王圓,黃燕,楊丹英,姜虹

(1上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院,上海200011；2上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院)

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miRNA-21對脂多糖誘導大鼠心肌細胞增殖的影響及其機制探討

王圓1,黃燕1,楊丹英2,姜虹1

(1上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院,上海200011；2上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院)

目的 觀察微小RNA-21(miRNA-21)對脂多糖(LPS)誘導的大鼠心肌細胞增殖的影響，并探討其可能機制。方法 取大鼠心肌細胞H9C2，用LPS 10 μg/mL處理0、6、12 h，RT-PCR法檢測細胞miRNA-21表達。將對數(shù)生長期的H9C2細胞隨機分為4組，A組不處理，B組用LPS 10 μg/mL處理12 h；C、D組分別轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒(NCmiRNA片段)、miRNA-21抑制質(zhì)粒(miRNA-21 antagomiR)，培養(yǎng)48 h后再用LPS 10 μg/mL處理12 h。 采用CCK-8法檢測各組H9C2細胞增殖的OD值，Western blot法檢測H9C2細胞中Bax、Bcl-2蛋白，分光光度法檢測H9C2細胞中Caspase-3活性。結(jié)果 LPS處理0、6、12 h時，H9C2細胞miRNA-21相對表達量分別為1.05±0.03、12.95±0.08、19.62±0.12；與0 h時比較，6、12 h時H9C2細胞miRNA-21相對表達量升高(P均<0.01)。A、B、C、D組H9C2細胞增殖的OD值分別為1.08±0.03、0.71±0.03、0.70±0.01、0.85±0.02，A組﹥D組﹥B、C組，P均﹤0.01。與A組比較，B、C、D組H9C2細胞中Bax相對表達量增加、Bcl-2相對表達量降低(P均﹤0.01)；與B、C組比較，D組H9C2細胞中Bax相對表達量減少、Bcl-2相對表達量增加(P均﹤0.01)。B、C、D組H9C2細胞Caspase-3活性分別為1.13±0.08、1.10±0.14、0.57±0.06，D組H9C2細胞Caspase-3活性低于B、C組，P均﹤0.01。結(jié)論 LPS可致心肌細胞損害過程miRNA-21表達增加，抑制miRNA-21表達可減輕LPS對心肌細胞增殖的抑制作用；其機制為抑制miRNA-21表達可下調(diào)Bax蛋白、上調(diào)Bcl-2蛋白表達，抑制Caspase-3活性，從而減輕細胞凋亡。

微小核糖核酸21；脂多糖；心肌細胞；細胞增殖；凋亡相關蛋白；膿毒血癥；大鼠

膿毒血癥作為由各類致病微生物在體內(nèi)積聚導致機體出現(xiàn)炎性狀態(tài)的全身炎癥反應綜合征(SIRS)，若未進行及時治療則會出現(xiàn)多器官功能衰竭，危及生命，影響預后[1,2]。而心肌損傷是膿毒血癥及膿毒性休克時最危險的并發(fā)癥，嚴重影響心臟功能，其造成的難治性低血壓是膿毒血癥死亡的重要因素。因此，預防和治療心肌損傷成為膿毒血癥治療的重要組成部分[3]。微小RNA(miRNA)是一種存在于真核生物中長度約為22個核苷酸大小的非編碼單鏈小分子RNA，可特異性識別目的mRNA的3′非編碼區(qū)(3′UTR)并與之結(jié)合，從而降解目的mRNA或抑制翻譯，調(diào)節(jié)重要的細胞活動，參與眾多疾病的病理生理過程[4]。研究表明，miRNA廣泛參與人體生長發(fā)育、免疫應答及炎癥反應等生理過程，并且參與心血管疾病、腫瘤和感染等疾病調(diào)控過程[5～7]。miRNA-21已被證實參與缺血再灌注、心臟肥大等心臟疾病調(diào)控[8,9]。但是，目前涉及miRNA-21與膿毒血癥心肌損傷之間的研究甚少。2015年4月～2016年3月，我們觀察了miRNA-21對脂多糖(LPS)誘導的心肌細胞增殖的影響，并探討其可能的機制。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 大鼠胚胎心肌細胞 H9C2購自中國科學院上海細胞庫;DMEM、胎牛血清(FBS)、0.05%胰酶/乙二胺四乙酸(EDTA)、Hanks液均購自美國Gibco公司；TRIzol、Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑、焦碳酸二乙酯 (DEPC)水購自美國Invitrogen公司；miRNA-21抑制質(zhì)粒(miRNA-21 antagomiR)購自廣州瑞博公司；miScript Reverse Transcription Kit購自荷蘭Qiagen公司；PCR試劑盒購自美國Life公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自美國Pierce公司；酶標儀ECX800購自美國Bio-TEX公司；Bax、Bcl-2、Caspase-3檢測試劑盒購自南京凱基公司；CCK-8細胞計數(shù)試劑盒購自日本同仁化學研究所；其他試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將H9C2細胞置于含10%FBS的DMEM(高糖)培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。當細胞鋪滿培養(yǎng)皿時，用1～2 mL PBS沖洗2遍；加1 mL胰酶消化1 min，再加含10%血清培養(yǎng)液終止消化。將細胞懸液移至15 mL離心管，500 g離心3 min；倒去上清，將細胞稀釋后按1∶3的比例分到新皿。

1.2.2 H9C2細胞miRNA-21檢測 取對數(shù)生長期的H9C2細胞，分別于LPS 10 μg/mL處理0、6、12 h時收集細胞，采用RT-PCR法檢測miRNA-21。按產(chǎn)品說明書用TRIzol裂解細胞，氯仿抽提細胞總RNA。逆轉(zhuǎn)錄反應合成模板cDNA，-20 ℃保存。以20 μL反應體系進行PCR，取2 μL逆轉(zhuǎn)錄反應產(chǎn)物分別與miR-21引物和內(nèi)參照U6引物進行反應。miR-21引物序列:上游5′-CCTGCCTGAGCACCTCGTGC-3′，下游5′-GACTGTGACGACTACCCCAA-3′；U6引物序列：上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。反應條件：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性20 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)40次。在ABI 7300 PCR System上操作反應，采用2-ΔΔCt法計算目的基因與內(nèi)參照的比值，以此表示目的基因相對表達量。

1.2.3 H9C2細胞增殖活性觀察 采用CCK-8法。將細胞制成單細胞懸液，以1×105/孔接種至6孔板。當細胞生長融合達60%～70%后，隨機分為4組。A組不處理，B組用LPS 10 μg/mL處理12 h；C、D組分別以Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒(NCmiRNA片段)、miRNA-21抑制質(zhì)粒(miRNA-21 antagomiR)，在37 ℃，5%CO2的孵箱中培養(yǎng)48 h后再用LPS 10 μg/mL處理12 h。 每孔加CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用酶標儀測490 nm的光密度(OD)值。

1.2.4 H9C2細胞Bax、Bcl-2蛋白檢測 采用Western blot法。取1.2.3中各組細胞，用含有10%磷酸酶抑制劑和1%苯甲基磺酰氟(PMSF)的細胞裂解液裂解細胞。用BCA蛋白濃度檢測試劑盒進行蛋白定量，15%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，并將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。用5%牛血清白蛋白(BSA)室溫下封閉4 h，4 ℃孵育一抗Bax、Bcl-2、GAPDH過夜。TBST洗滌3次，每次15 min。室溫下孵育二抗1～2 h，TBST洗滌3次，每次15 min。Image Quant LAS4000mini顯影，以目的蛋白與GAPDH蛋白條帶OD比值表示目的蛋白相對表達量。

1.2.5 H9C2細胞Caspase-3活性測定 采用分光光度法。取1.2.3中各組細胞，用胰酶消化；4 ℃下2 000 g離心5 min，收集細胞；吸除上清，PBS洗滌1次。吸盡上清后，按照每2×107個細胞加入100 μL裂解液的比例加入裂解液，重懸沉淀，冰浴裂解15 min。4 ℃下16 000 g離心15 min，把上清轉(zhuǎn)移到冰浴預冷的離心管中。按照試劑盒的說明檢測Caspase-3活性。在酶標儀上測定波長在405 nm處的OD405值，以各組與A組OD比值表示Caspase-3活性。

2 結(jié)果

2.1 LPS對H9C2細胞miRNA-21表達的影響 LPS處理0、6、12 h時，H9C2細胞miRNA-21相對表達量分別為1.05±0.03、12.95±0.08、19.62±0.12；與0 h時比較，6、12 h時H9C2細胞miRNA-21相對表達量均升高(P均<0.01)。

2.2 抑制miRNA-21表達對LPS誘導H9C2細胞增殖的影響 A、B、C、D組H9C2細胞增殖的OD值分別為1.08±0.03、0.71±0.03、0.70±0.01、0.85±0.02，A組﹥D組﹥B、C組，P均﹤0.01。

2.3 抑制miRNA-21表達對LPS誘導H9C2細胞Bax、Bcl-2表達的影響 結(jié)果顯示，LPS能夠顯著上調(diào)Bax表達，并下調(diào) Bcl-2表達；miRNA-21抑制劑顯著下調(diào)Bax表達，并上調(diào)Bcl-2表達。見表1。

表1 各組H9C2細胞Bax、Bcl-2蛋白 相對表達量比較±s)

注：與A組比較，*P均﹤0.01；與D組比較，#P均﹤0.01。

2.4 抑制miRNA-21表達對LPS誘導H9C2細胞Caspase-3活性的影響 結(jié)果顯示，B、C、D組H9C2細胞Caspase-3活性分別為1.13±0.08、1.10±0.14、0.57±0.06,D組H9C2細胞Caspase-3活性性低于B、C組，P均﹤0.01。

3 討論

在重癥監(jiān)護室中，心肌損傷目前已經(jīng)成為膿毒血癥死亡的最主要原因[10]。在膿毒癥發(fā)生過程中，LPS被公認是一種致病因子。在LPS引起的心肌損害中，主要表現(xiàn)為細胞壞死和細胞凋亡兩種形式。其中，細胞凋亡發(fā)生較早，是早期心肌細胞損傷的主要形式；抑制心肌細胞凋亡，將有助于改善心肌損害、恢復心臟功能[11]。

miRNA參與人類細胞30%～40%基因表達的調(diào)節(jié)，其可與靶基因mRNA互補結(jié)合，通過促進目的基因mRNA降解或抑制其翻譯而負性調(diào)節(jié)靶基因表達，是基因表達調(diào)控的一個重要環(huán)節(jié)[12]。近期研究顯示，miRNA-21在多種缺血缺氧性心血管疾病(如冠心病、心肌梗死等)中表達異常，并在疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[9]。目前，miRNA-21被認為是一種能發(fā)揮抗凋亡作用的miRNA，在多種腫瘤細胞及過氧化氫所致心肌細胞氧化損傷中均表現(xiàn)出明顯的抗凋亡效應[6, 13]。Cheng等[8]在缺血再灌注細胞模型中證實，降低miRNA-21表達水平可減少心肌細胞凋亡。本研究對體外培養(yǎng)的心肌細胞H9C2給予LPS刺激，結(jié)果顯示刺激6、24 h時細胞miRNA-21表達均明顯上升，提示miRNA-21可能參與膿毒血癥所致的心肌細胞損害過程。

細胞凋亡是基因控制的細胞自主性死亡過程，它是在基因調(diào)控下的一個嚴密完整的程序過程。其中，Caspase家族在凋亡過程中起到非常重要的作用，是細胞形態(tài)學和生物學改變的關鍵執(zhí)行者[14]。在本實驗中，LPS刺激24 h后心肌細胞增殖能力降低，預先轉(zhuǎn)染miRNA-21抑制劑可明顯提高細胞增殖活性。Western blot法檢測結(jié)果顯示， LPS刺激24 h后心肌細胞凋亡蛋白Bax表達升高，抑制凋亡蛋白Bcl-2表達下降；預先轉(zhuǎn)染miRNA-21較LPS刺激組及陰性對照組可使凋亡蛋白Bax表達顯著下降，抑制凋亡蛋白Bcl-2表達顯著上升。Caspase-3的活性實驗亦證明如此，進一步說明miRNA-21參與LPS所致心肌細胞損害過程。其機制可能是通過轉(zhuǎn)染miRNA- 21抑制劑降低miRNA-21水平，從而抑制LPS所致的細胞凋亡，從而增加細胞增殖活力。

本研究加深了對LPS所致心肌細胞損傷機制的了解，然而，miRNA-21作為重要的調(diào)節(jié)因子，在機體嚴重膿毒血癥心肌損害中是否發(fā)揮保護作用，仍有待進一步深入探索。

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上海交通大學醫(yī)學院課題項目(JY2011A10)；上海市長寧區(qū)衛(wèi)生局資助項目(20104Y01001)。

姜虹(E-mail: 17897562@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.38.009

R459.7

A

1002-266X(2016)38-0029-03

2016-05-18)