。

本研究提示COPD模型復(fù)制成功，大鼠出現(xiàn)肺部組織結(jié)構(gòu)破壞，支氣管壁及平滑肌厚度顯著增加，且修復(fù)重構(gòu)也同時(shí)進(jìn)行，此結(jié)果與目前研究認(rèn)為MMPs和TIMPs的動(dòng)態(tài)平衡與氣道及肺組織破壞與修復(fù)同時(shí)存在相一致的理論〔11〕。而MMPs和TIMPs表達(dá)是否平衡是導(dǎo)致大鼠肺部各組織結(jié)構(gòu)正常與否及維持細(xì)胞外基質(zhì)正常的基礎(chǔ)條件之一，兩者失衡會(huì)出現(xiàn)病理變化。MMPs/TIMPs比值增加提示組織破壞加劇，下降則提示組織纖維化氣道重塑。

國(guó)外研究〔12〕證實(shí)松弛素缺失的小鼠會(huì)出現(xiàn)與衰老相關(guān)的膠原含量增加、肺組織質(zhì)量增加、肺泡充血和細(xì)支氣管壁增厚，平滑肌增厚功能下降，而通過(guò)H2松弛素的治療可以使過(guò)多的膠原沉積得到逆轉(zhuǎn)。本實(shí)驗(yàn)提示H2松弛素可能是通過(guò)抑制COPD氣道平滑肌的增殖，延緩COPD的進(jìn)展，進(jìn)而起到一定程度的治療作用。

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〔2015-07-19修回〕

(編輯 趙慧玲/曹夢(mèng)園)

李 露(1987-)，女，住院醫(yī)師，主要從事肺部感染、肺癌研究。

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A

1005-9202(2016)21-5251-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.21.016