江 蕓 林有東 徐如梅 夏小平

(福建省立醫(yī)院干部特診二科，福建 福州 350001)

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白細(xì)胞介素-10對大鼠胸主動脈血管平滑肌細(xì)胞遷移的影響

江 蕓 林有東1徐如梅1夏小平2

(福建省立醫(yī)院干部特診二科，福建 福州 350001)

目的 探討白細(xì)胞介素(IL)-10對大鼠胸主動脈血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)遷移的影響。方法 取3個月自發(fā)性高血壓大鼠胸主動脈細(xì)胞作為大鼠平滑肌原代細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)后分為IL-10組、空載體組、未處理組。加入細(xì)胞遷移誘導(dǎo)劑白細(xì)胞介素(IL)-1β。進(jìn)行細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，Transwell實(shí)驗(yàn)，Snail轉(zhuǎn)錄因子mRNA熒光定量PCR，波形蛋白的表達(dá)測定。結(jié)果 IL-10組與其他兩組相比，細(xì)胞遷移距離、細(xì)胞遷移數(shù)目、Snail轉(zhuǎn)錄因子mRNA的表達(dá)量、波形蛋白的表達(dá)均明顯減少(P<0.05)。結(jié)論 IL-10抑制IL-1β誘導(dǎo)的大鼠胸主動脈VSMC遷移。

白細(xì)胞介素-10；Snail轉(zhuǎn)錄因子；波形蛋白

在動脈粥樣硬化性心血管疾病(ASCVD)的發(fā)生和發(fā)展過程中炎癥反應(yīng)貫穿全程，其中包括炎癥因子的浸潤及細(xì)胞遷移等，特別是主動脈血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)從血管中膜遷移至內(nèi)膜是引起AS的重要因素之一〔1～3〕。在VSMC遷移過程中，多種細(xì)胞因子有明顯的誘導(dǎo)遷移作用，如白細(xì)胞介素(IL)-1β等，而IL-10能抑制IL-1β誘導(dǎo)的VSMC遷移信號通路，從而對VSMC的遷移起到抑制作用，減輕ASCVD進(jìn)程。因此，在治療ASCVD時，抗炎藥物治療成為可能。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)用品為美國HyClone 公司或者杭州四季青公司產(chǎn)品；PCR引物由上海生工合成；RNA提取試劑盒TransZol UP為北京全式金產(chǎn)品；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒GoScriptTM Reverse Transcription system和熒光定量PCR試劑盒GoTaq?qPCR Master Mix均為Promega 公司生產(chǎn)；IL-1β細(xì)胞因子和Western波形蛋白特異性一抗購自Santa Cruz公司，Western配套試劑為碧云天產(chǎn)品。

1.2 動物 大鼠VSMC原代細(xì)胞取自3個月自發(fā)性高血壓大鼠胸主動脈。大鼠雄性，SPF級，體質(zhì)量200～250 g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司，生產(chǎn)許可證號SCXK(滬)2012-0002，質(zhì)量合格證號2015000506388。動物使用協(xié)議已由審查委員會批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)過程中對動物的處置符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 主要儀器設(shè)備 Olimpus熒光倒置顯微鏡，Biorad熒光定量PCR儀和Western電泳儀，美國Molecular Devices公司酶標(biāo)儀，美國Thermo公司細(xì)胞CO2培養(yǎng)箱，吳江市凈化設(shè)備總廠醫(yī)用超凈工作臺(YJ-875S/D-B型)。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)及遷移功能實(shí)驗(yàn) 用含10%胎牛和雙抗的1640培養(yǎng)基置于5%CO2培養(yǎng)箱。(1)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞分成慢病毒IL-10轉(zhuǎn)染組(IL-10組)、慢病毒空載體轉(zhuǎn)染組(空載體組)和細(xì)胞培養(yǎng)對照組(未處理組)，按5×105/孔的細(xì)胞數(shù)接種于六孔板過夜，第二天劃痕后用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，再加2%胎牛血清的1640培養(yǎng)基2 ml，同時加IL-1β細(xì)胞因子(濃度10 ng/ml)作為細(xì)胞遷移的誘導(dǎo)劑，按0 h和48 h觀察細(xì)胞遷移距離并拍照。(2)Transwell實(shí)驗(yàn)：先預(yù)處理Transwell小室，即分別用Matrigel包被小室底部膜的上室以及牛血清白蛋白(BSA)水化基底膜，細(xì)胞如前分組，實(shí)驗(yàn)前饑餓培養(yǎng)24 h后胰酶消化細(xì)胞再用含0.2%BSA無血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞密度至1×105個/ml。取細(xì)胞懸液200 μl加入Transwell小室，下室加入800 μl完全培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，取出Transwell小室，PBS清洗3次，用棉簽小心擦去基質(zhì)膠上層細(xì)胞，無水甲醇固定1 h，0.1%結(jié)晶紫染色2 h，倒置顯微鏡下計數(shù)每視野移至基質(zhì)膠下層的細(xì)胞數(shù)，每個樣本計數(shù)10個視野。

1.5 熒光定量PCR 細(xì)胞同上述分組。IL-1β誘導(dǎo)分別培養(yǎng)48 h后提取RNA，PCR按試劑盒說明書操作。按Δct計算方法進(jìn)行相對定量。

1.6 Western印跡 細(xì)胞同上述分組。IL-1β誘導(dǎo)培養(yǎng)72 h后提取蛋白和定量后進(jìn)行Western免疫印跡和顯像。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件行單向方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) IL-10組慢病毒感染48 h后細(xì)胞遷移距離(4.10±0.40)cm，明顯小于未處理組(5.03±0.17)cm和空載體組(5.04±0.2)cm(P<0.05)。見圖1。

圖1 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 Transwell實(shí)驗(yàn) IL-10組慢病毒感染48 h后基質(zhì)膠下室細(xì)胞數(shù)(47±9)個，較未處理組(80±9)個和空載體組(77±5)個明顯減少(P<0.05)。見圖2。

圖2 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 Snail轉(zhuǎn)錄因子mRNA熒光定量PCR IL-10過表達(dá)組感染48 h后Snail轉(zhuǎn)錄因子mRNA的表達(dá)量(Δct=9.6±0.9)明顯小于未處理組(Δct=7.6±0.4)和空載體組(Δct=7.7±0.3)(P<0.05)。

2.4 波形蛋白Western印跡檢測結(jié)果 IL-10組慢病毒感染72 h后波形蛋白的表達(dá)(84.93±9.61)明顯低于空載體組(108.10±5.99)和未處理組(112.90±9.28)(P<0.05)。見圖3。

3 討 論

目前ASCVD的發(fā)病學(xué)說有血栓形成學(xué)說，脂質(zhì)浸潤學(xué)說，單克隆學(xué)說，損傷反應(yīng)學(xué)說等，尚不能完全說明ASCVD的發(fā)病基礎(chǔ)〔4〕。在ASCVD的發(fā)生、發(fā)展和演變過程中均有炎癥反應(yīng)參與〔5〕，其中包括炎癥因子的浸潤及細(xì)胞遷移等。特別是VSMC從血管中膜遷移至內(nèi)膜是ASCVD進(jìn)展的重要因素之一。

IL-1β等細(xì)胞因子在VSMC遷移過程中起重要的誘導(dǎo)作用，可誘導(dǎo)VSMC的遷移。Aguado等〔6〕證實(shí)IL-1β和血管緊張素2的協(xié)同作用具有很強(qiáng)的刺激血管平滑肌細(xì)胞遷移的作用，IL-1β是由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的重要細(xì)胞因子和多肽調(diào)節(jié)因子，在細(xì)胞免疫激活中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。IL-1β是一種促炎癥因子，在AS過程中，IL-1β表達(dá)增加，誘導(dǎo)VSMC組織蛋白酶S(Cat S)的表達(dá)，而Cat S能降解細(xì)胞外基質(zhì)，誘導(dǎo)VSMC從血管中膜遷移至內(nèi)膜〔2〕，加速AS進(jìn)程。在大鼠動物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)HUR(腺苷酸和鳥苷酸富集元件結(jié)合蛋白)通過增強(qiáng)炎癥通路中關(guān)鍵分子人細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)1/2的活性導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞遷移造成血管內(nèi)膜的重塑。最近也有學(xué)者報道IL-1β可能通過上調(diào)P2Y2受體水平促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的遷移〔7〕。因此本實(shí)驗(yàn)在探討血管平滑肌細(xì)胞的遷移時亦使用IL-1β作為誘導(dǎo)劑。本文研究發(fā)現(xiàn)IL-1β刺激引起的細(xì)胞遷移及上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程中snail轉(zhuǎn)錄因子以及波形蛋白表達(dá)均增加，是細(xì)胞遷移的主要機(jī)制和重要指標(biāo)〔8〕。本研究提示IL-10抑制IL-1β誘導(dǎo)的大鼠胸主動脈VSMC遷移?？赡艿臋C(jī)制是：IL-10是一種Th1細(xì)胞免疫抑制細(xì)胞因子，已知IL-10在體內(nèi)最重要的來源是單核巨噬細(xì)胞和T輔助細(xì)胞，在各種介質(zhì)的作用下激活后分泌IL-10。它是一種多細(xì)胞源性炎癥抑制因子，能抑制單核細(xì)胞活性及炎癥細(xì)胞遷移等減輕炎癥反應(yīng)〔9〕。IL-10能誘導(dǎo)核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)的抑制性同源二聚體p50/p50進(jìn)行核轉(zhuǎn)位并與DNA結(jié)合從而減少NF-κB依賴的基因表達(dá)〔10〕，從而減少Cat S的表達(dá)，抑制VSMC的遷移，減輕ASCVD進(jìn)程。內(nèi)皮來源的一氧化氮(NO)是一種重要的血管重構(gòu)調(diào)節(jié)劑。NO可抑制動脈粥樣過程中的多個環(huán)節(jié)，IL-10能促進(jìn)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶基因的合成，NO合成增加，從而抑制VSMC的遷移〔11〕。人尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶1(NOX1)是有絲分裂的氧化酶，IL-10基因敲除的大鼠通過上調(diào)NOX1來引起血管重塑(包括細(xì)胞遷移，增殖等)。因此考慮IL-10是通過抑制NOX1達(dá)到減輕血管重塑，抑制VSMC遷移的作用。

綜上所述，IL-10明顯抑制大鼠胸主動脈VSMC從血管中膜遷移至內(nèi)膜，從而減緩ASCVD進(jìn)程。

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〔2015-11-19修回〕

(編輯 袁左鳴)

福建省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2014J01287)

林有東(1972-)，男，碩士，副主任技師，主要從事腫瘤分子生物學(xué)研究。

江 蕓(1971-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事心血管疾病研究。

R54

A

1005-9202(2016)21-5232-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.21.007

1 福建省立醫(yī)院檢驗(yàn)科 2 江西省上饒縣人民醫(yī)院