齊海亮，宋鑫亮，齊科雷，李明珠，杜秀然，蘇宏偉，王鵬

(河北省胸科醫(yī)院，石家莊050041)

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食管鱗癌組織中miR-199a的表達(dá)變化及臨床意義

齊海亮，宋鑫亮，齊科雷，李明珠，杜秀然，蘇宏偉，王鵬

(河北省胸科醫(yī)院，石家莊050041)

目的 觀察miRNA-199a在食管鱗癌組織中的表達(dá)變化，并探討其臨床意義。方法 選取食管鱗癌患者56例，術(shù)中取食管鱗癌組織及癌旁正常組織。采用SYBR Green qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)食管鱗癌、癌旁正常組織中的miRNA-199a，并分析食管鱗癌組織中miRNA-199a表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果 食管鱗癌組織中miR-199a相對(duì)表達(dá)量為0.056±0.006，癌旁正常組織為0.082±0.004；兩者比較，P<0.01。食管鱗癌患者腫瘤分化程度低、TNM分期高及存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，癌組織miR-199a相對(duì)表達(dá)量減少(P均<0.05)；不同年齡、性別的食管鱗癌患者，癌組織miR-199a相對(duì)表達(dá)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均>0.05)。結(jié)論 miR-199a在食管鱗癌組織中表達(dá)下調(diào)，且與腫瘤分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，可能作為抑癌基因參與食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展。

食管鱗癌；微小核糖核酸-199a；腫瘤分化；TNM分期；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移

微小RNA(miRNA)是一類非編碼小分子RNA，能通過核酸序列的互補(bǔ)性結(jié)合到特定的靶mRNA上，并通過調(diào)節(jié)、翻譯或降解靶mRNA來(lái)調(diào)控基因表達(dá)，參與細(xì)胞的分化、增殖、凋亡等[1，2]。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA還可作為癌基因或抑癌基因，調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移[3]。miR-199a作為miRNA家族成員之一，其表達(dá)變化與肺癌、前列腺癌、胃癌、宮頸癌等多種腫瘤密切相關(guān)，但目前其在食管鱗癌組織中的表達(dá)變化鮮見報(bào)道。2014年9月～2015年6月，我們觀察了食管鱗癌組織中miRNA-199a的表達(dá)變化，并分析其與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取同期河北省胸科醫(yī)院實(shí)施手術(shù)切除的食管鱗癌患者56例，男36例，女20例；年齡39～77歲，中位年齡60歲；組織分化程度：高中分化23例，低分化33例；臨床分期：Ⅰ、Ⅱ期40例，Ⅲ、Ⅳ期16例；無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移32例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移24例；所有患者術(shù)前未行放療、化療及生物治療。術(shù)中取食管鱗癌組織及相應(yīng)癌旁正常組織(距癌組織邊緣>5 cm)，并且術(shù)后均經(jīng)組織病理學(xué)檢查明確診斷。

1.2 miR-199a檢測(cè)方法 取食管鱗癌組織及癌旁正常組織標(biāo)本，以TRIzol法提取組織總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度、純度和完整性。經(jīng)檢測(cè)所提取的總RNA無(wú)降解，標(biāo)本合格，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)體系20 μL，其中總RNA 1.5 μL、特異性莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄引物2 μL、RNA酶抑制劑1 μL、緩沖液4 μL、逆轉(zhuǎn)錄酶1 μL、10 mmol/L dNTP Mix 2 μL、DECP水8.5 μL。反應(yīng)條件：42 ℃ 60 min，25 ℃ 5 min，70 ℃ 5 min。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后產(chǎn)物cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?。使用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)miR-199a和內(nèi)參基因U6的引物序列，由中國(guó)北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。引物序列：miR-199a上游引物5′-ACACTCCAGCTGGGCCCAGTGTTCAGACTAC-3′，下游引物5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′；內(nèi)參U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。按照TaqMan PCR試劑盒說(shuō)明進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系20 μL，其中cDNA模板2 μL、上下游引物各0.6 μL、2×Taqman Universal Pcrmaster Mix 10.0 μL、DECP水6.8 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。每個(gè)樣本做3個(gè)復(fù)孔。記錄每個(gè)熒光反應(yīng)管中的熒光信號(hào)達(dá)到所設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)即Ct值，將原始數(shù)據(jù)取3次重復(fù)的平均值；以U6為內(nèi)參，進(jìn)行歸一化，使用定量PCR中的相對(duì)定量法，得出ΔCt。ΔCt=CtmiR-199a-CtU6，以2-ΔΔCt法計(jì)算miR-199a在組織中的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 食管鱗癌組織、癌旁正常組織中miR-199a表達(dá)比較 食管鱗癌組織中miR-199a相對(duì)表達(dá)量為0.056±0.006，癌旁正常組織為0.082±0.004。食管鱗癌組織中miR-199a的相對(duì)表達(dá)量明顯低于癌旁正常組織(t=-36.222，P<0.01)。

2.2 食管鱗癌組織中miR-199a表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 見表1。

表1 食管鱗癌組織中miR-199a表達(dá)與患者 臨床病理特征的關(guān)系±s)

3 討論

miRNA是一類非編碼小分子RNA，其主要功能是參與并調(diào)控基因表達(dá)，通過識(shí)別靶基因mRNA的3′端非翻譯區(qū)，抑制靶基因表達(dá)[4]。自從首個(gè)miRNA功能被確認(rèn)以來(lái)，miRNA已成為生命科學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。目前，已知的miRNA幾乎參與了所有的生物學(xué)過程，維系著生物正常基因表達(dá)和生理功能。如果miRNA表達(dá)出現(xiàn)異常，則可導(dǎo)致疾病的發(fā)生。近年研究發(fā)現(xiàn)，很多miRNA通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、遷移等生物過程，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程[5～8]。

miR-199a是位于人發(fā)動(dòng)蛋白2基因的16號(hào)內(nèi)含子，在許多疾病的病理生理過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。Xu等[9]研究發(fā)現(xiàn)，缺氧缺血性腦損傷大鼠腦組織中miR-199a表達(dá)下調(diào)。Rane等[10]通過熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)HIF-1α是miR-199a的靶基因，miR-199a在缺血缺氧時(shí)通過上調(diào)HIF-1α發(fā)揮腦保護(hù)作用。在腫瘤方面，miR-199a發(fā)揮著雙向調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，在肺癌中miR-199a負(fù)性調(diào)控原癌基因Met，隨后證實(shí)在前列腺癌中同樣存在這種負(fù)性調(diào)控。Hou等[11]報(bào)道，miR-199a能通過抑制腫瘤促進(jìn)因子PAK4的表達(dá)，從而阻斷PAK4/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路，進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞的增殖。同樣存在這種負(fù)性調(diào)控的腫瘤，還有骨肉瘤、卵巢癌、膀胱癌等。然而，Song等[12]報(bào)道，在胃癌組織中miR-199a表達(dá)明顯上調(diào)。Lee等[13]發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌組織中miR-199a表達(dá)顯著上調(diào)，并把反義miR-199a寡核苷酸轉(zhuǎn)染入宮頸癌細(xì)胞后，阻斷miR-199a的表達(dá)，則明顯抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。但是Pereira等[14]研究中選擇U6作為內(nèi)參，結(jié)果提示miR-199a在宮頸癌組織中表達(dá)顯著下調(diào)。根據(jù)以上研究結(jié)果我們分析，miR-199a在腫瘤組織或細(xì)胞的表達(dá)與調(diào)控作用或許受多種因素影響。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，食管鱗癌組織中miR-199a相對(duì)表達(dá)量明顯低于其相應(yīng)的癌旁組織，而且通過結(jié)合患者的臨床病理資料發(fā)現(xiàn)，miR-199a的表達(dá)與腫瘤分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，表現(xiàn)為組織分化程度越低、TNM分期越晚、出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，miR-199a表達(dá)降低更明顯，而與患者年齡、性別無(wú)明顯關(guān)聯(lián)。因此認(rèn)為，miR-199a在食管鱗癌組織中表達(dá)下調(diào)，可能引起某種促癌機(jī)制活化，導(dǎo)致食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移。但是，其發(fā)生機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，miR-199a在食管鱗癌組織中表達(dá)下調(diào)，隨著腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移其表達(dá)進(jìn)一步下調(diào)，可能作為抑癌基因參與食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展。

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