張弘弢 藍(lán)丹純 李知行 許能貴 孫 健 易 瑋

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510405)

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電針對(duì)高脂喂養(yǎng)大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞JNK蛋白的影響

張弘弢 藍(lán)丹純 李知行1許能貴 孫 健2易 瑋

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510405)

目的 觀察電針對(duì)高脂喂養(yǎng)大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞c-Jun氨基末端激酶(JNK)蛋白的影響。方法 將24只雄性SD大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、電針組8只。空白組予普通飼料喂養(yǎng)，模型組與電針組予高脂飼料喂養(yǎng)。造模8 w后，空白組、模型組繼續(xù)如前喂養(yǎng)不進(jìn)行干預(yù)，電針組予針刺雙側(cè)內(nèi)關(guān)、三陰交、足三里及腎俞，雙側(cè)足三里及三陰交加電。干預(yù)4 w后，用葡萄糖氧化酶法、ELISA及Western印跡檢測(cè)并比較各組大鼠空腹胰島素(FINS)、空腹血糖(FPG)、穩(wěn)態(tài)模型評(píng)價(jià)的胰島素抵抗(IR)指數(shù)(HOMA-IR)以及主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞JNK蛋白的表達(dá)及其磷酸化水平。結(jié)果 與模型組比較，電針組FPG、FINS、HOMA-IR均顯著降低(P<0.01)，而與空白組比較差異不顯著(P>0.01)；與模型組相比較，電針組的JNK蛋白表達(dá)及其磷酸化水平顯著降低(P<0.01)，與空白組比較差異不顯著(P>0.01)。結(jié)論 電針治療能調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞JNK蛋白表達(dá)及其磷酸化水平，使其降至正常水平，從而改善IR大鼠的IR狀態(tài)，增強(qiáng)IR大鼠胰島素的敏感性。

電針；胰島素抵抗；JNK蛋白

胰島素抵抗(IR)在眾多心血管疾病的危險(xiǎn)因素中處于重要地位,同時(shí)也在多種代謝異常類疾病的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用〔1〕。而C-jun氨基末端激酶(JNK)是調(diào)節(jié)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要信號(hào)分子〔2〕，在IR形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用。針灸作為我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的一部分，其多水平、雙向調(diào)節(jié)的作用在改善IR方面具有優(yōu)勢(shì)，既往研究也證實(shí)電針能有效改善IR〔3〕。血管內(nèi)皮細(xì)胞是胰島素的重要靶器官，本研究以血管內(nèi)皮細(xì)胞為靶點(diǎn)，通過(guò)觀察大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞空腹血糖(FPG)、空腹胰島素(FINS)以及JNK蛋白及其磷酸化水平的改變，探討并完善電針改善IR狀態(tài)的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及飼料 選用體重120～140 g的6周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)過(guò)程在屏障實(shí)驗(yàn)環(huán)境之中。實(shí)驗(yàn)環(huán)境要求室溫18℃～22℃，相對(duì)濕度40%～85%；光照：12 h明/12 h暗，照度：150～300 Lx，每日手動(dòng)開(kāi)關(guān)。普通飼料配方(質(zhì)量比)：豆粕21%，小麥18%，麩皮10%，玉米31%，魚粉6%，稻谷4%，蛋黃粉3%，預(yù)混料3.5%，黃豆2%，植物油1.5%，多種維生素1%，由實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。高脂飼料配方(質(zhì)量比)：脂肪34.9%，蛋白質(zhì)26.2%，碳水化合物26.3%，由實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供D12492號(hào)飼料。實(shí)驗(yàn)過(guò)程遵循實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物護(hù)理和使用的倫理準(zhǔn)則。

1.2 設(shè)備與試劑 SAPK/JNK抗體購(gòu)買于CST廠家，F(xiàn)INS測(cè)定試劑盒購(gòu)自默科迪亞公司；電針儀選用上海華誼醫(yī)用儀器有限公司生產(chǎn)的G6805-2A型低頻電子脈沖治療儀(YZB/滬0735-26-2009)；一次性無(wú)菌針灸針選用華佗牌，規(guī)格：0.35 mm×13 mm。

1.3 方法

1.3.1 分組與實(shí)驗(yàn)操作 選用SPF級(jí)SD大鼠24只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w，隨機(jī)分為正常組(8只)、高脂組(16只)。兩組分別給予普通飼料，高脂飼料喂養(yǎng)。8 w后，檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物FPG、FINS，計(jì)算IR指數(shù)(HOMA-IR)，以評(píng)測(cè)模型是否成功建立。模型建立成功后，模型組隨機(jī)分為模型組(8只)、電針組(8只)。電針組，取雙側(cè)足三里、三陰交、內(nèi)關(guān)、腎俞，疏密波(密波50 Hz，疏波2 Hz，頻率10次/min)，強(qiáng)度以大鼠后肢輕微抖動(dòng)為度，20 min/次，1次/d，持續(xù)4 w。空白組與模型組采用與電針組相同的按壓固定時(shí)間，其余不做干預(yù)，繼續(xù)如前喂養(yǎng)。

1.3.2 標(biāo)本采集與檢測(cè) 針刺療程治療結(jié)束后，禁食不禁水12 h，于次日晨麻醉后行眼眶靜脈竇采血。FPG用葡萄糖氧化酶法測(cè)定;FINS采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，按說(shuō)明書進(jìn)行操作測(cè)定;脫臼法處死，并從腹主動(dòng)脈灌注多聚甲醛固定，快速取主動(dòng)脈置于-20℃保存，Western印跡方法檢測(cè)SAPK/JNK蛋白表達(dá)及其磷酸化水平。HOMA-IR參照Haffner簡(jiǎn)化Matthews的計(jì)算方法〔4,5〕，即HOMA-IR=ln(FPG×FINS/22.5)。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS19.0軟件，采用單因素方差分析，方差齊用LSD比較，若方差不齊用Tamhane比較。

2 結(jié) 果

2.1 電針對(duì)大鼠IR的影響 與空白組相比，模型組的FPG、FINS、HOMA-IR顯著升高(P<0.01)；而電針治療后，電針組的FPG、FINS、HOMA-IR較模型組顯著降低(P<0.01)。見(jiàn)表1。

2.2 電針對(duì)主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞JNK蛋白的表達(dá)及其磷酸化水平的影響 與空白組比較，模型組的JNK蛋白及其磷酸化水平顯著升高(P<0.01)；治療后，電針組的JNK蛋白及其磷酸化水平較模型組顯著降低(P<0.01)。見(jiàn)表2。見(jiàn)圖1。

表1 各組大鼠FPG、FINS及HOMA-IR的比較

與空白組比較:1)P<0.01，與模型組比較:2)P<0.01；下表同

表2 各組大鼠JNK蛋白及其磷酸化水平比較

圖1 3組主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞JNK及p-JNK蛋白表達(dá)

3 討 論

IR與多種代謝異常類疾病的發(fā)病密切相關(guān)，而JNK蛋白則在IR形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用。胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中，胰島素與靶細(xì)胞表面的胰島素受體結(jié)合，使胰島素受體β亞基酪氨酸激酶發(fā)生磷酸化而被激活，激活后的酪氨酸激酶能磷酸化IRS，進(jìn)而激活磷脂酰肌醇3-激酶活性以調(diào)節(jié)不同的代謝通路〔6〕。IRS是胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中的重要組成部分和關(guān)鍵環(huán)節(jié)。JNK是MAPK超家族中的一員，屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。JNK被激活后，能引起IRS-1第307位絲氨酸磷酸化，使IRS-1對(duì)胰島素信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)起負(fù)向調(diào)節(jié)，減弱機(jī)體組織對(duì)胰島素的敏感性〔7〕。在2型糖尿病患者和糖尿病、非酒精性肝炎等多種代謝異常疾病的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中，均能發(fā)現(xiàn)其組織中的JNK活性明顯升高。而無(wú)論是通過(guò)JNK結(jié)構(gòu)域反義多肽序列抑制JNK蛋白活化、JNK基因敲除，還是RNAi技術(shù)沉默JNK基因的表達(dá)，均能發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型組織胰島素敏感性明顯提高，IR狀態(tài)顯著改善〔8〕。IR在傳統(tǒng)中醫(yī)理論中認(rèn)為其病機(jī)乃 “脾腎兩虛、痰瘀阻絡(luò)”，治療原則為標(biāo)本兼治，治法當(dāng)培補(bǔ)脾腎、祛痰化瘀通絡(luò)。故選取足三里、內(nèi)關(guān)、三陰交、腎俞穴為主穴治療。足三里是足陽(yáng)明胃經(jīng)中五腧穴之合穴且為胃之下合穴，能健脾化痰，補(bǔ)益中氣；內(nèi)關(guān)為手厥陰心包經(jīng)的絡(luò)穴，與三焦經(jīng)相通，能理臟腑之氣機(jī)；三陰交為足厥陰肝、足太陰脾、足少陰腎三條陰經(jīng)的交會(huì)穴，聯(lián)絡(luò)三條經(jīng)絡(luò)之氣血，能調(diào)補(bǔ)肝腎，健脾益氣，疏經(jīng)通絡(luò)。腎俞是足太陽(yáng)膀胱經(jīng)中腎之背俞穴，能補(bǔ)先天之腎氣。且其中足三里、三陰交、內(nèi)關(guān)三穴是靳瑞教授在臨床上治療糖尿病、肥胖等代謝異常疾病有顯著療效的經(jīng)驗(yàn)組穴。諸穴標(biāo)本兼治，共奏“培補(bǔ)脾腎、祛痰化瘀通絡(luò)”之功。

電針改善IR的內(nèi)在機(jī)制可能與其干預(yù)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，針刺胰島素抵抗鼠，其骨骼肌IRS-1、IRS-2的表達(dá)增多，且骨骼肌PI3K-p85α mRNA及其蛋白的表達(dá)被抑制，而PI3K的活性增強(qiáng)；同時(shí)IR鼠骨骼肌中phospho-PKCζ/λ mRNA和Akt2 mRNA的表達(dá)亦有增加，從而改善大鼠骨骼肌的IR狀態(tài)〔9,10〕。亦有研究表明，電針通過(guò)干預(yù)IR大鼠骨骼肌JNK蛋白的表達(dá)，降低JNK的活性，減少胰島素受體底物磷酸化，從而改善IR狀態(tài)〔11〕。近年來(lái)，作為胰島素的重要靶器官之一的血管內(nèi)皮細(xì)胞備受關(guān)注，關(guān)于針刺改善血管內(nèi)皮細(xì)胞IR的研究也日益增多，如陳婧〔12〕通過(guò)針刺自發(fā)性IR模型——OLETF大鼠，觀察血管內(nèi)皮細(xì)胞與IR的變化發(fā)現(xiàn)，針刺干預(yù)下調(diào)了IR模型大鼠TNF-α的表達(dá),同時(shí)抑制MAPK-P38信號(hào)通路的激活,從而進(jìn)一步降低TNF-α的表達(dá),使胰島素受體的活性增強(qiáng),機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性亦有增強(qiáng)。為進(jìn)一步完善其作用機(jī)制，結(jié)合以上研究，考慮電針改善血管內(nèi)皮IR是否與JNK蛋白有關(guān)。 本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明電針能有效改善實(shí)驗(yàn)大鼠IR狀態(tài)，再次驗(yàn)證了既往的研究結(jié)果。高脂飲食喂養(yǎng)大鼠，經(jīng)多種途徑激活了大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞的JNK，使JNK蛋白表達(dá)及其磷酸化水平明顯增加，從而干預(yù)胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路，引起大鼠IR。電針治療能調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞JNK蛋白表達(dá)及其磷酸化水平，使其降至正常水平，從而改善IR大鼠的IR狀態(tài)，增強(qiáng)IR大鼠胰島素的敏感性。

1 陳春紅,傅向華.胰島素抵抗與冠心病的關(guān)系及其機(jī)制的研究進(jìn)展〔J〕.河北職工醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2006;23(2):47.

2 Sharfi H,Eldar-Finkelman H.Sequential phosphorylation of insulin receptor substrate-2 by glycogen synthase kinase-3 and c-Jun NH2-terminal kinase plays a role in hepatic insulin signaling〔J〕.Am J Physiol Endocrinol Metab,2008;294(2):E307-15.

3 王靜芝，王 華，周煥嬌，等.電針對(duì)胰島素抵抗模型大鼠下丘腦IRS-2和Akt2 mRNA表達(dá)的影響〔J〕.中華中醫(yī)藥雜志，2014；10：3243-6.

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7 趙 斌.JNK通過(guò)抑制胰島素信號(hào)通路介導(dǎo)了高糖和軟脂酸誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡〔D〕.上海：上海交通大學(xué),2008.

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9 張 梁,易 瑋.針刺對(duì)胰島素抵抗模型大鼠骨骼肌胰島素受體底物和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4的影響〔J〕.廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2015;(4):699-704.

10 張 梁.針刺對(duì)胰島素抵抗模型大鼠干預(yù)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究〔D〕.廣州：廣州中醫(yī)藥大學(xué),2010.

11 唐思詩(shī),唐念珍,唐成林,等.電針刺激對(duì)胰島素抵抗大鼠骨骼肌ERK及JNK蛋白表達(dá)的影響〔J〕.實(shí)用中醫(yī)藥雜志,2015；30(4):268-70.

12 陳 婧.針剌對(duì)胰島素抵抗模型大鼠血管內(nèi)皮MAPK-P38信號(hào)通路的影響〔D〕.廣州：廣州中醫(yī)藥大學(xué),2015.

〔2016-07-26修回〕

(編輯 曲 莉)

Effect of electroacupuncture on the expression of JNK protein in aorta of rats with high fat induced insulin resistance

ZHANG Hong-Tao,LAN Dan-Chun,LI ZHi-Xing,et al.

Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine,Guangzhou 510405,Guangdong,China

Objective To investigate the effect of electroacupuncture(EA)on the expression of JNK protein in aorta of rats with high fat induced insulin resistance.Methods 24 male SD rats were randomly divided into blank,model and EA groups,with 8 rats in each group.Rats in blank group were fed with normal diet,rats in model and EA groups were fed with high fat diet.After 8 weeks,rats in EA group were applied to bilateral Neiguan(PC6),Zusanli(ST36),Sanyinjiao(SP6)and Shenshu(BL23)for 4 weeks.Needles in Zusanli(ST36),Sanyinjiao(SP6)were connected with EA.At the end of the treatment,glucose oxidase method and ELISA were used to detect the fasting plasma glucose(FPG),fasting serum insulin(FINS)and homeostasis model assessment-insulin resistance(HOMA-IR)was calculated.The expression of JNK protein and the phosphorylation protein were determined by using Western blot.Results Compared with model group,the FPG,FINS and HOMA-IR in the EA group were significantly decreased(P<0.01).After treatment,the FPG,FINS and HOMA-IR in the EA group were significantly lower than those of model group(P<0.01)and the expression of p-JNK/JNK of rats in EA group was significantly decreased than that of model group(P<0.01).Conclusions EA could improve insulin sensitivity of rats with high fat induced insulin resistance,which might be related to regulating the expression of JNK protein and its phosphorylation level.

Electroacupuncture;Insulin resistance;JNK protein

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81273845)

易 瑋(1966-)，女，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事針灸治療代謝性疾病研究。

張弘弢(1992-)，男，在讀碩士，主要從事針灸治病機(jī)制研究。

R245.31+1

A

1005-9202(2016)21-5220-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.21.002

1 深圳市中醫(yī)院 2 廣東省中醫(yī)院