王英南 陳 康 葛曉春 韓桂艷 高英杰

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科,河北 承德 067000)

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miR-200b通過靶向調(diào)控Ets-1對白介素-1β誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

王英南 陳 康1葛曉春 韓桂艷 高英杰

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科,河北 承德 067000)

目的 探討miR-200b靶向Ets-1對白介素(IL)-1β誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。結(jié)果 體外培養(yǎng)大鼠胰島β細(xì)胞株RINm5F，采用IL-1β誘導(dǎo)RINm5F細(xì)胞損傷，將RIN-m5F細(xì)胞分為對照組、損傷組(0.5 ng/ml IL-1β)、空轉(zhuǎn)染組(0.5 ng/ml IL-1β+空載體)和過表達(dá)組(0.5 ng/ml IL-1β轉(zhuǎn)染+miR-200b mimics)，采用qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染48 h各組的miR-200b和Ets-1 mRNA水平，采用MTT法、FITC-AnnexinV/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)及酶聯(lián)免疫吸附法檢測各組轉(zhuǎn)染12、24、48及72 h的細(xì)胞存活率、凋亡率及胰島素水平，檢測各組細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)水平、總抗氧化能力(T-AOC)及超氧化物歧化酶(SOD)活性。結(jié)果 與對照組相比，損傷組、空轉(zhuǎn)染組的miR-200b水平降低，Ets-1 mRNA水平升高，但過表達(dá)組的miR-200b水平升高，Ets-1 mRNA水平降低(P<0.05)。損傷組、空轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染后的存活率、上清液胰島素水平及GSH-Px、T-AOC和SOD活性低于對照組，MDA水平和凋亡率高于對照組(P<0.05)；過表達(dá)組的以上指標(biāo)均優(yōu)于對照組(P<0.05)，但與對照組均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。結(jié)論 上調(diào)miR-200b水平對IL-1β誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞損傷有保護(hù)作用，主要表現(xiàn)在提高細(xì)胞存活、促進(jìn)胰島素分泌及改善氧化應(yīng)激，可能與其靶向作用Ets-1有關(guān)。

miR-200b；Ets-1；胰島β細(xì)胞損傷

目前臨床上常用的口服降糖藥長期使用會產(chǎn)生抗性，很難從根本上解決胰島β細(xì)胞功能障礙和胰島素抵抗的問題〔1〕。胰島β細(xì)胞功能障礙是1型和2型糖尿病的共同特征，而加強(qiáng)對β細(xì)胞的保護(hù)是提高糖尿病治療效果的關(guān)鍵。轉(zhuǎn)錄因子Ets-1屬于Ets家族，該家族成員都具有能與DNA結(jié)合的Ets結(jié)構(gòu)域，特異性識別結(jié)合嘌呤豐富的DNA靶心序列GGAA/T〔2〕。新近研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子Ets-1在糖尿病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用〔3〕，如高糖刺激可引起胰島β細(xì)胞內(nèi)的Ets-1表達(dá)量升高，干擾Ets-1可部分恢復(fù)高糖誘導(dǎo)GSIS功能障礙和胰島素含量降低。miR-200b可通過靶向Ets-1發(fā)揮對血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成反應(yīng)〔4〕。本研究旨在研究miR-200b靶向Ets-1對胰島β細(xì)胞損傷是否有保護(hù)作用，并上調(diào)miR-200b水平觀察對白介素(IL)-1β?lián)p傷胰島β細(xì)胞存活、凋亡及氧化應(yīng)激的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 大鼠胰島素瘤細(xì)胞系RINm5F購自ATCC公司，胎牛血清及RPMI1640培養(yǎng)基均購自美國Hyclone公司，LipofectamineTM 2000購自美國Invitrogen公司，miR-200b mimics購自美國Applied Biosystems公司，四甲基偶氮唑鹽(MTT)購自美國sigma公司，F(xiàn)ITC-AnnexinV/PI凋亡檢測試劑購自美國Pharmingen公司，SYBR?Green Realtime PCR Master Mix購自Toyobo公司，谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、總抗氧化能力(T-AOC)及超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)檢測試劑盒購自南京建成生物工程公司。主要儀器：FACScan流式細(xì)胞儀購自美國Becton Dickinson公司，二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱購自日本 SANYO公司，Model 550型酶標(biāo)儀購自 Bio-Rad公司，Prism 7000型定量PCR儀購自美國ABI公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇凍存的RINm5F細(xì)胞，置于含10%胎牛血清、10 mmol/L HEPES，2 mmol/L L-谷氨酰銨、1 mmol/L丙酮酸鈉、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長到70%～80%融合時消化傳代。

1.3 分組及轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期RINm5F細(xì)胞，采用0.5 ng/ml IL-1β誘導(dǎo)RINm5F細(xì)胞損傷，將RINm5F細(xì)胞分為對照組、損傷組(0.5 ng/ml IL-1β)、空轉(zhuǎn)染組(0.5 ng/ml IL-1β+空載體)和過表達(dá)組(0.5 ng/ml IL-1β轉(zhuǎn)染+miR-200b mimics)。對照組不作任何處理，空轉(zhuǎn)染組和過表達(dá)組分別于給予IL-1β處理后按照Lipofectamine 2000說明書分別轉(zhuǎn)染空載體或miR-200b mimics。

1.4 qRT-PCR檢測 分別于轉(zhuǎn)染48 h后參照試劑盒說明書檢測各組RINm5F細(xì)胞的miR-200b和Ets-1水平。使用Premier Primer5設(shè)計軟件參照文獻(xiàn)設(shè)計miR-200b和Ets-1的引物序列?？傓D(zhuǎn)錄體系為20 μl：cDNA模板2.0 μl(1∶10稀釋)、上下游引物各4 pmol和10 μl 1×SYBR?Green Realtime PCR Master Mix，ddH2O補(bǔ)齊。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 1 min，接著進(jìn)行40個循環(huán)的擴(kuò)增(95℃ 15 s，60℃ 15 s，和72℃ 45 s)。采用Ct值法(2-△△CT)表示miR-200b和Ets-1的相對表達(dá)量。

1.5 MTT法檢測各組的細(xì)胞活力 根據(jù)分組按每孔100 μl接種于96孔板中，以上每孔均設(shè)置4個平行復(fù)孔，分別于轉(zhuǎn)染12、24、48和72 h后向每孔加入5 g/L的MTT 溶液20 μl，37℃孵育4 h后吸棄培養(yǎng)液，每孔加入150 μl DMSO，震蕩10 min使結(jié)晶物充分溶解，采用酶標(biāo)儀在490 nm波長處測定各孔的光密度(OD)值，以對照組為參考，計算其余各組A值與對照組的比值以此計為存活率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 凋亡率檢測 于相應(yīng)處理后12、24、48和72 h后收集細(xì)胞1×106個，經(jīng)PBS沖洗及Binding Buffer懸浮后使其濃度為1×106/ml，加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI，避光反應(yīng)15 min后上流式細(xì)胞儀測定檢測細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 胰島素水平及氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)檢測 收集轉(zhuǎn)染48 h后的各組細(xì)胞及培養(yǎng)上清液，采用試劑盒檢測各組細(xì)胞GSH-Px、T-AOC和SOD活性及MDA水平，檢測細(xì)胞上清液中的胰島素水平，以上操作完全依據(jù)試劑盒說明書完成。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS16.0軟件，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用Bonfferoni檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 各組轉(zhuǎn)染后的miR-200b水平比較 以對照組的miR-200b水平為參照(1.00)，損傷組、空轉(zhuǎn)染組的miR-200b水平依次為(0.31±0.07)、(0.29±0.09)，均低于對照組(P<0.05)；過表達(dá)組的miR-200b水平為(4.79±0.52)，高于對照組(P<0.05)。

2.2 各組轉(zhuǎn)染后的Ets-1 mRNA水平比較 以對照組的Ets-1水平為參照(1.00)，損傷組、空轉(zhuǎn)染組的Ets-1 mRNA水平依次為(2.92±0.38)、(3.14±0.44)，均高于對照組(P<0.05)；過表達(dá)組的Ets-1 mRNA水平為(0.25±0.06)，低于對照組(P<0.05)。

2.3 各組RINm5F細(xì)胞的存活率比較 以對照組為參照(100%)，損傷組、空轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染12、24、48及72 h的存活率均降低(P<0.05)；過表達(dá)組以上時間點(diǎn)的存活率均高于損傷組、空轉(zhuǎn)染組，但仍低于對照組(P<0.05)。損傷組和空轉(zhuǎn)染組以上時間點(diǎn)細(xì)胞存活率的無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組RINm5F細(xì)胞存活率比較

與對照組比較：1)P<0.05；與損傷組比較：2)P<0.05；與空轉(zhuǎn)染組比較：3)P<0.05；下表同

2.4 各組RINm5F細(xì)胞凋亡率比較 損傷組、空轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染12、24、48及72 h的凋亡率均高于對照組(P<0.05)；過表達(dá)組以上時間點(diǎn)的凋亡率均低于損傷組、空轉(zhuǎn)染組，但仍高于對照組(P<0.05)。損傷組和空轉(zhuǎn)染組以上時間點(diǎn)細(xì)胞凋亡率無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見表2。

表2 各組RINm5F細(xì)胞凋亡率比較

2.5 各組RINm5F細(xì)胞上清液胰島素水平比較 損傷組、空轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染12、24、48及72 h上清液胰島素水平均低于對照組(P<0.05)；過表達(dá)組以上時間點(diǎn)的上清液胰島素水平均高于損傷組、空轉(zhuǎn)染組，但仍低于對照組(P<0.05)。損傷組和空轉(zhuǎn)染組以上時間點(diǎn)上清液胰島素水平無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見表3。

2.6 各組RIN-m5F細(xì)胞氧化應(yīng)激水平比較 與對照組相比，損傷組、空轉(zhuǎn)染組的GSH-Px、T-AOC和SOD活性降低，MDA水平升高(P<0.05)；過表達(dá)組的GSH-Px、T-AOC和SOD活性高于損傷組、空轉(zhuǎn)染組，MDA水平低于損傷組、空轉(zhuǎn)染組，但與對照組的仍有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。損傷組和空轉(zhuǎn)染組以上指標(biāo)無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見表4。

表3 各組RINm5F細(xì)胞上清液胰島素水平比較

表4 各組RINm5F細(xì)胞氧化應(yīng)激水平比較±s,n=3)

3 討 論

英國前瞻性糖尿病研究(UKPDS)中描畫的β細(xì)胞功能曲線顯示：β細(xì)胞功能隨著糖尿病診斷年限的延長而進(jìn)行性下降，在剛確診時β細(xì)胞還殘存大約60%，而隨后無論采用何種治療都無法避免β細(xì)胞功能進(jìn)行性下降。因而從β細(xì)胞保護(hù)角度看，需要尋找更合適的治療方法。

目前發(fā)現(xiàn)miR-200是一簇微RNA(miRNA)家族，其家族成員包括miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141及miR-429〔8〕。以上miRNA定位在基因組中的2個不同位點(diǎn)，其中miR-200a、miR-200b和miR-429聚集在染色體1p36，而miR-200c和miR-141定位在染色體12p13上。miR-200家族在物種間高度保守，共同調(diào)節(jié)某些細(xì)胞外刺激，如轉(zhuǎn)化生長因子-β1和血小板衍生生長因子(PDGF)〔6，7〕。本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)IL-1β處理后的RIN-m5F細(xì)胞出現(xiàn)了存活率降低、凋亡率升高及胰島素分泌功能受抑制等表現(xiàn)，表明采用IL-1β誘導(dǎo)β細(xì)胞功能障礙對的模型建立成功，與相關(guān)報道的結(jié)果一致〔8〕。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)RIN-m5F細(xì)胞經(jīng)IL-1β處理后miR-200b水平降低，且其靶基因Ets-1水平升高，提示miR-200b及其靶基因在β細(xì)胞損傷過程中發(fā)揮了作用。轉(zhuǎn)錄因子Ets-1在糖尿病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用〔12〕，如干擾Ets-1表達(dá)可改善糖尿病小鼠胰島的葡萄糖刺激的胰島素分泌功能，且Ets-1自身也可以結(jié)合在胰島素基因的啟動子上，從而直接下調(diào)胰島素的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。

本研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-200b后β細(xì)胞的存活率升高，凋亡率降低，表明過表達(dá)miR-200b對IL-1β誘導(dǎo)的β細(xì)胞損傷有較好的逆轉(zhuǎn)效果。此外，過表達(dá)miR-200b后β細(xì)胞的胰島素分泌上升，提示miR-200b對改善β細(xì)胞功能損傷有一定效果，盡管觀察終點(diǎn)時以上指標(biāo)未達(dá)到對照組水平，但改善趨勢較為明顯，可能與miR-200b mimics不能持續(xù)提高miR-200b水平有關(guān)，氧化應(yīng)激是導(dǎo)致β細(xì)胞損傷的常見因素，也是損傷的主要表現(xiàn)之一〔10，11〕。本研究進(jìn)一步觀察結(jié)果提示miR-200b對β細(xì)胞損傷伴有的氧化應(yīng)激有較好的改善效果。

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〔2015-12-21修回〕

(編輯 徐 杰)

承德市科技支撐計劃項(xiàng)目(No.20151049)

陳 康(1981-)，男，主治醫(yī)師，主要從事內(nèi)分泌疾病研究。

王英南(1979-)，女，主治醫(yī)師，主要從事內(nèi)分泌疾病研究。

R587.1

A

1005-9202(2016)21-5240-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.21.011

1 解放軍總醫(yī)院內(nèi)分泌科