馮曉冰，陳建國，楊翼鷹，陳景福，甄育蘭

(1高州市第二人民醫(yī)院，廣東高州525200；2廣東省人民醫(yī)院；3中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院；4廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

?

外源性硫化氫對人宮頸癌HeLa細(xì)胞的影響及作用機(jī)制

馮曉冰1，陳建國2，楊翼鷹3，陳景福3，甄育蘭4

(1高州市第二人民醫(yī)院，廣東高州525200；2廣東省人民醫(yī)院；3中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院；4廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

目的 探討外源性硫化氫對人宮頸癌Hela細(xì)胞的影響及其作用機(jī)制。方法 將培養(yǎng)好的人宮頸癌HeLa細(xì)胞隨機(jī)分為6組，正常對照組：正常培養(yǎng)，不作任何處理；NaHS組：加入400 μmol/L的NaHS；NaHS+PDTC組：加入400 μmol/L的NaHS和100 μmol/L的PDTC(NF-κB通路抑制劑)；NaHS+NS-398組：加入400 μmol/L的NaHS和10 μmol/L的NS-398(COX-2通路抑制劑)；PDTC組：加入100 μmol/L的PDTC；NS-398組：加入10 μmol/L的NS-398。各組干預(yù)24 h，用CCK-8法測定細(xì)胞相對存活率，用ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)水平，用Transwell小室實驗檢測細(xì)胞遷移能力，用Western blotting法檢測細(xì)胞內(nèi)Caspase-1、Caspase-12、p-NF-κB p65和COX-2蛋白表達(dá)。結(jié)果 干預(yù)24 h，與正常對照組、NaHS+PDTC組、NaHS+NS-398組比較，NaHS組細(xì)胞相對存活率、培養(yǎng)上清液VEGF水平、細(xì)胞遷移能力及NF-κB p65(除外NaHS+NS-398組)、COX-2蛋白表達(dá)升高，Caspase-1、Caspase-12蛋白表達(dá)降低(P均<0.05)；PDTC組、NS-398組以上指標(biāo)與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。結(jié)論 外源性硫化氫可通過激活NF-κB/COX-2信號傳導(dǎo)通路促進(jìn)人宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖、新生血管形成、細(xì)胞遷移。

宮頸腫瘤；硫化氫；HeLa細(xì)胞；核因子κB；環(huán)氧合酶2

宮頸癌是常見婦科惡性腫瘤之一，對女性健康危害極大，因此對宮頸癌的病因和發(fā)病機(jī)制進(jìn)行研究尤為重要。核因子κB(NF-κB)是人體內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子之一，其在宮頸病變組織中的過表達(dá)可促使該部位從炎癥反應(yīng)向?qū)m頸癌轉(zhuǎn)化[1]。環(huán)氧合酶2(COX-2)在腫瘤病理狀態(tài)下可被誘導(dǎo)表達(dá)，在宮頸癌腫瘤組織中COX-2表達(dá)高于宮頸正常組織[2]。研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB可上調(diào)多種腫瘤組織中的COX-2基因表達(dá)水平，誘導(dǎo)血管生成和促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移[3～5]。然而在宮頸癌的病理過程中，NF-κB通路激活與COX-2表達(dá)是否存在相關(guān)關(guān)系仍未得到證實。硫化氫(H2S)是體內(nèi)重要的氣體信號分子，多項研究證實H2S有助于腫瘤細(xì)胞的生長、增殖、遷移和侵襲[6～9]。研究發(fā)現(xiàn)，外源性H2S可促進(jìn)肝癌細(xì)胞或膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、血管形成、遷移以及抗腫瘤細(xì)胞凋亡[10，11]，但目前外源性H2S對宮頸癌細(xì)胞的影響及機(jī)制仍無相關(guān)報道。2015年5月～2016年5月，本研究觀察外源性H2S對宮頸癌HeLa細(xì)胞的影響，并探討其與NF-κB/COX-2通路的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 人宮頸癌HeLa細(xì)胞株，由中山大學(xué)實驗動物中心細(xì)胞庫提供。細(xì)胞計數(shù)試劑盒8(CCK-8)，購自Dojindo Lab公司；NaHS(H2S的供體)、Hoechst 33258、NF-κB通路抑制劑(PDTC)、COX-2通路抑制劑(NS-398)，購自Sigma-Aldrich公司；RPMI1640培養(yǎng)基、特級胎牛血清(FBS)，購自Gibco BRL?？笴aspase-1抗體、抗Caspase-12抗體、抗COX-2抗體和抗NF-κB p65抗體，購自Cell Signaling technology Inc。ELISA試劑盒，購自R&D公司；Transwell小室，購自Corning公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 HeLa細(xì)胞置于RPMI1640培養(yǎng)基(含10%特級FBS)中培養(yǎng)，并置于5% CO2、37 ℃的恒溫箱中。將細(xì)胞分為6組，正常對照組：正常培養(yǎng)，不作任何處理；NaHS組：加入終濃度為400 μmol/L的NaHS；NaHS+PDTC組：加入終濃度為400 μmol/L的NaHS和終濃度為100 μmol/L的PDTC；NaHS+NS-398組：加入終濃度為400 μmol/L的NaHS和終濃度為10 μmol/L的NS-398；PDTC組：加入終濃度為100 μmol/L的PDTC；NS-398組：加入終濃度為10 μmol/L的NS-398。

1.3 細(xì)胞相對存活率測定 采用CCK-8法。干預(yù)24 h，將細(xì)胞接種于96孔板中，于每孔中加入CCK-8 10 μL和RPMI1640培養(yǎng)基90 μL，輕搖，37 ℃孵育1.5 h，用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處各孔光密度值。取5孔光密度值的平均數(shù)，計算細(xì)胞相對存活率。細(xì)胞相對存活率(%)=實驗組光密度值/對照組光密度值×100%。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)檢測 采用ELISA法。干預(yù)24 h，取細(xì)胞培養(yǎng)上清液用ELISA法測定VEGF水平。根據(jù)ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處各孔光密度值，用標(biāo)準(zhǔn)物濃度與光密度值的標(biāo)準(zhǔn)曲線直線回歸方程，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為VEGF的實際水平。實驗重復(fù)3次。

1.5 細(xì)胞遷移能力檢測 采用Transwell小室實驗。干預(yù)24 h，將Transwell小室置于24孔板，下室加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基800 μL，上室加含1%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基300 μL，含對數(shù)生長期的HeLa細(xì)胞2×105。培養(yǎng)48 h，將小室取出并用PBS清洗，對上室沒有穿過的細(xì)胞用濕棉簽輕輕擦掉，以100%結(jié)晶紫(無水甲醇配制)染色，在200倍顯微鏡下從小室的上、下、左、右、中共選取5個視野對穿膜細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.6 細(xì)胞內(nèi)p-NF-κB p65、COX-2及Caspase-1、Caspase-12蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting法。干預(yù)24 h，棄培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS沖洗3次，加入裂解液，4 ℃靜置30 min，12 000 r/min離心10 min，取上清，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量。總蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉60 min，隨后分別加入抗p-NF-κB p65抗體(1∶1 000)、抗t-NF-κB p65抗體(1∶1 000)作對照、抗COX-2抗體(1∶1 000)、抗Caspase-1抗體(1∶1 000)、抗Caspase-12抗體(1∶1 000)，4 ℃過夜，用TBST洗3次，10 min/次。將PVDF膜用發(fā)光試劑ECL顯色，暗室曝光到X線片上，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析結(jié)果。目的蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值，p-NF-κB p65蛋白相對表達(dá)量=p-NF-κB p65條帶灰度值/t-NF-κB p65條帶灰度值。實驗重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞相對存活率比較 干預(yù)24 h，正常對照組、NaHS組、NaHS+PDTC組、NaHS+NS-398組、PDTC組、NS-398組細(xì)胞相對存活率分別為(100±0.00)%、(132.64±6.39)%、(112.05±7.61)%、(113.16±5.95)%、(98.79±3.45)%、(99.61±6.75)%。與其他各組比較，NaHS組細(xì)胞相對存活率升高(P均<0.05)，PDTC組、NS-398組細(xì)胞相對存活率與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。

2.2 各組培養(yǎng)上清液VEGF水平比較 干預(yù)24 h，正常對照組、NaHS組、NaHS+PDTC組、NaHS+NS-398組、PDTC組、NS-398組培養(yǎng)上清液VEGF水平分別為(100.00±0.00)%、(193.84±8.43)%、(149.13±14.89)%、(138.16±6.52)%、(97.12±6.67)%、(98.97±10.10)%。與其他各組比較，NaHS組培養(yǎng)上清液VEGF水平升高(P均<0.05)，PDTC組、NS-398組培養(yǎng)上清液VEGF水平與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。

2.3 各組遷移能力比較 正常對照組、NaHS組、NaHS+PDTC組、干預(yù)24 h，NaHS+NS-398組、PDTC組、NS-398組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(9.33±3.06)、(44.33±8.33)、(23.00±2.65)、(27.67±3.21)、(11.67±3.51)、(8.33±5.86)個/視野。與其他各組比較，NaHS組穿膜細(xì)胞數(shù)增多(P均<0.05)，PDTC組、NS-398組穿膜細(xì)胞數(shù)與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。2.4 各組p-NF-κB p65、COX-2及Caspase-1、Caspase-12蛋白表達(dá)比較 見表1。

表1 各組p-NF-κB p65、COX-2及Caspase-1、Caspase-12蛋白表達(dá)比較

注：與NaHS組相比，△P<0.05。

3 討論

宮頸癌是嚴(yán)重危害女性健康的惡性腫瘤之一[12,13]。越來越多的研究表明，宮頸癌的發(fā)生發(fā)展是一個包括HPV感染和其他協(xié)同因素共同作用的復(fù)雜過程。某些信號分子、轉(zhuǎn)錄因子或者信號傳導(dǎo)通路的活性改變在宮頸癌的發(fā)病機(jī)制中可能發(fā)揮了重要作用[14,15]。因此，本研究在既往研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步探究宮頸癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)分子生物學(xué)機(jī)制，以期為預(yù)防及治療宮頸癌提供新的思路。

作為體內(nèi)重要信號分子之一，H2S擁有多種生物活性，包括促進(jìn)血管生成[16]、抗氧化[17]和抗炎癥反應(yīng)[18]等。內(nèi)源性H2S也參與多種腫瘤的病理生理過程[19～21]。我們在前期研究中證實，外源性H2S能夠作用于肝癌細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、減少腫瘤細(xì)胞凋亡、促進(jìn)新生血管形成及增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞遷移浸潤能力[10,11]。然而，目前關(guān)于H2S與宮頸癌發(fā)生發(fā)展之間的聯(lián)系仍無相關(guān)報道。本實驗首次證實了外源性H2S可以提高宮頸癌HeLa細(xì)胞存活率、減少其凋亡和促進(jìn)其遷移，還可以上調(diào)HeLa細(xì)胞VEGF的分泌水平。VEGF可以由多種腫瘤(如胃癌、肝癌、宮頸癌和肺癌等)細(xì)胞產(chǎn)生，是重要的促血管生成因子之一，能增加血管通透性，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，從而促進(jìn)新生血管形成[22,23]。因此，外源性H2S可能通過促進(jìn)新生血管形成從而提高宮頸癌細(xì)胞的血運(yùn)功能。以上研究結(jié)果與我們前期關(guān)于外源性H2S對肝癌細(xì)胞和膠質(zhì)瘤細(xì)胞等腫瘤細(xì)胞的生理功能影響的研究[10,11]結(jié)果一致。

NF-κB屬于Rel蛋白家族，該蛋白家族在哺乳動物體內(nèi)有5個成員：ReA(p65)、ReB、c-Rel、p105/p50(NF-κB1)和p100/p52(NF-κB2)，它們N末端的Rel同源結(jié)構(gòu)域含有使NF-κB形成同源或異源二聚體、核定位信號及識別DNA相應(yīng)位點(diǎn)的序列。相關(guān)研究指出，NF-κB在宮頸癌病變組織中表達(dá)升高，并且與宮頸癌的分化程度、侵襲轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)，提示NF-κB激活在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程中有重要作用[15,24]。Kuncharin等[1]在研究宮頸癌細(xì)胞系時發(fā)現(xiàn)，Notch信號通路相關(guān)信號分子可通過對NF-κB通路的激活，從而提高腫瘤細(xì)胞的增殖能力和抑制腫瘤細(xì)胞凋亡。COX又稱前列腺素類過氧化物合成酶，可催化花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素類物質(zhì)。COX-2在大多數(shù)組織中可被多種胞外刺激所誘導(dǎo)表達(dá)，從而成為炎癥過程中重要的誘導(dǎo)酶。多種腫瘤組織中的COX-2表達(dá)與腫瘤的進(jìn)展有關(guān)?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，與正常宮頸表皮組織相比，宮頸癌組織中的COX-2的表達(dá)明顯升高，并且與VEGF的表達(dá)水平呈正相關(guān)，而兩者的高表達(dá)與宮頸癌細(xì)胞的浸潤和侵襲密切聯(lián)系[2]。本研究測定細(xì)胞的NF-κB p65的磷酸化水平和COX-2的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)外源性H2S作用于HeLa細(xì)胞可以明顯促進(jìn)NF-κB p65的磷酸化，并且提高COX-2的表達(dá)水平。為了進(jìn)一步探究外源性H2S對HeLa細(xì)胞的上述生理作用的相關(guān)分子機(jī)制，本研究分別觀察PDTC(NF-κB通路抑制劑)和NS-398(COX-2通路抑制劑)對外源性H2S作用于HeLa細(xì)胞產(chǎn)生相關(guān)通路蛋白表達(dá)水平的影響以及保護(hù)HeLa細(xì)胞和促進(jìn)細(xì)胞新生血管形成作用的影響，發(fā)現(xiàn)PDTC能減少外源性H2S對NF-κB通路磷酸化蛋白的激活作用，而NS-398能降低外源性H2S對COX-2通路蛋白表達(dá)的促進(jìn)效應(yīng)。而且，PDTC和NS-398均可對抗外源性H2S對HeLa細(xì)胞的毒性保護(hù)、抗凋亡、促進(jìn)新生血管形成和促進(jìn)細(xì)胞遷移的作用。這提示，外源性H2S對HeLa細(xì)胞的相關(guān)生理功能可能與NF-κB信號通路和COX-2信號通路的激活有關(guān)。最為重要的是，本研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用NaHS與NS-398共處理HeLa細(xì)胞后，p-NF-κB p65的表達(dá)與NaHS組并無明顯差異；而NaHS和PDTC共處理HeLa細(xì)胞后，COX-2的表達(dá)水平與NaHS處理組相比則顯著下降。進(jìn)一步證實了COX-2是宮頸癌細(xì)胞中NF-κB信號通路的下游信號分子，抑制NF-κB信號通路活性可以明顯下調(diào)COX-2蛋白的表達(dá)，抑制COX-2表達(dá)對NF-κB信號通路表達(dá)則無明顯負(fù)反饋作用。而H2S可能是通過NF-κB信號通路調(diào)節(jié)COX-2的表達(dá)，從而對HeLa細(xì)胞發(fā)揮相關(guān)的生理功能。這與此前相關(guān)報道結(jié)果相一致[3～5]。

本研究以宮頸癌HeLa細(xì)胞為研究對象，首次證實了外源性H2S可以減少HeLa細(xì)胞毒性作用、提高細(xì)胞存活率、抗細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞的新生血管生成及細(xì)胞遷移。而且這些生理功能可能是通過NF-κB/COX-2信號通路的激活而實現(xiàn)；而阻斷該通路的激活則可以抑制H2S對HeLa細(xì)胞的上述生理作用。由于H2S是體內(nèi)重要的活性氣體分子，所以這可能是宮頸癌發(fā)病的重要生理機(jī)制之一。隨著分子生物學(xué)進(jìn)一步發(fā)展，H2S促進(jìn)子宮頸癌發(fā)生發(fā)展的生理機(jī)制將會更加明確，這將為臨床治療宮頸癌提供新的理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

[1] Kuncharin Y, Sangphech N, Kueanjinda P, et al. MAML1 regulates cell viability via the NF-κB pathway in cervical cancer cell lines[J]. Exp Cell Res, 2011,317(13):1830-1840.

[2] Hammes LS, Tekmal RR, Naud P, et al. Up-regulation of VEGF, c-fms and COX-2 expression correlates with severity of cervical cancer precursor (CIN) lesions and invasive disease[J]. Gynecol Oncol, 2008,110(3):445-451.

[3] Read MA, Whitley MZ, Williams AJ, et al. NF-kappa B and I kappa B alpha: an inducible regulatory system in endothelial activation[J]. J Exp Med, 1994,179(2):503-512.

[4] Karin M, Greten FR. NF-kappaB: linking inflammation and immunity to cancer development and progression[J]. Nat Rev Immunol, 2005,5(10):749-759.

[5] Vakkala M, Kahlos K, Lakari E, et al. Inducible nitric oxide synthase expression, apoptosis, and angiogenesis in in situ and invasive breast carcinomas[J]. Clin Cancer Res, 2000,6(6):2408-2416.

[6] Levine J, Ellis CJ, Furne JK, et al. Fecal hydrogen sulfide production in ulcerative colitis[J]. Am J Gastroenterol, 1998,93(1):83-87.

[7] Rose P, Moore PK, Ming SH, et al. Hydrogen sulfide protects colon cancer cells from chemopreventative agent beta-phenylethyl isothiocyanate induced apoptosis[J]. World J Gastroenterol, 2005,11(26):3990-3997.

[8] Pupo E, Pla AF, Avanzato D, et al. Hydrogen sulfide promotes calcium signals and migration in tumor-derived endothelial cells[J]. Free Radic Biol Med, 2011,51(9):1765-1773.

[9] Du SX, Xiao J, Guan F, et al. Predictive role of cerebrospinal fluid hydrogen sulfide in central nervous system leukemia[J]. Chin Med J (Engl), 2011,124(21):3450-3454.

[10] Zhen Y, Pan W, Hu F, et al. Exogenous hydrogen sulfide exerts proliferation/anti-apoptosis/angiogenesis/migration effects via amplifying the activation of NF-κB pathway in PLC/PRF/5 hepatoma cells[J]. Int J Oncol, 2015,46(5):2194-2204.

[11] Zhen Y, Zhang W, Liu C, et al. Exogenous hydrogen sulfide promotes C6 glioma cell growth through activation of the p38 MAPK/ERK1/2-COX-2 pathways[J]. Oncol Rep, 2015,34(5):2413-2422.

[12] Basu S, Mahajan A. Psoas muscle metastasis from cervical carcinoma: correlation and comparison of diagnostic features on FDG-PET/CT and diffusion-weighted MRI[J]. World J Radiol, 2014,6(4):125-129.

[13] De Bacco F, Luraghi P, Medico E, et al. Induction of MET by ionizing radiation and its role in radioresistance and invasive growth of cancer[J]. J Natl Cancer Inst, 2011,103(8):645-661.

[14] Du CX, Wang Y. Expression of P-Akt, NFkappaB and their correlation with human papillomavirus infection in cervical carcinoma[J]. Eur J Gynaecol Oncol, 2012,33(3):274-277.

[15] Li J, Jia H, Xie L, et al. Association of constitutive nuclear factor-kappaB activation with aggressive aspects and poor prognosis in cervical cancer[J]. Int J Gynecol Cancer, 2009,19(8):1421-1426.

[16] Papapetropoulos A, Pyriochou A, Altaany Z, et al. Hydrogen sulfide is an endogenous stimulator of angiogenesis[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2009,106(51):21972-21977.

[17] Kimura H. Hydrogen sulfide: from brain to gut[J]. Antioxid Redox Signal, 2010,12(9):1111-1123.

[18] Hegde A, Bhatia M. Hydrogen sulfide in inflammation: friend or foe[J]. Inflamm Allergy Drug Targets, 2011,10(2):118-122.

[19] Lechuga TJ, Zhang HH, Sheibani L, et al. Estrogen replacement therapy in ovariectomized nonpregnant ewes stimulates uterine artery hydrogen sulfide biosynthesis by selectively up-regulating cystathionine beta-synthase expression[J]. Endocrinology, 2015,156(6):2288-2298.

[20] You XJ， Xu C， Lu JQ，et al. Expression of cystathionine beta-synthase and cystathionine gamma-lyase in human pregnant myometrium and their roles in the control of uterine contractility[J]. PLoS One, 2011,6(8):e23788.

[21] Patel P， Vatish M， Heptinstall J, et al. The endogenous production of hydrogen sulphide in intrauterine tissues[J]. Reprod Biol Endocrinol, 2009(7):10.

[22] Ferrara N. Pathways mediating VEGF-independent tumor angiogenesis[J]. Cytokine Growth Factor Rev, 2010,21(1):21-26.

[23] Takahashi S. Vascular endothelial growth factor (VEGF), VEGF receptors and their inhibitors for antiangiogenic tumor therapy[J]. Biol Pharm Bull, 2011,34(12):1785-1788.

[24] Li J, Jia H, Xie L, et al. Association of constitutive nuclear factor-kappaB activation with aggressive aspects and poor prognosis in cervical cancer[J]. Int J Gynecol Cancer, 2009,19(8):1421-1426.

陳建國(E-mail:chenjianguo_gz@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.37.010

R737.33

A

1002-266X(2016)37-0031-04

2016-06-03)