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        白細(xì)胞介素-10對(duì)大鼠胸主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞遷移的影響

        2016-12-06 03:28:45林有東徐如梅夏小平
        中國(guó)老年學(xué)雜志 2016年21期
        關(guān)鍵詞:介素平滑肌主動(dòng)脈

        江 蕓 林有東 徐如梅 夏小平

        (福建省立醫(yī)院干部特診二科,福建 福州 350001)

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        白細(xì)胞介素-10對(duì)大鼠胸主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞遷移的影響

        江 蕓 林有東1徐如梅1夏小平2

        (福建省立醫(yī)院干部特診二科,福建 福州 350001)

        目的 探討白細(xì)胞介素(IL)-10對(duì)大鼠胸主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)遷移的影響。方法 取3個(gè)月自發(fā)性高血壓大鼠胸主動(dòng)脈細(xì)胞作為大鼠平滑肌原代細(xì)胞,細(xì)胞培養(yǎng)后分為IL-10組、空載體組、未處理組。加入細(xì)胞遷移誘導(dǎo)劑白細(xì)胞介素(IL)-1β。進(jìn)行細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn),Transwell實(shí)驗(yàn),Snail轉(zhuǎn)錄因子mRNA熒光定量PCR,波形蛋白的表達(dá)測(cè)定。結(jié)果 IL-10組與其他兩組相比,細(xì)胞遷移距離、細(xì)胞遷移數(shù)目、Snail轉(zhuǎn)錄因子mRNA的表達(dá)量、波形蛋白的表達(dá)均明顯減少(P<0.05)。結(jié)論 IL-10抑制IL-1β誘導(dǎo)的大鼠胸主動(dòng)脈VSMC遷移。

        白細(xì)胞介素-10;Snail轉(zhuǎn)錄因子;波形蛋白

        在動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病(ASCVD)的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中炎癥反應(yīng)貫穿全程,其中包括炎癥因子的浸潤(rùn)及細(xì)胞遷移等,特別是主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)從血管中膜遷移至內(nèi)膜是引起AS的重要因素之一〔1~3〕。在VSMC遷移過(guò)程中,多種細(xì)胞因子有明顯的誘導(dǎo)遷移作用,如白細(xì)胞介素(IL)-1β等,而IL-10能抑制IL-1β誘導(dǎo)的VSMC遷移信號(hào)通路,從而對(duì)VSMC的遷移起到抑制作用,減輕ASCVD進(jìn)程。因此,在治療ASCVD時(shí),抗炎藥物治療成為可能。

        1 材料與方法

        1.1 主要試劑 常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)用品為美國(guó)HyClone 公司或者杭州四季青公司產(chǎn)品;PCR引物由上海生工合成;RNA提取試劑盒TransZol UP為北京全式金產(chǎn)品;cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒GoScriptTM Reverse Transcription system和熒光定量PCR試劑盒GoTaq?qPCR Master Mix均為Promega 公司生產(chǎn);IL-1β細(xì)胞因子和Western波形蛋白特異性一抗購(gòu)自Santa Cruz公司,Western配套試劑為碧云天產(chǎn)品。

        1.2 動(dòng)物 大鼠VSMC原代細(xì)胞取自3個(gè)月自發(fā)性高血壓大鼠胸主動(dòng)脈。大鼠雄性,SPF級(jí),體質(zhì)量200~250 g,購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司,生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(滬)2012-0002,質(zhì)量合格證號(hào)2015000506388。動(dòng)物使用協(xié)議已由審查委員會(huì)批準(zhǔn),實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

        1.3 主要儀器設(shè)備 Olimpus熒光倒置顯微鏡,Biorad熒光定量PCR儀和Western電泳儀,美國(guó)Molecular Devices公司酶標(biāo)儀,美國(guó)Thermo公司細(xì)胞CO2培養(yǎng)箱,吳江市凈化設(shè)備總廠醫(yī)用超凈工作臺(tái)(YJ-875S/D-B型)。

        1.4 細(xì)胞培養(yǎng)及遷移功能實(shí)驗(yàn) 用含10%胎牛和雙抗的1640培養(yǎng)基置于5%CO2培養(yǎng)箱。(1)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn):細(xì)胞分成慢病毒IL-10轉(zhuǎn)染組(IL-10組)、慢病毒空載體轉(zhuǎn)染組(空載體組)和細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)照組(未處理組),按5×105/孔的細(xì)胞數(shù)接種于六孔板過(guò)夜,第二天劃痕后用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次,再加2%胎牛血清的1640培養(yǎng)基2 ml,同時(shí)加IL-1β細(xì)胞因子(濃度10 ng/ml)作為細(xì)胞遷移的誘導(dǎo)劑,按0 h和48 h觀察細(xì)胞遷移距離并拍照。(2)Transwell實(shí)驗(yàn):先預(yù)處理Transwell小室,即分別用Matrigel包被小室底部膜的上室以及牛血清白蛋白(BSA)水化基底膜,細(xì)胞如前分組,實(shí)驗(yàn)前饑餓培養(yǎng)24 h后胰酶消化細(xì)胞再用含0.2%BSA無(wú)血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞密度至1×105個(gè)/ml。取細(xì)胞懸液200 μl加入Transwell小室,下室加入800 μl完全培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h,取出Transwell小室,PBS清洗3次,用棉簽小心擦去基質(zhì)膠上層細(xì)胞,無(wú)水甲醇固定1 h,0.1%結(jié)晶紫染色2 h,倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)每視野移至基質(zhì)膠下層的細(xì)胞數(shù),每個(gè)樣本計(jì)數(shù)10個(gè)視野。

        1.5 熒光定量PCR 細(xì)胞同上述分組。IL-1β誘導(dǎo)分別培養(yǎng)48 h后提取RNA,PCR按試劑盒說(shuō)明書操作。按Δct計(jì)算方法進(jìn)行相對(duì)定量。

        1.6 Western印跡 細(xì)胞同上述分組。IL-1β誘導(dǎo)培養(yǎng)72 h后提取蛋白和定量后進(jìn)行Western免疫印跡和顯像。

        1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件行單向方差分析。

        2 結(jié) 果

        2.1 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) IL-10組慢病毒感染48 h后細(xì)胞遷移距離(4.10±0.40)cm,明顯小于未處理組(5.03±0.17)cm和空載體組(5.04±0.2)cm(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

        圖1 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果

        2.2 Transwell實(shí)驗(yàn) IL-10組慢病毒感染48 h后基質(zhì)膠下室細(xì)胞數(shù)(47±9)個(gè),較未處理組(80±9)個(gè)和空載體組(77±5)個(gè)明顯減少(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

        圖2 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果

        2.3 Snail轉(zhuǎn)錄因子mRNA熒光定量PCR IL-10過(guò)表達(dá)組感染48 h后Snail轉(zhuǎn)錄因子mRNA的表達(dá)量(Δct=9.6±0.9)明顯小于未處理組(Δct=7.6±0.4)和空載體組(Δct=7.7±0.3)(P<0.05)。

        2.4 波形蛋白Western印跡檢測(cè)結(jié)果 IL-10組慢病毒感染72 h后波形蛋白的表達(dá)(84.93±9.61)明顯低于空載體組(108.10±5.99)和未處理組(112.90±9.28)(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

        3 討 論

        目前ASCVD的發(fā)病學(xué)說(shuō)有血栓形成學(xué)說(shuō),脂質(zhì)浸潤(rùn)學(xué)說(shuō),單克隆學(xué)說(shuō),損傷反應(yīng)學(xué)說(shuō)等,尚不能完全說(shuō)明ASCVD的發(fā)病基礎(chǔ)〔4〕。在ASCVD的發(fā)生、發(fā)展和演變過(guò)程中均有炎癥反應(yīng)參與〔5〕,其中包括炎癥因子的浸潤(rùn)及細(xì)胞遷移等。特別是VSMC從血管中膜遷移至內(nèi)膜是ASCVD進(jìn)展的重要因素之一。

        IL-1β等細(xì)胞因子在VSMC遷移過(guò)程中起重要的誘導(dǎo)作用,可誘導(dǎo)VSMC的遷移。Aguado等〔6〕證實(shí)IL-1β和血管緊張素2的協(xié)同作用具有很強(qiáng)的刺激血管平滑肌細(xì)胞遷移的作用,IL-1β是由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的重要細(xì)胞因子和多肽調(diào)節(jié)因子,在細(xì)胞免疫激活中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。IL-1β是一種促炎癥因子,在AS過(guò)程中,IL-1β表達(dá)增加,誘導(dǎo)VSMC組織蛋白酶S(Cat S)的表達(dá),而Cat S能降解細(xì)胞外基質(zhì),誘導(dǎo)VSMC從血管中膜遷移至內(nèi)膜〔2〕,加速AS進(jìn)程。在大鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)HUR(腺苷酸和鳥(niǎo)苷酸富集元件結(jié)合蛋白)通過(guò)增強(qiáng)炎癥通路中關(guān)鍵分子人細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)1/2的活性導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞遷移造成血管內(nèi)膜的重塑。最近也有學(xué)者報(bào)道IL-1β可能通過(guò)上調(diào)P2Y2受體水平促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的遷移〔7〕。因此本實(shí)驗(yàn)在探討血管平滑肌細(xì)胞的遷移時(shí)亦使用IL-1β作為誘導(dǎo)劑。本文研究發(fā)現(xiàn)IL-1β刺激引起的細(xì)胞遷移及上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過(guò)程中snail轉(zhuǎn)錄因子以及波形蛋白表達(dá)均增加,是細(xì)胞遷移的主要機(jī)制和重要指標(biāo)〔8〕。本研究提示IL-10抑制IL-1β誘導(dǎo)的大鼠胸主動(dòng)脈VSMC遷移??赡艿臋C(jī)制是:IL-10是一種Th1細(xì)胞免疫抑制細(xì)胞因子,已知IL-10在體內(nèi)最重要的來(lái)源是單核巨噬細(xì)胞和T輔助細(xì)胞,在各種介質(zhì)的作用下激活后分泌IL-10。它是一種多細(xì)胞源性炎癥抑制因子,能抑制單核細(xì)胞活性及炎癥細(xì)胞遷移等減輕炎癥反應(yīng)〔9〕。IL-10能誘導(dǎo)核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)的抑制性同源二聚體p50/p50進(jìn)行核轉(zhuǎn)位并與DNA結(jié)合從而減少NF-κB依賴的基因表達(dá)〔10〕,從而減少Cat S的表達(dá),抑制VSMC的遷移,減輕ASCVD進(jìn)程。內(nèi)皮來(lái)源的一氧化氮(NO)是一種重要的血管重構(gòu)調(diào)節(jié)劑。NO可抑制動(dòng)脈粥樣過(guò)程中的多個(gè)環(huán)節(jié),IL-10能促進(jìn)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶基因的合成,NO合成增加,從而抑制VSMC的遷移〔11〕。人尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶1(NOX1)是有絲分裂的氧化酶,IL-10基因敲除的大鼠通過(guò)上調(diào)NOX1來(lái)引起血管重塑(包括細(xì)胞遷移,增殖等)。因此考慮IL-10是通過(guò)抑制NOX1達(dá)到減輕血管重塑,抑制VSMC遷移的作用。

        綜上所述,IL-10明顯抑制大鼠胸主動(dòng)脈VSMC從血管中膜遷移至內(nèi)膜,從而減緩ASCVD進(jìn)程。

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        〔2015-11-19修回〕

        (編輯 袁左鳴)

        福建省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2014J01287)

        林有東(1972-),男,碩士,副主任技師,主要從事腫瘤分子生物學(xué)研究。

        江 蕓(1971-),男,碩士,副主任醫(yī)師,主要從事心血管疾病研究。

        R54

        A

        1005-9202(2016)21-5232-03;

        10.3969/j.issn.1005-9202.2016.21.007

        1 福建省立醫(yī)院檢驗(yàn)科 2 江西省上饒縣人民醫(yī)院

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