曾凡軍 周媛媛 熊曉琦 阮玉姝 趙必君 萬曉蓉

(三峽大學第一臨床醫(yī)學院 宜昌市中心人民醫(yī)院，湖北 宜昌 443000)

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PI3K-AKT-mTOR信號通路在大鼠肺性腦病模型神經(jīng)元自噬中的作用

曾凡軍 周媛媛 熊曉琦 阮玉姝 趙必君 萬曉蓉

(三峽大學第一臨床醫(yī)學院 宜昌市中心人民醫(yī)院，湖北 宜昌 443000)

目的 探討PI3K-AKT-mTOR信號通路在肺性腦病神經(jīng)元自噬中的作用。方法 對36只新生健康SD大鼠乳鼠建立離體培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元，隨機分為空白對照組、肺性腦病組、自噬抑制劑3-MA組后進一步建立了大鼠肺性腦病細胞模型，借助該模型運用CCK8法檢測神經(jīng)元活力、MDC染色觀察神經(jīng)元自噬泡數(shù)量、Western印跡法檢測自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin-1及PI3K蛋白表達。結(jié)果 與空白對照組比較，肺性腦病組神經(jīng)元活力降低 (P<0.05)；神經(jīng)元自噬泡數(shù)量增多；LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值、Beclin-1及磷酸化PI3K表達水平增加(P<0.05)。使用自噬抑制劑3-MA預處理后，神經(jīng)元活力降低更明顯、自噬泡數(shù)量明顯減少；缺氧誘導的自噬水平明顯受到抑制，LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值、 Beclin-1及磷酸化PI3K表達水平明顯降低。結(jié)論 缺氧和二氧化碳潴留的信號使Beclin-1表達增加、LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化增加，加速PI3K磷酸化，使PI3K-AKT-mTOR信號通路失活，從而激活自噬信號通路，導致大腦神經(jīng)元自噬增強。

肺性腦病；神經(jīng)元自噬；PI3K-AKT-mTOR信號通路

肺性腦病是因呼吸衰竭導致低氧血癥和高碳酸血癥而出現(xiàn)神經(jīng)精神癥狀的一種臨床綜合征，是慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者嚴重的并發(fā)癥，病死率極高。大腦神經(jīng)元自噬可能是其發(fā)病機制之一，PI3K-AKT-mTOR信號通路參與神經(jīng)元自噬。本文探討神經(jīng)元自噬與肺性腦病之間的相關(guān)性。

1 動物和方法

1.1 動物及分組 三峽大學醫(yī)學院實驗動物中心提供36只新生24 h內(nèi)健康SD大鼠乳鼠。首先進行皮層神經(jīng)元的培養(yǎng)及鑒定；培養(yǎng)5 d后進行缺氧實驗改良。隨機分為空白對照組、肺性腦病組、自噬抑制劑3-MA組。肺性腦病組神經(jīng)元造模后取培養(yǎng)液上清，采用全自動生化分析儀器進行血氣分析。

1.2 方法

1.2.1 乳鼠皮層神經(jīng)元的培養(yǎng) 用75%酒精棉球擦拭乳鼠皮膚滅菌兩次，每次2 min，無菌環(huán)境下開顱分離雙側(cè)皮層，置預冷PBS 液中洗滌三遍去除血液，然后轉(zhuǎn)入安培瓶中，眼科剪剪碎。用含2%B27的Neurobasal培養(yǎng)基培養(yǎng)，之后每2天全量換液1次，取培養(yǎng)5 d的皮層神經(jīng)元用于實驗。

1.2.2 乳鼠皮層神經(jīng)元純度鑒定 細胞種板培養(yǎng)后第5天， 4%多聚甲醛進行預處理，MAP-2抗體標記皮層神經(jīng)元胞質(zhì)蛋白，Hochest33258進行細胞核染色?？勾銣鐒┓馄?，激光共聚焦顯微鏡下采集圖片。參照文獻進行大鼠皮層神經(jīng)元純度鑒定〔1〕。

1.2.3 CCK8法檢測神經(jīng)元活力 皮層神經(jīng)元種植于96孔板，每組設(shè)6個復孔，施加處理因素后，于培養(yǎng)結(jié)束的最后4 h每孔加入20 μl CCK8溶液，每孔內(nèi)總體積為200 μl，37℃繼續(xù)孵育6 h。酶標儀測定吸光度值。細胞存活率= (干預孔OD值-正常對照組OD 值均值)×100%。

1.2.4 MDC染色 棄去6孔板內(nèi)的Neurobasal/B27培養(yǎng)基，PBS洗滌細胞兩次，加入2 ml含MDC的Neurobasal/B27(MDC終濃度為100 μmol/L)，置37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 h，棄培養(yǎng)基，PBS洗滌3次后每孔加入1 ml PBS，熒光顯微鏡下攝片。

1.2.5 Western印跡檢測自噬相關(guān)蛋白 使用自噬抑制劑3-MA預處理神經(jīng)元，然后缺氧4 h，檢測LC3-Ⅱ/Ⅰ,Beclin-1及PI3K在各組神經(jīng)元中的表達水平。對培養(yǎng)神經(jīng)元不同時間段曝光圖片，選取合適圖片。Image-ProPlus 6.0軟件分析結(jié)果，目的條帶與GAPDH 條帶灰度比值為蛋白質(zhì)相對含量。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗、單因素方差分析LSD法。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠皮層神經(jīng)元鑒定 大鼠皮層神經(jīng)元種植培養(yǎng)2 d后，神經(jīng)元胞體變大，呈梭形，突起進一步增多、延伸 (圖1A)；培養(yǎng)5 d后，神經(jīng)元胞體圓潤豐滿，光暈明顯，突起相互交聯(lián)，形成神經(jīng)網(wǎng)絡，突起細長多為2～4個 (圖1B)。激光共聚焦顯微鏡下，MAP-2/Cy3紅色熒光標記的神經(jīng)元占總細胞數(shù)的90%以上，胞體和突起均被染色，胞體圓滿，突觸生長良好。

(A)瑞士-吉姆薩染色,倒置顯微鏡下圖像；(B)MAP-2/Hochest33258染色，激光共聚焦顯微鏡下圖像：經(jīng)免疫熒光法染色后神經(jīng)元胞體和突起呈紅色，細胞核呈藍色，箭頭示神經(jīng)元圖1 培養(yǎng)5 d的大鼠皮層神經(jīng)元

2.2 肺性腦病組神經(jīng)元培養(yǎng)液血氣分析結(jié)果 培養(yǎng)液氧分壓為(10±2)mmHg，二氧化碳分壓為(70±20)mmHg，pH為(7.10±2.34)，與臨床肺性腦病患者血氣分析結(jié)果基本一致，表明肺性腦病造模成功。

2.3 三組神經(jīng)元活力比較 與空白對照組比較，肺性腦病組神經(jīng)元活力降低〔(85±10)% vs (98±8)%，P<0.05〕；與肺性腦病組比較，3-MA組神經(jīng)元活力降低〔(21±69)%,P<0.05〕，提示缺氧及二氧化碳潴留可誘導神經(jīng)元死亡；使用自噬抑制劑后，神經(jīng)元死亡率增加，提示自噬是一種保護性反應。

2.4 三組神經(jīng)元自噬泡MDC染色比較 與空白對照組比較，肺性腦病組神經(jīng)元自噬泡數(shù)量增多(P<0.05)。使用自噬抑制劑3-MA預處理后，自噬泡數(shù)量明顯減少(P<0.05)，說明缺氧誘導的自噬水平明顯受到抑制。見圖2。

圖2 三組神經(jīng)元MDC染色圖像和自噬泡數(shù)量(10 μm)

2.5 三組神經(jīng)元LC3、Beclin-1及PI3K蛋白表達比較 肺性腦病組中，Beclin-1及磷酸化PI3K表達水平及LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值增加(P<0.05)。使用自噬抑制劑3-MA預處理后，缺氧誘導的自噬水平明顯受到抑制，LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值及 Beclin-1及磷酸化PI3K表達水平明顯降低。見圖3。

1～3:空白對照組、肺性腦病組、3-MA預處理組圖3 Western印跡檢測三組神經(jīng)元LC3、Beclin-1及PI3K蛋白表達

3 討 論

目前較為普遍的觀點認為自噬通常促進細胞存活，可保護細胞在長時間的饑餓或者其他刺激狀況下存活〔2〕。缺氧及二氧化碳潴留可誘導神經(jīng)元死亡，神經(jīng)元活力降低；使用自噬抑制劑后，神經(jīng)元死亡率增加，提示自噬是一種保護性反應。

MDC是一種綠色熒光染料，常用于自噬泡的示蹤劑，在熒光顯微鏡下可從形態(tài)學直觀觀察活細胞內(nèi)自噬的變化〔3〕。本研究采用MDC染色發(fā)現(xiàn)：肺性腦病組神經(jīng)元自噬泡數(shù)量增多，使用自噬抑制劑3-MA預處理后，缺氧及二氧化碳潴留誘導的神經(jīng)元自噬水平明顯受到抑制。LC3蛋白有兩種存在形式，即LC3-I和LC3-Ⅱ〔4〕。自噬過程中，LC3-I與腦磷酯結(jié)合形成LC3-Ⅱ。LC3-Ⅱ/LC3-I比值與細胞自噬水平呈正比〔5〕。本研究表明神經(jīng)元模擬肺性腦病條件下，神經(jīng)元自噬增強，可以延緩或阻止神經(jīng)元死亡。使用特異性自噬抑制劑后，神經(jīng)元自噬減弱。Aita等〔6〕于1999年成功克隆了Beclin-1。Arsov等〔7〕發(fā)現(xiàn)Beclin-1廣泛表達于各組織的細胞質(zhì)中。Beclin-1基因是介導其他自噬蛋白定位于前自噬小體的關(guān)鍵基因，參與哺乳動物自噬體形成的調(diào)控〔8〕。Beclin-1表達增強可作為評價自噬水平升高的重要指標。同時Beclin-1是酵母Atg6的同源體，表達于反面高爾基網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),與Ⅲ型PI3K和Atgl4L結(jié)合形成復合體,調(diào)控自噬前體產(chǎn)生和自噬體形成〔8〕。本研究發(fā)現(xiàn)，肺性腦病神經(jīng)元模型中，Beclin-1表達升高，使用3-MA后，Beclin-1表達降低。PI3K磷酸化Ptdlns4P和Rdlns(4,5)PZ，生成PtdIns(3,4)PZ和PtdIns(3,4)兩種蛋白。這兩種蛋白結(jié)合AKT/PKB、PDK1，抑制自噬的發(fā)生，是自噬的負調(diào)節(jié)分子，PI3K為mTOR路徑的一部分〔2〕。PI3K-AKT-mTOR信號通路通過協(xié)調(diào)其下游蛋白的磷酸化，調(diào)節(jié)蛋白的合成、細胞周期的進展、細胞的代謝以及轉(zhuǎn)錄因子，從而控制細胞的生長、增殖、凋亡和自噬〔9〕。本研究發(fā)現(xiàn)在缺氧及高二氧化碳情況下，自噬發(fā)生依賴于PI3K磷酸化程度。

1 Gong Z,Yang LJ,Tang HM,etal.Protective effects of curcumin against human immunodeficiency virus 1 gp120 V3 loop-induced neuronal injury in rats〔J〕.Neural Regene Res,2012；7(3):171-5.

2 Yonekawa T,Thorburn A.Autophagy and cell death〔J〕.Essays Biochem,2013；55(1):105-17.

3 Balduini W,Carloni S,Buonocore G.Autophagy in hypoxia-ischemia induced brain injury〔J〕.J Matern Fetal Neonatal Med,2012；25(Suppl 1)：30-4.

4 Kabeya Y,Mizushima N,Ueno T,etal.LC3,a mammalian homologue of yeast Apg8p,is localized in autophagosome membranes after processing〔J〕.EMBO J,2000；19(21):5720-8.

5 Karim MR,Kanazawa T,Daigaku Y,etal.Cytosolic LC3 ratio as a sensitive index of macroautophagy in isolated rat hepatocytes and H4-II-E cells〔J〕.Autophagy,2007；3(6):553-60.

6 Aita VM,Liang XH,Murty VV,etal.Cloning and genomic organization of beclin 1,a candidate tumor suppressor gene on chromosome 17q21〔J〕.Genomics,1999；59(1):59-65.

7 Arsov I,Li X,Matthews G,etal.BAC-mediated transgenic expression of fluorescent autophagic protein Beclin 1 reveals a role for Beclin 1 in lymphocyte development〔J〕.Cell Death Differ,2008；15(9):1385-95.

8 Pattingre S,Espert L,Biard-Piechaczyk M,etal.Regulation of macroautophagy by mTOR and Beclin 1 complexes〔J〕.Biochimie,2008；90(2):313-23.

9 Shaw RJ,Cantley LC.Ras,PI (3) K and mTOR, signalling controls tumour cell growth〔J〕.Nature,2006；441(7092):424-30.

〔2015-06-23修回〕

(編輯 曹夢園)

曾凡軍(1968-)，男，主任醫(yī)師，碩士生導師，主要從事呼吸系統(tǒng)疾病研究。

R747.9

A

1005-9202(2016)21-5247-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.21.014