鄭鵬飛，巫相宏，黃文，馬國(guó)添，閉奇

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530021)

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·基礎(chǔ)研究·

鹽酸法舒地爾對(duì)大鼠心肌損傷組織中Cx43表達(dá)的影響

鄭鵬飛，巫相宏，黃文，馬國(guó)添，閉奇

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530021)

目的 觀察鹽酸法舒地爾(HF)對(duì)大鼠心肌損傷組織中縫隙連接蛋白43(Cx43)表達(dá)的影響，探討其保護(hù)心肌組織的機(jī)制。方法 將24只SD大鼠隨機(jī)分成空白組、脂多糖(LPS)組、LPS+HF組各8只。LPS+HF組腹腔注射HF 30 mg/kg預(yù)處理0.5 h后，尾靜脈注射LPS 1 mg/kg；LPS組腹腔注射HF等量生理鹽水預(yù)處理0.5 h后，尾靜脈注射LPS 1 mg/kg；空白組腹腔注射HF等量生理鹽水預(yù)處理0.5 h后,尾靜脈注射LPS 等量生理鹽水。尾靜脈注射后6 h處死大鼠，取左心室心肌組織，分別采用Western blot法、熒光定量PCR法檢測(cè)心肌組織中的RhoA/ROCK信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白R(shí)OCK1、Cx43 蛋白及mRNA。結(jié)果 與空白組比較，LPS組ROCK1 mRNA及蛋白表達(dá)增加(P均<0.01)，Cx43 mRNA及蛋白表達(dá)降低(P均<0.01)；與LPS組比較，LPS+HF組ROCK1 mRNA及蛋白的表達(dá)下降(P均<0.01)，Cx43 mRNA及蛋白表達(dá)增加(P均<0.01)。結(jié)論 鹽酸法舒地爾通過(guò)RhoA/ROCK信號(hào)通路調(diào)節(jié)心肌組織中Cx43的表達(dá)，從而減輕LPS誘導(dǎo)的心肌損傷。

心肌損傷；脂多糖；法舒地爾；Rho信號(hào)通路；ROCK1蛋白；縫隙連接蛋白43；大鼠

細(xì)胞縫隙連接是心肌細(xì)胞間的電連接形式，調(diào)控細(xì)胞新陳代謝、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、增殖和分化等生理過(guò)程?？p隙連接蛋白43(Cx43)是構(gòu)成心室間隙連接的主要結(jié)構(gòu)蛋白，是心肌細(xì)胞間進(jìn)行小分子量物質(zhì)通訊和電傳導(dǎo)的基礎(chǔ)，其正常表達(dá)和分布是心臟正常電生理活動(dòng)和協(xié)調(diào)舒縮的重要保證[1]。已有報(bào)道，Cx43參與了急慢性心肌缺血、心力衰竭、心律失常等疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[2]。研究指出，RhoA/ROCK通路在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起關(guān)鍵作用[3]，ROCK1是該通路的關(guān)鍵酶。鹽酸法舒地爾(HF)是惟一種應(yīng)用在臨床上的Rho激酶抑制劑。已有報(bào)道，HF可能阻止和逆轉(zhuǎn)肺動(dòng)脈高壓、右心室肥大、心肌細(xì)胞損傷的發(fā)展[4]。然而，HF改善心肌功能障礙的作用機(jī)制尚不清楚。2015年3～12月，本實(shí)驗(yàn)采用脂多糖(LPS)誘導(dǎo)SD大鼠的急性心肌損傷模型來(lái)探討HF的治療機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 SD大鼠，雄性，5周齡，體質(zhì)量250 g，購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。LPS(美國(guó)Sigma公司)，HF(山西普德藥業(yè)股份有限公司)；羊抗兔熒光二抗(美國(guó)Licor 公司)，兔抗鼠ROCK1抗體(英國(guó)Abcam公司)，兔抗鼠Cx43抗體及(SAB公司)，兔抗鼠GAPDH抗體(Cell Signaling Technology 公司)；BCA檢測(cè)試劑盒(中國(guó)碧云天公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq PCR Master Mix ki(Takara 公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組造模與干預(yù)處理 24只SD大鼠隨機(jī)分成3組：空白組、LPS組、LPS+HF組。LPS+HF組腹腔注射HF 30 mg/kg預(yù)處理0.5 h后，尾靜脈注射LPS 1 mg/kg；LPS組腹腔注射HF等量生理鹽水預(yù)處理0.5 h后，尾靜脈注射LPS 1 mg/kg；空白組腹腔注射HF等量生理鹽水預(yù)處理0.5 h后,尾靜脈注射LPS 等量生理鹽水。

1.2.2 心肌組織取材 尾靜脈注射后6 h，大鼠行腹腔麻醉；取左心室組織，以PBS洗凈，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 心肌組織ROCK1、Cx43蛋白檢測(cè) 采用Western blot 法。低溫下將心肌組織剪碎，加入RIPA裂解液(含蛋白酶抑制劑 PMSF)快速勻漿，裂解；離心提取組織總蛋白，BCA 法檢測(cè)蛋白濃度，100 ℃ 變性 5 min。每孔30 μg蛋白行 SDS-PAGE 電泳，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，洗膜 3×5 min；5%脫脂奶粉室溫封閉 1 h，洗膜 3×5 min；一抗 4 ℃孵育過(guò)夜(ROCK1抗體，1∶1 000；Cx43抗體，1∶500)，洗膜 3×5 min；熒光二抗(1∶10 000)室溫下避光孵育 1 h。使用Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)掃描，并以目的蛋白與內(nèi)參 GAPDH灰度比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.4 心肌組織ROCK1、Cx43 mRNA檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PRC法。TRIzol法提取心肌組織總RNA，分光光度計(jì)測(cè)定RNA的總濃度。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，應(yīng)用ABI Prism Step One序列檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行PCR擴(kuò)增(反應(yīng)體系20 μL)。95 ℃預(yù)變性30 s后進(jìn)行PCR反應(yīng)，95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s,共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。引物序列：Cx43上游引物5′-GCTCCACTCTCGCCTATGTC-3′，下游引物5′-TAGTTCGCCCAGTTTTGCTC-3′；ROCK1上游引物5′-AAGAGAGTGATATTGAGCAGTTGCG-3′，下游引物5′-TTCCTCTATTTGGTACAGAAAGCCA-3′；GAPDH上游引物5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游引物5′-CAAAGAGGGTGGAGAGCAAG-3′。用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量，每個(gè)樣品通過(guò)管家基因GAPDH作為內(nèi)參使目標(biāo)基因標(biāo)準(zhǔn)化。

2 結(jié)果

2.1 各組心肌組織中ROCK1、Cx43蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 與空白組比較，LPS組中ROCK1蛋白表達(dá)顯著上升(P<0.01)，Cx43蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.01)；與LPS組比較，LPS+HF組ROCK1蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.01)，Cx43蛋白表達(dá)顯著上升(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 各組心肌組織中ROCK1、Cx43蛋白 相對(duì)表達(dá)量比較±s)

注：與空白組比較，*P<0.01；與LPS組比較，#P<0.01。

2.2 各組心肌組織中ROCK1、Cx43 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 與空白組比較，LPS組ROCK1 mRNA表達(dá)顯著上升(P<0.01)，Cx43 mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.01)；與LPS組比較，LPS+HF組ROCK1 mRNA的表達(dá)顯著下降(P<0.01)，Cx43 mRNA表達(dá)顯著上升(P<0.01)。見(jiàn)表2。

3 討論

近年來(lái)，心血管疾病已經(jīng)成為影響人類健康的重要因素之一,動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗死及心力衰竭等都能導(dǎo)致心肌功能障礙、心肌收縮不良、心室重構(gòu)及各種心律失常。大量的實(shí)驗(yàn)和臨床研究指出，RhoA/ROCK通路在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起關(guān)鍵作用。RhoA/ROCK參與了血管平滑肌細(xì)胞的收縮、內(nèi)皮功能障礙、炎癥細(xì)胞的聚集和血管重構(gòu)及心室重構(gòu)等過(guò)程[3]。

表2 各組心肌組織中ROCK1、Cx43 mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較±s)

注：與空白組比較，*P<0.01；與LPS組比較，#P<0.01。

HF是目前惟一一種應(yīng)用在臨床上的Rho激酶特異性抑制劑，為一種新型異喹啉磺胺衍生物，可以通過(guò)與 ATP競(jìng)爭(zhēng)Rho激酶催化區(qū)的 ATP結(jié)合位點(diǎn)而阻斷Rho激酶的活性，同時(shí)亦可以抑制ROCK1 mRNA及蛋白的表達(dá)[5，6]。在臨床上，HF對(duì)血管痙攣性心絞痛[7]、穩(wěn)定型勞力性心絞痛[8]等患者有著顯著的療效。研究指出，Rho激酶活化增加有助于肥胖引起的心臟功能障礙和胰島素抵抗[9]。Rho激酶的表達(dá)和活性升高有助于糖尿病心肌病的發(fā)展[10]；RhoA/ROCK通路有助于缺血性損傷或持續(xù)性應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌重塑，從而導(dǎo)致心功能失代償性心力衰竭[11]。HF可以通過(guò)抑制ROCK1的表達(dá)而明顯改善心肌收縮功能，減少心肌纖維化[12]。目前，Rho激酶通路已經(jīng)成為治療心血管疾病的一個(gè)新靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)采用LPS誘導(dǎo)SD大鼠的急性心肌損傷模型來(lái)探討HF改善心肌功能障礙的作用機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LPS處理SD大鼠6 h后，其心肌組織中ROCK1的表達(dá)水平顯著上升，HF可以降低ROCK1的表達(dá)水平，可見(jiàn)，HF通過(guò)抑制Rho信號(hào)通路而發(fā)揮作用。研究指出，在肺靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞中，與Cx43調(diào)節(jié)主要相關(guān)的通路是RhoA/ROCK信號(hào)通路而不是PKC信號(hào)通路,ROCK1參與對(duì)Cx43的調(diào)節(jié)[13]。而在心肌細(xì)胞中，HF是否通過(guò)Rho信號(hào)通路調(diào)節(jié)Cx43的表達(dá)，這一機(jī)制尚不清楚。

縫隙連接介導(dǎo)的心肌細(xì)胞間通訊在心肌功能障礙發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起關(guān)鍵作用，心肌細(xì)胞間信息的正常傳遞主要通過(guò)縫隙連接來(lái)實(shí)現(xiàn)。正常心肌細(xì)胞Cx43主要表達(dá)于相鄰細(xì)胞的連接處及閏盤部位。Cx43是心室肌細(xì)胞縫隙連接的主要結(jié)構(gòu)蛋白和心肌電生理的主要決定因素，是心肌細(xì)胞間進(jìn)行小分子量物質(zhì)通訊和電傳導(dǎo)的基礎(chǔ)。其表達(dá)正常和分布是心臟正常電活動(dòng)維持和舒縮功能協(xié)調(diào)的必要條件[1]。研究指出，破壞心肌細(xì)胞間正常分布的Cx43，能增加室性心律失常和猝死的發(fā)生[14]；折返性心律失常及慢性肥厚心臟傳導(dǎo)異常，與Cx43的表達(dá)降低有關(guān)[15]；心室肌細(xì)胞中Cx43的下調(diào)和重新分布，有助于心室結(jié)構(gòu)重塑及左心室纖維化的發(fā)生[16]；心肌缺血或者慢性肥厚的心室肌細(xì)胞中，Cx43表達(dá)降低[17]。缺氧可下調(diào)乳鼠心肌細(xì)胞Cx43表達(dá)量，導(dǎo)致心肌細(xì)胞縫隙連接重構(gòu)，誘發(fā)惡性心律失常[18]。研究指出，LPS損傷心肌細(xì)胞后，心肌細(xì)胞中的Cx43表達(dá)會(huì)顯著降低，從而影響心肌細(xì)胞正常功能的發(fā)揮[19]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在LPS作用SD大鼠6 h后，心肌組織中Cx43的表達(dá)顯著降低，而HF預(yù)處理0.5 h可以干預(yù)上述結(jié)果。因此，我們認(rèn)為HF通過(guò)Rho信號(hào)通路調(diào)節(jié)損傷的心肌組織中Cx43表達(dá)，從而改善心肌功能障礙。

[1] Schulz R, G?rge PM, G?rbe A, et al. Connexin 43 is an emerging therapeutic target in ischemia/reperfusion injury,cardioprotection and neuroprotection[J]. Pharmacol Ther, 2015,153(2):90-106.

[2] Wu W, Li Y, Lu Z, et al. Increased susceptibility to ischemia-induced ventricular tachyarrhythmias in depressed rats: Involvement of reduction of connexin 43[J]. Exp Ther Med, 2012,3(2):192-194.

[3] Surma M, Wei L, Shi J, et al. Rho kinase as a therapeutic target in cardiovascular disease[J]. Future Cardiol, 2011,7(5):657-671.

[4] Sun XZ, Li SY, Tian XY, et al. Effect of fasudil on hypoxic pulmonary hypertension and right ventricular hypertrophy in rats[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2015,8(8):9517-9521.

[5] Shi J, Lei W. Rho kinases in cardiovascular physiology and pathophysiology: the effect of fasudil[J]. J Cardiovasc Pharmacol, 2013,62(4):341-354.

[6] Zhang J, Bian HJ, Li XX, et al. ERK-MAPK signaling opposes Rho-kinase to reduce cardiomyocyte apoptosis in Heart ischemic preconditioning[J]. Mol Med, 2010,16(7-8):307-315.

[7] Masumoto A, Mohri M, Shimokawa H, et al. Suppression of coronary artery spasm by the Rho-kinase inhibitor fasudil in patients with vasospastic angina[J].Circulation, 2002,105(13):1545-1547.

[8] Fukumoto Y, Mohri M, Inokuchi K, et al. Anti-ischemic effects of fasudil,a specific Rho-kinase inhibitor,in patients with stable effort angina[J]. J Cardiovasc Pharmacol, 2007,49(3):117-121.

[9] Soliman H, Nyamandi V, Garcia-Patino M, et al. Partial deletion of ROCK2 protects mice from high-fat diet-induced cardiac insulin resistance and contractile dysfunction[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2015,309(1):70-81.

[10] Waddingham MT, Edgley AJ, Astolfo A, et al. Chronic Rho-kinase inhibition improves left ventricular contractile dysfunction in early type-1 diabetes by increasing myosin cross-bridge extension[J]. Cardiovasc Diabetol, 2015,22(14):92-105.

[11] Wang N, Guan P, Zhang JP, et al. Fasudil hydrochloride hydrate, a Rho-kinase inhibitor, suppresses isoproterenol-induced heart failure in rats via JNK and ERK1/2 pathways[J]. J Cell Biochem, 2011,112(7):1920-1929.

[12] Mera C, Godoy I, Ramírez R, et al. Mechanisms of favorable effects of Rho kinase inhibition on myocardial remodeling and systolic function after experimental myocardial infarction in the rat[J]. Ther Adv Cardiovasc Dis, 2016,10(1):4-20.

[13] Zhang J, Yang GM, Zhu Y, et al. Role of connexin 43 in vascular hyperpermeability and the relationship to the Rock 1-MLC20 pathway in septic rats[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2015,309(11):1323-1332.

[14] Maruyama D, Hirata N, Tokinaga Y, et al. Nitrite reduces ischemia-induced ventricular arrhythmias by attenuating connexin 43 dephosphorylation in rats[J]. Anesth Analg, 2016,122(2):410-417 .

[15] Formigli L, Ibba-Manneschi L, Perna AM, et al. Altered Cx43 expression during myocardial adaptation to acute and chronic volume overloading[J]. Histol Histopatho, 2003,18(2):359-369.

[16] Quang KL, Maguy A, Qi XY, et al. Loss of cardiomyocyte integrin-linked kinase produces an arrhythmogenic cardiomyopathy in mice[J]. Circ Arrhythm Electrophysiol, 2015,8(4):921-932.

[17] Chanson M, Derouette JP, Roth I, et al. Gap junctional communication in tissue inflammation and repair[J]. Biochim Biophys Acta, 2005,1711(2):197-207.

[18] Zeevi-Levin N, Barac YD, Reisner Y, et al. Gap junctional remodeling by hypoxia in cultured neonatal rat ventricular myocytes[J]. Cardiovasc Res, 2005,66(1):64-73.

[19] Fernandez-Cobo M, Gingalewski C, Drujan D, et al. Downregulation of connexin 43 gene expression in rat heart during inflammation.The role of tumour necrosis factor[J]. Cytokine, 1999,11(3):216-224.

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81360057)。

巫相宏(E-mail： whw780@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.38.008

R966

A

1002-266X(2016)38-0026-03

2016-04-23)