陳 軍 舒 祥 余南才

武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥學(xué)部，湖北 武漢 430022

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藥物研究

山苓祛斑凝膠劑提取物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

陳 軍 舒 祥 余南才

武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥學(xué)部，湖北 武漢 430022

目的：建立山苓祛斑凝膠的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：運(yùn)用HPLC法測(cè)定祛斑凝膠提取物中尿囊素、阿魏酸含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，流動(dòng)相分別為乙腈-0.085%磷酸-水(5∶95)、(17∶83)，流速為0.5mL/min、1mL/min，柱溫30℃，檢測(cè)波長為224nm、316nm。結(jié)果：尿囊素、阿魏酸線性范圍0.368～2.208μg、0.424～2.544μg，精密度RSD0.55%、0.92%，穩(wěn)定性RSD1.4%、1.5%，重復(fù)性RSD0.95%、0.55%。祛斑凝膠劑中尿囊素、阿魏酸含量分別為11.2mg/g、4.5mg/g。結(jié)論：該方法重復(fù)性好，質(zhì)量可控，可為該凝膠制劑進(jìn)行中試、生產(chǎn)提供參考。

山苓祛斑凝膠；含量測(cè)定；高效液相色譜法

黃褐斑也稱“肝斑”、“蝴蝶斑”，為面部黃褐色色素沉著，且多對(duì)稱蝶形分布于頰部，大小不一、形態(tài)不定，好發(fā)于育齡期女性[1]。黃褐斑由多種因素綜合作用導(dǎo)致，其發(fā)病與妊娠、長期口服避孕藥、月經(jīng)紊亂有關(guān)，血中雌激素水平高是主要原因。目前，尚無徹底治愈方法，臨床治療方法有一定的副作用，如造成外源性褐黃病、皮膚萎縮、永久性脫色，甚至出現(xiàn)腎毒性、精神、神經(jīng)癥狀等，因而黃褐斑一直是醫(yī)學(xué)界關(guān)注的問題。中醫(yī)藥治療黃褐斑有著悠久歷史，具有一定優(yōu)勢(shì)。中藥凝膠劑是一種新型外用制劑，適用于皮膚、黏膜及腔道，不僅避免口服給藥存在的胃腸道內(nèi)酶、酸等首過作用，而且可減輕藥物不良反應(yīng)，同時(shí)具有使用方便、舒適、生物相容性好等多種優(yōu)點(diǎn)，臨床上治療黃褐斑已取得較好療效[2-4]。復(fù)方中藥山苓祛斑方為我院中醫(yī)部周利副主任醫(yī)師經(jīng)驗(yàn)方，由山藥、茯苓、白芷、白及、當(dāng)歸等藥組成。研究以尿囊素、阿魏酸含量作為凝膠劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[5-6]，用HPLC法測(cè)定凝膠劑中尿囊素、阿魏酸含量，為其質(zhì)量控制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 DIONEX Ultimate 3000 型高效液相色譜儀(紫外DAD檢測(cè)器，美國DIONEX公司)；CP 2104 電子天平(奧豪斯儀器(上海)有限公司)。

1.2 材料 山藥、茯苓、當(dāng)歸等9味中藥材飲片(亳州國一堂中藥飲片有限公司)，祛斑凝膠劑(批號(hào)：20150401、20150405、20150410，自制)；凝膠劑陰性樣品(自制不含當(dāng)歸及山藥的樣品各一份，批號(hào)20150410)，尿囊素(批號(hào)：111501-200001)、阿魏酸對(duì)照品(批號(hào)：110773-200611)、茯苓(批號(hào)：121117-201302)、當(dāng)歸(批號(hào)：120927-201408)、山藥(批號(hào)：121137-201405)等對(duì)照藥材購于中檢所，乙腈為色譜純，其余試劑為分析純。

2 方法

2.1 祛斑凝膠提取物中尿囊素含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件 ODS C18色譜柱(Thermo-Scientific Syncronis, 250mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.085%磷酸水(5∶95)；流速：0.5mL/min；柱溫：30℃；檢測(cè)波長：224nm；進(jìn)樣量：10μL。

2.1.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取尿囊素對(duì)照品9.2mg，置50mL量瓶中，用超純水稀釋至刻度。

2.1.3 供試品溶液制備 稱取山苓祛斑凝膠提取物3g，加入適量甲醇超聲溶解，加入100-200目硅膠4.5g，蒸干溶劑后進(jìn)行硅膠柱色譜分離。硅膠用量為50g (300～400目)，洗脫劑選擇二氯甲烷∶甲醇(9∶1)，收集200mL，濃縮后用甲醇稀釋至10mL，作為供試品溶液。

2.1.4 陰性對(duì)照溶液制備 按處方量制備除山藥外的所有組分的凝膠劑，作為山藥陰性對(duì)照樣品，余同“2.1.3”操作，即得。

2.1.5 線性關(guān)系考察 分別進(jìn)樣2、4、6、8、10、12μL以尿囊素含量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程y=9.0814x+0.0354，R2=0.9998，表明尿囊素在0.368～2.208μg線性關(guān)系良好。2.1.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液10μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積積分值，結(jié)果表明：精密度良好，平均峰面積為15.5925，RSD為0.55%。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取尿囊素標(biāo)準(zhǔn)品溶液10μL，按0、4h、8h、12h、16h、24h 進(jìn)樣1次，記錄峰面積積分值，結(jié)果表明：尿囊素標(biāo)準(zhǔn)品穩(wěn)定性良好，RSD為1.4%。

2.1.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批凝膠劑6份，按尿囊素供試品制備方法制備供試品溶液，按“2.1.1”色譜條件進(jìn)樣6次，計(jì)算尿囊素平均含量為4.5mg/g，RSD為0.95%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.9 加樣回收率試驗(yàn) 稱取山苓祛斑凝膠提取物1.5g，分別加入尿囊素對(duì)照品溶液15μL，按照供試品溶液制備的方法處理，進(jìn)樣10μL，記錄峰面積積分值，代入回歸方程，計(jì)算尿囊素標(biāo)準(zhǔn)品的加樣回收率為97.2%，RSD為1.2%。

2.1.10 尿囊素含量測(cè)定 精密吸取供試品溶液10μL，液相色譜儀，記錄峰面積積分值，代入回歸方程，計(jì)算得出尿囊素含量為4.5mg/g。

2.2 山苓祛斑凝膠提取物中阿魏酸含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 ODS C18色譜柱(Thermo-Scientific Syncronis, 250mm×4.6 mm，5μm)；流動(dòng)相：乙腈-水(17:83)；流速：1mL/min；柱溫：35℃；檢測(cè)波長：316nm，進(jìn)樣量：10μL。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取阿魏酸對(duì)照品，加甲醇制備成濃度為0.212μg/μL的溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取山苓祛斑凝膠提取物10g，加甲醇超聲，并定容至50mL容量瓶中。

2.2.4 陰性對(duì)照溶液制備 按處方量制備除當(dāng)歸外的所有組分的凝膠劑，作為當(dāng)歸陰性對(duì)照樣品，余同“2.2.3”操作，即得。

2.2.5 線性范圍考察 分別精密吸取阿魏酸對(duì)照品溶液2、4、6、8、10、12μL注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，以峰面積和進(jìn)樣量求得回歸方程y=1.2937x+0.3404,R2=0. 9996，表明在0.424～2.544μg有良好線性關(guān)系。

2.2.6 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液10μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)得峰面積，其RSD為0.92%，表明儀器精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液10μL，按0、4、8、12、16、24h 進(jìn)樣1次，記錄峰面積積分值，結(jié)果表明：阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品穩(wěn)定性良好，RSD為1.5%。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批凝膠劑6份，按阿魏酸供試品制備方法制備供試品溶液，按“2.2.1”色譜條件進(jìn)樣6次，計(jì)算阿魏酸平均含量為11.4mg/g，RSD為0.55%，表明該方法重復(fù)性良好。2.2.9 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密量取兩份1mL樣品溶液：向其中一份精密添加阿魏酸對(duì)照品溶液，定容至50mL，測(cè)得平均回收率為96.8%，RSD為1.56%。

2.2.10 阿魏酸含量測(cè)定 精密吸取供試品溶液10μL，液相色譜儀，記錄峰面積積分值，代入回歸方程，計(jì)算得出阿魏酸含量為11.2mg/g。2.3 山苓祛斑凝膠劑TLC定性鑒別 按2015版《中國藥典》一部及附錄(0502)薄層色譜法對(duì)祛斑凝膠劑中山藥、當(dāng)歸及茯苓進(jìn)行TLC定性鑒別[7]，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材、對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性無干擾。

按文獻(xiàn)[8]對(duì)山苓祛斑凝膠劑中的尿囊素進(jìn)行薄層鑒定：取山苓祛斑凝膠劑10g，加入適量甲醇超聲溶解，溶解后吸取10μL點(diǎn)于硅膠GF254板，以氯仿∶乙酸乙酯∶丙酮∶甲酸∶甲醇(1∶8∶1∶1∶2)為展開劑，15%的對(duì)二甲氨基苯甲醛的硫酸乙醇溶液為顯色劑。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同黃綠色斑點(diǎn)，且陰性樣品無干擾。

3 討論

3.1 波長選擇 經(jīng)紫外光譜掃描，測(cè)得尿囊素在224nm處有最大吸收，阿魏酸在316nm處有最大吸收，故本文分別選擇224nm作為尿囊素的檢測(cè)波長，316nm作為阿魏酸的檢測(cè)波長。

3.2 流動(dòng)相的選擇 原有用甲醇-水(1∶9)測(cè)定尿囊素含量，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其分離效果不好，分離度不能達(dá)到分析要求；甲醇-磷酸二氫鉀緩沖液(2∶98)比例的極性太大，而純水對(duì)色譜柱的損害較大。經(jīng)摸索最后采用乙腈-0.085%磷酸-水(5∶95) 作為流動(dòng)相，基本能夠達(dá)到較好的分離效果，尿囊素出峰時(shí)間大約在5.5min左右。重復(fù)性試驗(yàn)RSD為0.95%，加樣回收試驗(yàn)測(cè)得平均回收率為96.8%，RSD為1.56%也表明在此色譜條件下尿囊素的分離效果較為滿意。

研究通過測(cè)定山苓凝膠劑中尿囊素和阿魏酸的含量，初步確定了山苓凝膠劑的質(zhì)量控制方法。所建立的方法簡單，準(zhǔn)確，分離度與重現(xiàn)性均好，可以用于控制山苓凝膠劑的質(zhì)量。

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(編輯：陶希睿)

Quality Standards Control of the Shanling Quban Gels

CHEN Jun SHU Xiang YU Nancai

Integrative Medicine Hospital of Wuhan City Department of Pharmacy，Wuhan 430022,China

Objective Study on establish quality standards of Shanling Quban gels. Methods The content of allantoin and ferulic acid was used as the index to optimize the extraction process by HPLC analysis. Results Allantoin and ferulic acid showed a good linear relationship in the range of 0.368～2.208μg, 0.424～2.544μg with an average recovery ofRSD1.4%, 1.5%，RepeatabilityRSD0.95%, 0.55%. and precision ofRSD0.55%, 0.92%, respectively．Average extracting amount of allantoin and ferulic acid in the Shanling Quban gels was 11.2mg/g and 4.5mg/g．Conclusion This method is simple and appropriate for quality control of Quban gels and provide a reference for industrial production of this preparation．

Shanling Quban gels；Content determination；HPLC

2016-08-17

陳軍(1975-)，男，漢族，碩士研究生，主管中藥師，研究方向?yàn)橹兴庤b定、中藥藥物分析、中藥炮制。E-mail:10078474@qq.com

R284.1

A

1007-8517(2016)21-0011-03