張琳，喻田，任思宏，黃建廷

(遵義醫(yī)學院，貴州省麻醉與器官保護基礎研究重點實驗室，貴州遵義563000)

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二氮嗪后處理對大鼠缺血再灌注損傷心肌線粒體蛋白質表達的影響

張琳，喻田，任思宏，黃建廷

(遵義醫(yī)學院，貴州省麻醉與器官保護基礎研究重點實驗室，貴州遵義563000)

目的 觀察二氮嗪(DZ)后處理對大鼠缺血/再灌注損傷心肌線粒體蛋白質表達的影響。方法 將18只雄性SD大鼠隨機分為3組各6只，麻醉后取心臟建立Langendorff離體心肌缺血/再灌注損傷模型；對照組僅持續(xù)灌注K-H液120 min，無缺血再灌注損傷；模型組、DZ組缺血前先灌注K-H液平衡20 min，灌注停跳液使全心缺血40 min后，模型組繼續(xù)灌注K-H液60 min，DZ組先予50 μmol/L二氮嗪5 min后灌注K-H液55 min。采用雙向差異凝膠電泳(2D-DIGE)、基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)技術檢測心肌線粒體中的蛋白質，記錄表達差異在1.5倍以上的蛋白質。結果 缺血再灌注末，與對照組相比，模型組、DZ組心肌線粒體中丙酮酸脫氫酶E1α亞基(PDHA1)、短鏈/支鏈脂酰輔酶A脫氫酶(ACADSB)、NADH脫氫酶Ⅰ10α亞基(NDUFA10)、rCG55630等蛋白質表達明顯上調；與模型組比較，DZ組NDUFA10、rCG55630等蛋白質表達明顯下調。結論 缺血/再灌注損傷可上調心肌線粒體蛋白質PDHA1、ACADSB、NDUFA10和rCG55630表達，二氮嗪后處理可能通過下調NDUFA10和rCG55630等蛋白表達從而減輕心肌缺血/再灌注損傷。

缺血性心臟??；心肌組織；再灌注損傷；線粒體；二氮嗪；蛋白組學

目前，缺血性心臟病發(fā)病率呈上升趨勢，嚴重影響人類的健康，而對缺血心肌進行再灌注治療過程中可能產(chǎn)生不可逆損傷。研究表明，缺血后處理(IPTC)能提高心肌對復灌前較長時間缺血的耐受性，因實施于缺血后，在臨床較缺血預處理更具應用價值。二氮嗪(DZ)是最常用的線粒體ATP敏感性鉀通道(mitoKATPC)特異性開放劑，本課題組前期研究證實其心臟保護作用顯著[1,2]。2013年1月～2014年1月，我們通過建立大鼠Langendorff離體心臟灌注模型，在離體心臟缺血后行DZ后處理，進行心肌線粒體差異表達蛋白研究?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 18只20周齡SPF級健康雄性SD大鼠(第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所醫(yī)學實驗動物中心)，體質量250～300 g。Ettan DALT six大型垂直電泳系統(tǒng)、IPGphor等電聚焦儀、Typhoon 9400掃描儀及Decyder 2D 6.0圖像分析軟件軟件(瑞典Amersham Biosciences公司)；DU730型核酸/蛋白分析儀、L-100XP超速離心機(美國Beckman公司)；Μltraflex Ⅲ TOF/TOF質譜儀(美國布魯克公司)；DZ、Nycodenz、Tris、甘氨酸、過硫酸胺(AP)、甲叉雙丙烯酰胺、SDS、TEMED(美國Sigma公司)；抗β-actin單克隆抗體(美國ABC公司)；抗Calnexin、Anti-Calnexin、HRP標記猴抗山羊IgG(美國Santa Cruz公司)；BCA蛋白定量試劑盒(江蘇碧云天公司)；PVDF膜購自美國Bio-Rad公司；脫脂奶粉購自武漢博士德公司。

1.2 方法

1.2.1 分組造模與干預處理 取雄性SD大鼠18只，隨機分為3組各6只；腹腔麻醉后，取心臟離體培養(yǎng)，建立Langendorff離體心臟灌注模型。對照組僅持續(xù)灌注K-H液120 min，無缺血再灌注損傷；模型組、DZ組缺血前先灌注K-H液平衡20 min，灌注4 ℃ ST.Thomas停跳液，使全心缺血40 min后，模型組繼續(xù)灌注K-H液60 min，DZ組先予50 μmol/L二氮嗪5 min后灌注K-H液55 min。

1.2.2 大鼠心肌線粒體分離與純化 剪取適量SD大鼠心肌組織至EP管，加入線粒體分離介質；冰浴剪碎，充分勻漿；4 ℃下1 500 g離心 10 min，取上清；4 ℃下10 000 g離心10 min，得到粗提線粒體。經(jīng)25% Nycodenz梯度分離后，4 ℃下100 000 g離心1 h。將線粒體層轉移至新的1.5 mL EP管，加入等體積線粒體分離液，充分混勻；4 ℃下10 000 g離心10 min，棄上清，沉淀洗滌備用。應用Western blot法檢測亞細胞器標志性蛋白，驗證線粒體的純度，以β-肌動蛋白(β-actin)、鈣聯(lián)蛋白(Calnexin)以及細胞色素C氧化酶亞單位Ⅳ(COX Ⅳ)分別作為質膜、內質網(wǎng)和線粒體內膜等亞細胞器結構純度驗證標志物。結果純化線粒體中β-actin和Calnexin含量極低，而COX Ⅳ含量較高，說明獲得純度較高線粒體。

1.2.3 心肌線粒體差異表達蛋白檢測 采用雙向差異凝膠電泳(2D-DIGE)、基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)技術。將純化的心肌線粒體蛋白樣品進行CyDye熒光標記，分別進行第一向等電聚焦(IEF)電泳和第二向SDS-PAGE的凝膠電泳。電泳后的2D-DIGE凝膠、深紫熒光染色凝膠經(jīng)掃描后，使用Image Quant軟件檢測熒光圖像，對信號最大強度值在60 000～90 000的圖像進行相對精確定量。最后，每張2 D凝膠的蛋白上樣量為150 μg，用3種不同波長的激光進行掃描得到Cy2、Cy3和Cy5標記的樣品圖像和合并差異圖像，應用DeCyder V6.0軟件對得到的熒光染色凝膠圖譜進行分析。從制備膠切取差異蛋白點膠粒，經(jīng)清洗、脫色、乙腈脫水、清洗、37 ℃ Trypsin酶解16 h等處理，制備質譜樣品，應用ΜltraflexⅢ質譜儀檢測分析，記錄表達差異在1.5倍以上的蛋白質。

2 結果

DeCyder 軟件在12張凝膠圖像檢測到(752±49)個點，經(jīng)分離鑒定后各組間表達差異在1.5倍以上的蛋白質為Spot 480(丙酮酸脫氫酶E1α亞基，PDHA1)、Spot 553(短鏈/支鏈脂酰輔酶A脫氫酶，ACADSB)、Spot 554(NADH脫氫酶Ⅰ 10α亞基，NDUFA10)和Spot 555(isoform CRA_a，rCG55630)。4個差異表達蛋白在各組內的豐度變化比例情況，見表1。

表1 差異表達蛋白在各組中的變化比例

3 討論

目前，IPTC在心肌保護中作用機制的研究主要包括內源性腺苷及其受體亞型[3～5]、NO/cGMP途徑[6，7]、mitoKATPC[6]、再灌注損傷補救酶(RISK)途徑[8～10]、抑制線粒體通透性轉換孔(mPTP)開放[11,12]。本研究通過建立雄性SD大鼠Langendorff離體心臟灌注模型，在離體心臟缺血后行DZ后處理，運用2D-DIGE、MALDI-TOF MS技術進行心肌線粒體差異表達蛋白研究。

由于線粒體對滲透壓相對敏感，當滲透壓在290～310 mOsm/L時，線粒體能夠維持其完整性。本研究參考Nycodenz不連續(xù)密度梯度離心法，并將離心條件由52 000 g離心90 min改為100 000 g離心60 min。隨后，我們通過Western blot法檢測亞細胞器標志性蛋白，驗證分離純化后的心肌線粒體純度。結果顯示，純化線粒體中β-actin和Calnexin含量極低，作為線粒體內膜標志物的COX Ⅳ含量較高，提示采用Nycodenz不連續(xù)密度梯度離心，可得到純度較高的線粒體。

mitoKATPC是由55 kDa內向K+通道蛋白和63 kD磺脲類受體蛋白組成的異源多聚體。DZ作為MitoKATPC特異性開放劑，可通過激活心肌內源性的保護機制對心肌缺血缺氧引起的損傷發(fā)揮保護作用[13，14]。心肌線粒體差異蛋白表達檢測顯示，與對照組比較，線粒體內PDHA1在模型組、DZ組表達增高。De Souza等[15]通過動物實驗發(fā)現(xiàn)，在犬充血性心力衰竭24 h時PDHA1表達上升，而在2周后PDHA1表達水平下降。據(jù)此推測,可能由于心臟能量供應不足而出現(xiàn)早期代償性反應。

ACADSB也稱為2-甲基丁酰輔酶A脫氫酶或2-甲基支鏈輔酶A脫氫酶，在細胞質中合成后經(jīng)轉運進入線粒體，參與短、支鏈氨基酸及脂肪酸的β氧化過程[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，模型組、DZ組ACADSB表達上調?？赡芤蛉毖陂g細胞內游離脂肪酸增加誘導ACADSB基因轉錄和翻譯水平增高，進而導致蛋白表達上調。

NDUFA10是線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ的亞基，進入線粒體磷酸化后與NADH結合影響復合體Ⅰ的活性[17]。Kim等[18]通過兔離體心臟研究發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注損傷后，線粒體NDUFA10表達升高，認為缺血再灌注損傷后，細胞內H+濃度增加、pH降低引起的應激可以上調NDUFA10的表達而起到保護線粒體的作用。本研究結果表明，與對照組相比，NDUFA10在模型組、DZ組表達有所增加，但DZ組低于模型組。可能因為缺血期間氧化磷酸化被抑制，ATP生成量減少，線粒體內H+產(chǎn)生增多導致pH下降,細胞內出現(xiàn)代謝性酸中毒而誘導NDUFA10的表達量增加。經(jīng)DZ處理后，離體心臟心肌線粒體膜鉀通道開放，K+進入線粒體內，激活呼吸鏈氧化磷酸化過程，使得ATP生成增加，H+-K+交換和H+-Na+交換加快，進而改善細胞內和線粒體內酸中毒狀況。

rCG55630是一個新的蛋白質序列，目前還沒有文獻報道其生理功能。通過比對NDUFA10與rCG55630的氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，后者比前者多20個氨基酸殘基。在第1～335位氨基酸殘基中，兩者之間僅有6個不同。rCG55630與NDUFA10可能為同一超家族的蛋白質，功能與NDUFA10類似。

通過本研究我們發(fā)現(xiàn)，PDHA1、ACADSB、NDUFA10和rCG55630在缺血再灌注早期表達上調，DZ后處理可抑制心肌缺血再灌注早期NDUFA10和rCG55630表達，從而減輕心肌缺血再灌注損傷，發(fā)揮保護心肌、改善心功能的作用。

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衛(wèi)生部衛(wèi)生行業(yè)科研專項基金項目(200802173)；貴州省科學技術基金項目(黔科合J字LKZ2010-25號)。

喻田(E-mail: zyyutian126@.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.38.010

R543

A

1002-266X(2016)38-0032-03

2016-07-15)